Здесь мы представляем усовершенствованные хирургические процедуры по успешному выполнению внутрипортальной трансплантации островков, клинически значимой, но технически сложной хирургической процедуры, у мышей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Минимизация постинфузионного портального венозного кровотечения во время внутрипеченочной трансплантации островков у мышей
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Хотя печень в настоящее время считается основным местом трансплантации островков человека в клинических условиях, островки пересаживаются под капсулу почки в большинстве доклинических исследований трансплантации островков грызунов. Эта модель обычно используется, потому что трансплантация внутрипеченочных островков мышей технически сложна, и высокий процент мышей может умереть от хирургических осложнений, особенно кровотечения из места инъекции после трансплантации. В этом исследовании демонстрируются две процедуры, которые могут свести к минимуму частоту постинфузионного портального венозного кровотечения. Первый метод применяет рассасывающуюся гемостатическую желатиновую губку к месту инъекции, а второй метод включает в себя проникновение иглы для инъекции островка сначала через жировую ткань, а затем в воротную вену, используя жировую ткань в качестве физического барьера для остановки кровотечения. Оба метода могут эффективно предотвратить смерть мыши, вызванную кровотечением. Был представлен весь участок печени, показывающий распределение островков и доказательства тромбоза островков после трансплантации, типичной особенности для внутрипеченочной трансплантации островков. Эти улучшенные протоколы совершенствуют процедуры внутрипеченочной трансплантации островков и могут помочь лабораториям установить процедуру для изучения выживаемости и функции островков в доклинических условиях.
Введение
Внутрипортальная трансплантация островков (ИИТ) через воротную вену является наиболее часто используемым методом трансплантации островков человека в клинических условиях. Мышиная модель ИИТ предлагает прекрасную возможность изучить трансплантацию островков и протестировать перспективные интервенционные подходы, которые могут повысить эффективность трансплантации островков1. ИИТ был впервые описан в 1970-х годах и использовался несколькими группами1,2,3,4,5. Он вновь обрел популярность после прорыва в трансплантации островков человека в 20006 году7. Тем не менее, большинство исследований по пересадке островков использовали капсулу почки в качестве предпочтительного места для экспериментальной трансплантации островков из-за ее легкого успеха. Напротив, ИИТ является более технически сложным и реже используется для исследований трансплантации островков8,9. Однако, в отличие от ИИТ, островки, пересаженные под почечную капсулу, не страдают от немедленной опосредованной кровью воспалительной реакции, характеризующейся тромбозом, воспалением и ишемией печеночной ткани, и, таким образом, имеют лучшую функцию, чем островки, пересаженные в печень. Таким образом, модель капсулы почки может не полностью имитировать стрессы, с которыми сталкиваются островки при трансплантации островков человека10,11,12.
Одним из основных осложнений ИИТ у мышей является кровотечение из места инъекции после трансплантации, которое может вызвать 10-30% смертности среди различных штаммов мышей12. В этой статье были разработаны два усовершенствованных подхода для более быстрой и безопасной остановки кровотечения и снижения смертности мышей после ИИТ. Визуальная демонстрация этих уточненных деталей поможет исследователям определить ключевые этапы этой технически сложной процедуры. Кроме того, расположение островковых трансплантатов в печени реципиента было определено гистологическим исследованием окрашенной гематоксилином и эозином (H&E) ткани печени (целый срез), несущей трансплантированные островки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры были проведены с одобрения институциональных комитетов по уходу за животными и их использованию в Медицинском университете Южной Каролины и Медицинском центре Ральфа Х. Джонсона в Чарльстоне.
1. Индукция диабета с использованием стрептозотоцина (СТЗ)
- Препарат для мышей-реципиентов:
- Взвешивайте всех мышей по отдельности.
- Проверьте уровень глюкозы в крови из образца крови хвостовой вены с помощью глюкометра.
- Определение дозы СТЗ для трех различных сценариев:
- Мышам с жировой болезнью печени вводят одну дозу СТЗ [40 мг/кг/сут, внутрибрюшинная (в.п.) инъекция] в течение 5 дней подряд.
- Для мышей NOD-SCID вводят 125 мг/кг STZ, однократную инъекцию, т.п. после ночного голодания.
- Для мышей C57BL/6 вводят 225 мг/кг СТЗ, однократная инъекция, т.п.
