Приведен подробный протокол методов дифференциального экспрессионного анализа для секвенирования РНК: limma, EdgeR, DESeq2.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Три метода дифференциального экспрессионного анализа для секвенирования РНК: limma, EdgeR, DESeq2
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Секвенирование РНК (RNA-seq) является одной из наиболее широко используемых технологий в транскриптомике, поскольку оно может выявить связь между генетическим изменением и сложными биологическими процессами и имеет большое значение в диагностике, прогностике и терапии опухолей. Дифференциальный анализ данных RNA-seq имеет решающее значение для выявления аберрантных транскрипций, а limma, EdgeR и DESeq2 являются эффективными инструментами для дифференциального анализа. Однако дифференциальный анализ RNA-seq требует определенных навыков владения языком R и умения выбирать соответствующий метод, чего не хватает в учебной программе медицинского образования.
Здесь мы предоставляем подробный протокол для идентификации дифференциально экспрессированных генов (DEG) между холангиокарциномой (CHOL) и нормальными тканями через limma, DESeq2 и EdgeR, соответственно, и результаты показаны на графиках вулканов и диаграммах Венна. Три протокола limma, DESeq2 и EdgeR похожи, но имеют разные этапы среди процессов анализа. Например, линейная модель используется для статистики в лимме, в то время как отрицательное биномиальное распределение используется в edgeR и DESeq2. Кроме того, нормализованные данные о количестве РНК-seq необходимы для EdgeR и limma, но не нужны для DESeq2.
Здесь мы предоставляем подробный протокол для трех методов дифференциального анализа: limma, EdgeR и DESeq2. Результаты применения трех методов частично перекрываются. Все три метода имеют свои преимущества, и выбор метода зависит только от данных.
Введение
РНК-секвенирование (RNA-seq) является одной из наиболее широко используемых технологий в транскриптомике со многими преимуществами (например, высокой воспроизводимостью данных) и значительно расширило наше понимание функций и динамики сложных биологических процессов1,2. Идентификация аберратных транскриптов в различных биологических контекстах, которые также известны как дифференциально экспрессированные гены (ДЭГ), является ключевым шагом в анализе РНК-seq. RNA-seq позволяет получить глубокое понимание молекулярных механизмов и биологических функций, связанных с патогенезом. Поэтому дифференциальный анализ бы....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Откройте программу R-studio и загрузите R файл "DEGs.R", файл можно получить из Дополнительных файлов/Скриптов.
1. Загрузка и предварительная обработка данных
- Загрузите данные о количестве высокопроизводительного секвенирования (HTSeq) холангиокарциномы (CHOL) из Атласа генома рака (TCGA). Этот шаг может быть легко достигнут с помощью следующего кода R.
- Нажмите кнопку Выполнить, чтобы установить пакеты R.
- Нажмите кнопку Выполнить, чтобы загрузить пакеты R.
if(!requireNamespace("BiocManager", quietly=TRUE))
+ install.packages("BiocManager")
BiocManager::insta....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Существуют различные подходы к визуализации результата дифференциального экспрессионного анализа, среди которых особенно используются график вулкана и диаграмма Венна. Лимма идентифицировала 3323 ДЭГ между CHOL и нормальными тканями с |logFC|≥2 и adj. P.Val <0,05 в качестве пороговых значений, среди которых 1880 были понижены в тканях CHOL и 1443 были отрегулированы(рисунок 1a). Между тем, edgeR идентифицировал 1578 пониженных ДЭГ и 3121 ДЭГ с пониженным регулированием
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Обильные аберратные транскрипты при раке могут быть легко идентифицированы с помощью дифференциального анализа RNA-seq5. Однако применение дифференциального экспрессивного анализа RNA-seq часто ограничено, поскольку оно требует определенных навыков владения языком R и способности выбирать соответствующие методы. Для решения этой проблемы мы предоставляем подробное введение в три наиболее известных метода (limma, EdgeR и DESeq2) и учебные пособия по применению дифференциального экспрессивного анали.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Рукопись не была опубликована ранее и не рассматривается для публикации в другом месте. Все авторы внесли свой вклад в создание этой рукописи для важного интеллектуального содержания и прочитали и одобрили окончательную рукопись. Мы заявляем, что конфликта интересов нет.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 81860276) и Ключевыми проектами Специального фонда Национальной ключевой программы НИОКР (грант No 2018YFC1003200).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| R | версия 3.6.2 | свободное программное обеспечение | |
| Rstudio | свободное программное обеспечение |
Ссылки
- Tambonis, T., Boareto, M., Leite, V. B. P. Differential Expression Analysis in RNA-seq Data Using a Geometric Approach. Journal of Computational Biology. 25, 1257-1265 (2018).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomic....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
