Мы представляем метод получения и характеристики органоидных культур слизистой оболочки полости рта, полученных из эпителия языка взрослых мышей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мы представляем метод получения и характеристики органоидных культур слизистой оболочки полости рта, полученных из эпителия языка взрослых мышей.
Слизистая оболочка, покрывающая внутреннюю часть рта, слизистая оболочка полости рта, представляет собой сильно разделенную ткань и может быть подразделена на слизистую оболочку щек, десну, губы, нёбо и язык. Его самый верхний слой, эпителий полости рта, поддерживается взрослыми стволовыми клетками на протяжении всей жизни. Пролиферация и дифференцировка эпителиальных стволовых клеток взрослого человека интенсивно изучалась с использованием мышиных моделей in vivo , а также двумерных (2D) фидерных клеток на основе моделей in vitro . В дополнение к этим методам используется органоидная технология, при которой взрослые стволовые клетки встраиваются в гидрогель, богатый внеклеточным матриксом (ВКМ), и получают питательную среду, содержащую определенный коктейль факторов роста. В этих условиях взрослые стволовые клетки размножаются и спонтанно образуют трехмерные (3D) клеточные кластеры, так называемые органоиды. Органоидные культуры первоначально были созданы из эпителиальных стволовых клеток тонкого кишечника мышей. Тем не менее, с тех пор метод был адаптирован для других типов эпителиальных стволовых клеток. В данной статье мы описываем протокол получения и определения характеристик органоидных культур слизистой оболочки полости рта мышей. Первичные эпителиальные клетки выделяют из ткани языка мышей, встраивают в гидрогель ECM и культивируют в среде, содержащей: эпидермальный фактор роста (EGF), R-спондин и фактор роста фибробластов (FGF) 10. В течение 7-14 дней после первоначального посева полученные органоиды могут быть пропущены для дальнейшей экспансии и криоконсервации. Кроме того, мы представляем стратегии для определения характеристик установленных органоидных культур с помощью 3D-визуализации и анализа экспрессии генов. Этот протокол может служить инструментом для исследования поведения стволовых клеток орального эпителия ex vivo в редукционистской манере.
Слизистая оболочка полости рта — это слизистая оболочка, покрывающая внутреннюю часть рта. Он функционирует как вход в пищеварительный тракт и участвует в инициировании пищеварительного процесса 1,2. Кроме того, слизистая оболочка полости рта выступает в качестве барьера нашего организма для внешней среды, обеспечивая защиту от физических, химических и биологических повреждений1. Исходя из функции и гистологии, слизистую оболочку полости рта у млекопитающих можно разделить на три типа: жевательная слизистая оболочка (включая твердое небо и десну), слизи....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все описанные здесь методы были выполнены в соответствии с законодательством Европейского Союза и Германии об экспериментах на животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте рабочее место, включая стерильные хирургические инструменты (тонкие щипцы, ножницы и скальпели) и чашки Петри, наполненные холодным ПБСО. Разморозьте BME на ночь и держите при температуре 4 °C или на льду до использования. Предварительно нагрейте планшеты для клеточных культур в инкубаторе на ночь перед началом изоляции клеток. Все материалы приведены в Таблице материалов.
1 Создание органоидной культуры сл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Этот протокол описывает отделение эпителия языка от нижележащей собственной пластинки и мышцы с помощью ферментативного коктейля (Рисунок 1). Отделенный эпителий в дальнейшем может быть использован для генерации органоидов, а также собран для различных типов анализов генов и белков. Кроме того, переваренный слой собственной пластинки и мышц может быть использован для процедур по выбору.
Для органоидных культур эпителий языка далее расщепляется на небольшие скоплен.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Переваривание тканей
Расщепление коллагеназы помогает отделить эпителий от подлежащей собственной пластинки и мышечной ткани. Этот шаг позволяет лучше сравнить первичную ткань с впоследствии сгенерированными органоидами слизистой оболочки полости рта. Поскольку переваривание ферментами влияет на органоидобразующую способность взрослых эпителиальных стволовых клеток, мы рекомендуем проводить инкубацию коллагеназы не более 1 часа, а расщепление трипсина не более 30 мину.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
К.К. назван изобретателем в патенте, который относится к технологии органоидов.
Авторы хотели бы поблагодарить Сабину Кранц за помощь. Мы хотели бы поблагодарить Основное подразделение по конфокальной микроскопии и сортировке клеток на основе проточной цитометрии IZKF Würzburg за поддержку этого исследования. Эта работа финансировалась за счет гранта от Немецкой организации по борьбе с раком (через IZKF/MSNZ Würzburg to K.K.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Media & Компоненты среды | |||
| Advanced Dulbecco' s Модифицированная среда Eagle (DMEM)/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634-028 | |
| B27 Дополнение | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| GlutaMAX-I (100x) | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | |
| N-ацетил-L-цистеин | Sigma Aldrich | A9165 | |
| Никотинамид | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Пенициллин/Стрептомицин | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm1 | |
| RSPO3-Fc гибридный белок кондиционированная среда | U-protein Express BV | R001 | |
| Рекомбинантный человеческий EGF | Preprotech | AF-100-15 | |
| Рекомбинантный человеческий FGF-10 | Preprotech | 100-26 | |
| ROCK (Rho киназа) ингибитор Y-27632 дигидрохлорид | Hö lzel Biotech | M1817 | |
| антитела | |||
| Keratin-14 Polyclonal Antibody 100µ l | Biozol | BLD-905301 | |
| Антитело к кадгерину | Bio-Techne | AF748 | |
| Очищенная мышь Anti-Ki-67 Клон B56 (0,1 мг) | BD Bioscience | 556003 | |
| ALEXA FLUOR 594 Donkey Anti Mouse | Thermo Fisher Scientific | A21203 | |
| ALEXA FLUOR 647 Donkey Anti Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
| ALEXA FLUOR 488 Donkey Anti Goat | Thermo Fisher Scientific | A110555 | |
| <сильные>реагенты / химикаты | |||
| BME Type 2, RGF Cultrex Pathclear | Bio-Techne | 3533-005-02 | |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Sigma Aldrich | 34943-1L-M | |
| Коллагеназа A | Roche | 10103578001 | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | S30-100ML | |
| Фосфат буферизованный физиологический раствор (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 100-100-15 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | 221465-25G | |
| Этанол, денатурированный (96 %) | Carl Roth | T171.3 | |
| Раствор формалина, нейтральный буферный, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4л | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| TrypLE Express Enzyme (1×), феноловый красный | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | |
| Xylene | Sigma Aldrich | 534056-500ML | |
| >Equipment and Others | |||
| Cell Culture 12-луночные многолуночные планшеты | Greiner BioOne | 392-0047 | |
| Сетчатый фильтр: 100 и микро; m | VWR | 732-2759 | |
| Защитные стекла | VWR | 631-1569P | |
| Микропластины со стеклянным дном VE=10 4580 | Corning | 13539050 | |
| Объективные слайды: Superfrost Plus | VWR | 631-0108P |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно