Разработка 3D-организованной сердечной ткани человека в рамках микрофлюидной платформы

В последние годы широко изучены подходы к тканевой инженерии для сопровождения клинических результатов in vivo в регенеративной медицине и моделировании заболеваний^1,2. Значительное внимание было уделено моделированию сердечной ткани in vitro из-за присущих трудностей в поиске первичной сердечной ткани человека и производстве физиологически значимых суррогатов in vitro, ограничивая фундаментальное понимание сложных механизмов сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ)^1,3. Традиционные модели часто включали 2D-анализы монослойной культуры. Тем не менее, важность культивирования сердечных клеток в 3D-среде для имитации как нативного ландшафта миокарда, так и сложных клеточных взаимодействий была широко охарактеризована^4,5. Кроме того, большинство моделей, произведенных до сих пор, включали монокультуру КМ, дифференцированных от стволовых клеток. Тем не менее, сердце состоит из нескольких типов клеток⁶ в сложной 3D-архитектуре^7,что оправдывает критическую необходимость улучшения сложности состава тканей в рамках 3D-моделей in vitro для лучшей имитации клеточных компонентов нативного миокарда.

На сегодняшний день было изучено много различных подходов к созданию биомиметических 3D-моделей миокарда^8. Эти подходы варьируются от экспериментальных установок, которые позволяют в режиме реального времени рассчитывать генерируемую силу, от монокультурных КМ, посеянных на тонких пленках (считающихся мышечными тонкими пленками (MTF))^9,до совместной культивирования сердечных клеток в 3D-гидрогелевых матрицах, взвешенных среди отдельно стоящих кантилеверов (считающихся инженерными тканями сердца (ET))^10. Другие подходы были сосредоточены на реализации методов микроформования для имитации анизотропии миокарда, от монокультурных КМ в 3D-гидрогеле, суспендированном среди выступающих микропостов в тканевом^{пятне 11,}до монокультурных КМ, посеянных среди вдавленных микроплодов^12,13. Каждому из этих методов присущи ими преимущества и недостатки, поэтому уместно использовать технику, которая согласуется с предполагаемым применением и соответствующим биологическим вопросом.

Способность усиливать созревание КМ, полученных из стволовых клеток, имеет важное значение для успешной инженерии in vitro взрослой ткани миокарда и трансляции последующих результатов в клинические интерпретации. С этой целью методы зрелых КМ были широко исследованы, как в 2D, так и в 3D^14,15,16. Например, электрическая стимуляция, включенная в ЭХТ, принудительное выравнивание КМ с топографией поверхности, сигнальными сигналами, факторами роста от кокультуры и / или условиями 3D-гидрогеля и т. Д., Все это приводит к изменению в пользу созревания СМ по меньшей мере в одном из следующих: морфология клеток, обработка кальция, саркомерная структура, экспрессия генов или сократительная сила.

Из этих моделей подходы, использующие микрофлюидные платформы, сохраняют определенные преимущества в природе, такие как контроль градиентов, ограниченный ввод клеток и минимальные необходимые реагенты. Кроме того, многие биологические реплики могут быть сгенерированы одновременно с использованием микрофлюидных платформ, служащих для лучшего препарирования интересующего биологического механизма и увеличения размера экспериментальной выборки в пользу статистической мощности^17,18,19. Кроме того, использование фотолитографии в процессе изготовления микрофлюидных устройств позволяет создавать точные признаки (например, топографии) на микро- и наноуровне, которые служат мезоскопическими сигналами для улучшения окружающей клеточной структуры и архитектуры тканей на макроуровне^{18,20,21, 22} для различных применений в регенерации тканей и моделировании заболеваний.

Ранее мы продемонстрировали разработку новой 3D-модели сердечной ткани на чипе, которая включает топографию поверхности в виде врожденных эллиптических микропостов для выравнивания гидрогелево-инкапсулированных кокумулированных сердечных клеток во взаимосвязанную анисотропную ткань^20. После 14 дней культивирования ткани, образующиеся в микрофлюидном устройстве, являются более зрелыми по своему фенотипу, профилю экспрессии генов, характеристикам обработки кальция и фармацевтическому ответу по сравнению с монослойным и 3D-изотропным контролем^23. Протокол, описанный в настоящем описании, описывает способ создания этой 3D-совместно культивируемой, выровненной (т.е. анизотропной) сердечной ткани человека в микрофлюидном устройстве с использованием ХМ, полученных из hiPSC. В частности, мы объясняем способы дифференцировки и очистки hiPSC в сторону КМ, добавление hCF с КМ для получения установленной популяции кокультур, введение клеточной популяции, инкапсулированной в гидрогеле коллагена, в микрофлюидные устройства, и последующий анализ 3D-сконструированных тканей с помощью сократительных и иммунофлуоресцентных анализов. Полученные 3D-инженерные микроткани подходят для различных применений, включая фундаментальные биологические исследования, моделирование сердечно-сосудистых заболеваний и фармацевтические испытания.

Выполнять все обработки клеток и подготовку реагентов в шкафу биобезопасности. Убедитесь, что все поверхности, материалы и оборудование, которые вступают в контакт с клетками, стерильны (т. Е. Распыляйте 70% этанола). Клетки следует культивировали в увлажненный инкубатор при 37 °C, 5% CO_2. Вся культура и дифференциация hiPSC выполняется в 6-скважинных пластинах.

1. Создание микрофлюидного устройства (приблизительная продолжительность: 1 неделя)

1. фотолитография
   ПРИМЕЧАНИЕ: Маска, разработанная с использованием файла CAD (предоставляется в виде дополнительного файла 1),содержит конструкцию микрофлюидного канала. Распечатайте дизайн на прозрачной маске. Затем выполните стандартную фотолитографию с отрицательным фоторезистом SU8 2075 на 4-дюймовой кремниевой пластине в чистой комнате.
   1. Очистите кремниевую пластину изопропиловым спиртом (IPA) и высушите азотом. Выпекать при 200 °C в течение 5 мин для обезвоживания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обработайте пластину пинцезом.
   2. Поместите пластину в спин-коатер. Внесите 3-4 мл SU8 в центр пластины, затем вращайтесь, чтобы сформировать слой 200 мкм (т. Е. Нарастите до 15 с до 500 об/мин, открутите в течение 10 с, увеличь от 5 с до 1 200 об/мин и вращайтесь в течение 30 с, затем понижайте в течение 15 с, пока не остановитесь).
   3. Выньте и мягко запекайте в течение 7 мин при 65 °C, затем 45 мин при 95 °C.
   4. Переместите пластину в элайнер маски и поместите прозрачную маску в держатель маски с помощью УФ-фильтра. Подвергайте пластину 2 циклам по 230мДж/см2, с задержкой 30 с, при общей экспозиции 460 мДж/см2.
   5. Выполните выпекание после воздействия на открытой вафле в духовке с 50 °C в течение ночи.
   6. Выключите духовку на следующее утро, а после того, как вафля остынет до комнатной температуры, погружайте ее в SU8-разработчик. Снимайте пластину с разработчика каждые 5 минут и мойте с помощью IPA, а затем поместите ее обратно в разработчика.
   7. Примерно через 20 минут или когда IPA очистится, высушите пластину воздушным азотом и запекайте в духовке, установленной на 150 °C; как только духовка достигнет 150 °C, выключите ее, но не открывайте. Оставьте в духовке до тех пор, пока она не достигнет комнатной температуры, затем снимите.
   8. Подтвердите высоту SU8 с помощью профилометра и оптические характеристики с помощью светового микроскопа. После подтверждения заклейте пластину внутрь пластиковой чашки Петри толщиной 150 мм.
2. Мягкая литография
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина, приклеенная к чашке Петри, должна быть силанизирована, чтобы предотвратить присоединение PDMS к функциям SU8.
   1. Переверните пластину (прикосните к пластиковой чашке Петри) поверх стеклянной чашки Петри того же размера, содержащей 0,4 мл метилтрихлорсилана (MTCS), и подвергните пластину воздействию паров в течение 4 мин. Поверните пластину в вертикальном положении и положите крышку на чашку Петри.
   2. Смешайте 30 г силиконовой эластомерной основы с отверждающим агентом в соотношении 10:1. Снимите крышку с чашки Петри и вылейте полидиметилсилоксан (PDMS) на пластину, затем дегазируйте в адсорбаторе.
   3. Как только все пузырьки исчезнут, поместите пластину при 80 °C в течение 1,5 ч, чтобы вылечить PDMS.
   4. Тщательно отклейте PDMS и пробивайте входы и выходы для тканевых портов и медиаканалов с помощью 1 мм и 1,5 мм биопсийного перфоратора соответственно.
   5. Очистите каналы PDMS лентой для удаления пыли. Далее замочите крышки (18 х 18 мм, No1) в 70% этаноле не менее чем на 15 мин. Затем высушите их салфетками.
   6. Подвергите как крышки, так и каналы PDMS (выставляемые со стороны объекта) плазме (установка на высокий уровень) в течение 1 мин, затем быстро соедините вместе и поместите в печь с 80 °C на ночь, чтобы закрепить связь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время склеивания важно оказывать мягкое давление на края каналов PDMS, чтобы обеспечить хорошее уплотнение между PDMS и стеклом, избегая при этом самого канала, чтобы предотвратить разрушение канала.
3. Подготовка прибора
   1. Погружайте связанные pdms-устройства в деионизированную воду (DI H₂O) и автоклав с жидкостным циклом. Затем аспирировать жидкость из устройств и автоклава снова с помощью гравитационного цикла. Затем обезвоживают стерилизованные устройства в течение ночи при 80 °C.