- Расчеты для СТЗ (13,5 мг/мл):
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот расчет предназначен для пяти мышей C57BL/6 с массой тела 30 г:- Общая масса тела: 5 мышей x 30 г/мышь = 150 г
- Требуется STZ: 150 г x 225 мг/1000 г STZ = 33,75 мг
- Подготовка к СТЗ:
- Взвесьте СТЗ после заранее рассчитанной дозы.
- Переложите взвешенный порошок STZ в стакан емкостью 10 мл на льду.
- Добавьте 3 мл раствора цитрата натрия в стакан для растворения СТЗ.
- Хорошо перемешать, процедить стерилизовать через поры 0,22 мкм и использовать раствор СТЗ в течение 10 мин после приготовления.
- СТЗ инъекции:
- Загрузите нужное количество раствора STZ (достаточное для одной мыши) в шприц объемом 1 мл.
- Выполняют внутрибрюшинную инъекцию в нижний правый квадрант живота мыши.
- Понаблюдайте за мышами в течение 5 минут после инъекции и проверьте наличие признаков дискомфорта в течение этого периода времени, прежде чем помещать их обратно в клетки.
- Контролируйте уровень глюкозы в крови из образца крови хвостовой вены с помощью глюкометра ежедневно после инъекции STZ.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте мыши считаются диабетиками, когда уровень глюкозы в крови без голодания составляет > 350 мг / дл в течение двух дней подряд.
2. Подготовка островков
ПРИМЕЧАНИЕ: Человеческие островки культивировали в среде CMRL-1066, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллином/стрептомицином (P/S) при плотности 10 000 островковых эквивалентов (IEQ) на 100 мм чашку для культивирования клеток9. Мышиные островки культивировали в DMEM с 10% FBS и 1% P/S с одинаковой плотностью13. Самцы мышей NOD-SCID и C57BL/7 в возрасте 6-10 недель были получены из коммерческих источников.
- Отделите культивируемые островки от чашки для клеточной культуры путем мягкого расчесывания.
- Вручную выберите желаемое количество островков (например, 300-350 островков) с помощью шприца объемом 1 куб. см и поместите их в стерильные микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл на льду.
- Вращайте трубку в течение 10 секунд с помощью микроцентрифуги.
- Удалите супернатант, оставив немного жидкости, чтобы избежать потери гранулы.
- Повторно суспендировать гранулы в 200 мкл HBSS с 0,5% бычьим сывороточным альбумином (BSA).
- Аспирировать повторно суспендированные островки в инсулиновый шприц объемом 0,5 мл.
- Поместите шприц в вертикальное положение. Дайте островкам опуститься вниз на 1 мин.
- Надавите на шприц, чтобы удалить все пузырьки, оставив около 100-150 мкл жидкости, содержащей островки.
- Положите головку шприца вниз и осторожно постучите по боковой стороне шприца, чтобы островки равномерно распределились по всей жидкости. Островки теперь готовы к инъекции.
3. Трансплантация островков
- Индуцировать и поддерживать мышь под общим наркозом с 2% изофлураном. Проверьте на отсутствие педальных рефлексов, чтобы обеспечить надлежащую анестезию животного.
- Сбрить и удалить шерсть в области брюшка мыши.
- Вводят однократную предоперационную дозу Бупренорфина (0,1 мг/кг в.п.).
- Продезинфицируйте хирургическую область тремя чередующимися салфетками 2% йода и 75% спирта.
- Выполните лапаротомию микроножами для создания разреза 1-1,5 см.
- Откройте брюшинную полость с помощью втягивающего устройства. Затем используйте либо метод A, либо метод B, как описано ниже.
4. Метод А: (остановить кровотечение с помощью гелевой пены, рисунок 1А)14,15,16
- Подготовка мыши
- Поместите стерильную марлю вокруг разреза.
- Аккуратно вытяните кишечник с помощью щипцов и держите его на марле.
- Определите вену портала по ее расположению и хорошо ее обнажите.
- Накрывайте кишечник теплой солено-влажной марлей в течение всей операции.
- Ввести островок предварительно загруженной инсулиновой шприцевой иглой через воротную вену возле двенадцатиперстной кишки (рисунок 1В). Для этого держите иглу с отверстием (скосом) лицом вниз и расположите угол поверхности отверстия параллельно стенке воротной жилы, прежде чем проникать через стену.
- Потяните поршень, чтобы втянуть немного крови (20-50 мкл) в шприц, чтобы сначала перемешать островки.
- Медленно вливайте островки в воротную вену, многократно вытягивая и толкая погружение.
- Поместите кусочек гелевой пены (размером около 0,5 см х 0,5 см), чтобы покрыть место инъекции.
- Прижмите гелевую пену ватным наконечником, вытащив иглу из воротной вены.
- Продолжайте нажимать на гель в течение примерно 2 минут, чтобы подтвердить, что нет активного кровотечения.
- Опрокидывайте хлопчатобумажный опрокидывание над и подальше от гелевой пены, чтобы убедиться, что гелевая пена хорошо покрывает воротную вену.
5. Метод Б: (остановить кровотечение с помощью жировой прокладки, рисунок 1С)17
- Тщательно обнажите воротную вену.
- Используйте два хлопковых наконечника, чтобы удерживать открытую воротную вену как с левой, так и с правой стороны.
- Определите подушечку жировой ткани между двенадцатиперстной кишкой и воротной веной.
- Проникните через жировую прокладку перед введением иглы в воротную вену (рисунок 1D).
- Вводят островки в соответствии с аналогичной процедурой, описанной выше в частях 4.2.1 и 4.2.2 Метода А.
- Вытащите иглу, надавливая на жир ватным наконечником.
- Продолжайте надавливать на жировую подушку в течение 1 мин после удаления иглы.
- Подтвердив, что кровотечения из воротной вены нет, осторожно верните кишечник в брюшинную полость в исходное положение.
- Оставьте 0,5 мл теплого физиологического раствора (36-37 °C) в брюшной полости перед закрытием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Теплый физиологический раствор облегчает послеоперационное движение кишечника и восстановление и предотвращает некроз кишечника. - Закройте мышечный слой швом 5-0.
- Закройте слой кожи швом 4-0.
- Поместите мышь в чистую клетку на грелку до полного восстановления после анестезии.
- Продолжайте принимать анальгетик (например, бупренорфин 0,1 мг/кг в.п.) каждые 12 ч и дополнительное тепло в течение 48 ч после операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура трансплантации островков занимает примерно 15-20 минут.
6. Окрашивание H&E и фотографирование всего отдела печени
- Перфузия печени
- Поместите мышь под наркоз, как описано выше в части 3.1.
- Осторожно обнажите воротную вену и срежьте нижнюю полую вену.
- Вручную перфузируйте печень, используя 20 мл 10% параформальдегида через воротную вену в течение примерно 5 минут, используя шприц 20 мл с иглой 25G18.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузия печени может удалить кровь из ткани печени и улучшить фиксацию печени, не нарушая островковые трансплантаты. - Рассекайте перфузированную всю печень от других органов.
- Фиксируют перфузированную ткань печени в 10% параформальдегиде в течение 24 ч.
- Встроить ткань в парафин.
- Вырежьте участки ткани толщиной 5 мкм каждый и положите их на стеклянную горку для окрашивания.
- Выполняют окрашивание H&E, инсулина, фибрина и полиморфноядерных нейтрофилов (PMN) стандартными методами15,16.
- Сканирование всего участка печени под микроскопом.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы выполнили сингенную и ксеногенную трансплантацию островков через воротную вену. Функция островкового трансплантата наблюдалась дозозависимым образом в обеих моделях трансплантации островков. В модели трансплантации сингенных островков с использованием мышей C57BL/6 трансплантация 250 островков привела к преходящей нормогликемии, прежде чем мыши вернулись к гипергликемии. Мыши, получавшие 500 островков, достигали и поддерживали нормогликемию более 30 дней после трансплантации (рисунок 2А)....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом исследовании были продемонстрированы две улучшенные процедуры, которые могут предотвратить кровотечение и могут снизить смертность мышей во время мышиного ИИТ. Это исследование позволяет ученым визуализировать модель трансплантации островков, которая является уникальной в изучении мгновенного воспалительного ответа, опосредованного кровью, после трансплантации. Модель ИИТ является отличительной моделью для изучения выживаемости островковых клеток и печеночных ишемических повреждений в ответ на трансплантацию
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Все авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано Департаментом по делам ветеранов (VA-ORD BLR & D Merit I01BX004536) и грантами Национального института здравоохранения No 1R01DK105183, DK120394, DK118529, для HW. Мы хотели бы поблагодарить Вас, г-н Майкл Ли и г-жа Линдси Сваби за редактирование языка
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10% нейтральный буферизованный формалин v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| 1 мл Шприц с иглой | AHS | AH01T | |
| 20 мл Шприц | BD | 301031 | |
| 25G x 5/8" иглы для подкожных инъекций | BD | 305122 | |
| Спиртовые прокладки, стерильные | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Анестезия для животных система | VetEquip, Inc. | ||
| Бупренорфина гидрохлорид, инъекция | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Центрифужные пробирки, 15 мл Fisher | Scientific | 0553859A | |
| CMRL-1066 | Corning | 15110CV | |
| DMEM | Corning | 10013CV | |
| Этанол, абсолютный (200 proof), класс молекулярной биологии | Fisher Scientific | ||
| Сверхтонкие микродиссекционные ножницы 4 дюйма прямые острые | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Corning | 35011CV | |
| FreeStyle Глюкометр | Abbott | Lite | |
| FreeStyle тест-полоски для определения уровня глюкозы в крови | Abbott | Lite | |
| Gelfoam (рассасывающаяся желатиновая губка, USP) | Фармация & Upjohn Company | 34201 | |
| Щипцы Graefe 4" экстра тонкий наконечник | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Подогреваемая прокладка | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Иглодержатель 5.25" | Робоз Хирургический Инструмент Ко. | RS-7850 | |
| Инсулиновый шприц с иглой 27-го калибра | BD | 879588 | |
| Прокладки для подготовки йода | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Изофлуран | пирамал Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Пенициллин/стрептомицин (P/S) | HyClone | SV30010 | |
| полипропиленовый шов 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Полипропиленовый шовный материал 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0,9% раствор внутривенно | VWR | 2B1322Q | |
| (STZ) | Sigma | S0130 | |
| Хирургическая простыня, стерильная | Med-Vet International | DR1826 | |
| Тканевая кассета | Fisher Scientific | 22-272416 |
Ссылки
- Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes. Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).
- Ballinger, W. F., Lacy, P. E. Transplantation of intact pancreatic islets in rats. Surgery. 72 (2), 175-186 (1972).
- Wright, J. R., Hauptfeld, V., Lacy, P. E., et al. Induction of Ia antigen expression on murine islet parenchymal cells does not diminish islet allograft survival. American Journal of Pathology. 134 (2), 237-242 (1989).
- Toyofuku, A., et al. Natural killer T-cells participate in rejection of islet allografts in the liver of mice. Diabetes. 55 (1), 34-39 (2006).
- Goss, J. A., Nakafusa, Y., Finke, E. H., Flye, M. W., Lacy, P. E. Induction of tolerance to islet xenografts in a concordant rat-to-mouse model. Diabetes. 43 (1), 16-23 (1994).
- Hara, M., et al. A mouse model for studying intrahepatic islet transplantation. Transplantation. 78 (4), 615-618 (2004).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Wang, J., et al. Alpha-1 antitrypsin enhances islet engraftment by suppression of instant blood-mediated inflammatory reaction. Diabetes. 66 (4), 970-980 (2017).
- Gou, W., et al. Alpha-1 antitrypsin suppresses macrophage activation and promotes islet graft survival after intrahepatic islet transplantation. American Journal of Transplantation. , (2020).
- Contreras, J. L., et al. Activated protein C preserves functional islet mass after intraportal transplantation: A novel link between endothelial cell activation, thrombosis, inflammation, and islet cell death. Diabetes. 53 (11), 2804-2814 (2004).
- Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. Lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
- Melzi, R., et al. Intrahepatic islet transplant in the mouse: functional and morphological characterization. Cell Transplantation. 17 (12), 1361-1370 (2008).
- Wang, H., et al. Donor treatment with carbon monoxide can yield islet allograft survival and tolerance. Diabetes. 54 (5), 1400-1406 (2005).
- Desai, C. S., et al. Effect of liver histopathology on islet cell engraftment in the model mimicking autologous islet cell transplantation. Islets. 9 (6), 140-149 (2017).
- Cui, W., Angsana, J., Wen, J., Chaikof, E. L. Liposomal formulations of thrombomodulin increase engraftment after intraportal islet transplantation. Cell Transplantation. 19 (11), 1359-1367 (2010).
- Cui, W., et al. Thrombomodulin improves early outcomes after intraportal islet transplantation. American Journal of Transplantation. 9 (6), 1308-1316 (2009).
- Proto, C., Grasso, G., Fassio, P. G. Hepatoparenchymal clearance of indocyanine green in infectious hepatitis. Giornale di Malattie Infettive e Parassitarie. 20 (9), 845-851 (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments. (132), e56993(2018).
- Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559(2018).
- Wang, H., et al. Autologous mesenchymal stem cell and islet cotransplantation: Safety and efficacy. Stem Cells Translational Medicine. 7 (1), 11-19 (2018).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