2. Культура стволовых клеток (приблизительная продолжительность: 1-2 месяца)

1. Культура и обслуживание hiPSC
   ПРИМЕЧАНИЕ: HiPSCs необходимо культивировать в течение трех последовательных проходов после оттаивания in vitro перед криоконсервацией или дифференцировкой. hiPSCs культивируют в среде E8 или mTeSR1, в зависимости от клеточной линии, на пластинах²⁴с покрытием матрицы базальной мембраны.
   1. Чтобы покрыть пластины матрицей базальной мембраны качества hESC, разморозить одну аликвоту матричной среды (объем, зависящий от лота, обычно 200-300 мкл; хранить при -80 °C), добавив ее к 25 мл DMEM/F-12K на льду. Распределить по 1 мл этой суспензии в каждую скважину из 6-скважинной пластины. Оставьте пластину в инкубаторе при 37 °C не менее чем на 1 ч.
   2. После оттаивания модифицируйте носитель E8 для культуры hiPSC, добавив 5 мкМ Y-27632²⁵ (E8+RI). Используйте этот носитель в течение 24 ч после этого, затем измените его на свежий E8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для рутинных изменений носителей для языка и культуры hiPSC используется немодифицированный носитель E8. Для регулярного технического обслуживания носитель E8 необходимо менять каждый день, примерно через 24 ч после предыдущей смены носителя.
   3. Проход клетки на 3-й или 4-й день, аспиратную жиму, затем промыть каждую скважину 1 мл 1x фосфатно-буферного раствора Dulbecco (DPBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клетки находятся на 70% в слиянии. Не позволяйте им расти дальше 70% слияния.
   4. Аспирировать DPBS, затем добавить 1 мл 0,5 мМ ЭДТА в каждую скважину и инкубировать при комнатной температуре в течение 6-7 мин.
   5. Осторожно аспирировать ЭДТА, добавить 1 мл E8 + RI в каждую скважину и взорвать поверхность пипеткой 1 мл (~ 5-10 раз, чтобы собрать все клетки). Соберите клеточную суспензию в микроцентрифужную трубку 15 мл.
   6. Подсчитайте суспензию и прохождение ячейки при желаемой плотности ячейки (т.е. ~200 К на скважину) в E8+RI.
   7. Смена носителя на E8 (без RI) через 24 ч. Не оставляйте клетки с RI более 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: E8 не следует нагревать до 37 °C. Всегда оставляйте его при комнатной температуре для согревания перед посевом клеток.
2. Кардиомиоцитная (СМ) направленная дифференцировка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить существование неоднородности между различными линиями hiPSCs^{26, 27,}поэтому следующие шаги, возможно, потребуется оптимизировать для каждой клеточной линии. Выполните следующие действия для дифференциации CM.
   1. Готовят RPMI + B27 - инсулин, добавляя 10 мл B27 минус инсулин и 5 мл пенициллина/стрептомицина (ручка/стрептококк) к 500 мл RPMI 1640.
   2. Приготовьте RPMI + B27 + инсулин, добавив 10 мл B27 и 5 мл ручки / стрептококка к 500 мл RPMI 1640.
   3. Приготовьте RPMI минус глюкоза + B27 + инсулин, добавив 10 мл B27, 5 мл ручки / стрептококка и 4 мМ лактата натрия к 500 мл RPMI 1640 без глюкозы.
   4. Как только hiPSCs достигнут 85% конфлюентности, начинают дифференцировку (день 0) путем замены старой среды 4 мл RPMI + B27 - инсулиновой среды, содержащей 10 мкМ CHIR99021, к каждой скважине 6-скважинной пластины (т.е. добавляют 25 мкл 10 мМ CHIR99021 в 25 мл RPMI + B27 - инсулина, а затем сразу добавляют 4 мл на скважину).
      ПРИМЕЧАНИЕ: CHIR99021 является ингибитором GSK и приводит к активации Wnt. Оптимальная концентрация CHIR99021 и начальная концентрация варьируются для каждой клеточной линии^28. Всегда проверяйте градиент концентрации 6-12 мкМ CHIR99021 и серию плотностей посева перед фактическим экспериментом, чтобы определить оптимальные условия для начала дифференциации.
   5. Ровно через 24 ч (1 день) аспирируют среду и заменяют 5 мл предварительно выпевенного RPMI +B27 – инсулина в каждую скважину.
   6. Ровно через 72 ч после добавления CHIR99021 (День 3) соберите 2,5 мл отработанного носителя из каждой скважины 6-скважинной плиты, в общей сложности 15 мл отработанного носителя в трубе.
   7. К этому добавляют 15 мл свежей RPMI + B27 – инсулиновой среды. Добавьте IWP2 к концентрации 5 мкМ в комбинированную среду (т.е. 1 мкл IWP2 при 5 мМ на 1 мл комбинированной среды или 30 мкл IWP2 в 30 общих мл среды).
   8. Удалите ~1,5 мл оставшейся среды на скважину пластины так, чтобы остался 1 мл среды. Энергично закрутите пластину, чтобы обеспечить адекватное удаление остатков клеток. Затем аспирируют остальную часть старой среды и добавляют 5 мл комбинированной среды, содержащей IWP2, на скважину пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление IWP2 к клеткам приводит к ингибированию Wnt.
   9. На 5 день аспирировать среду из каждой скважины и заменить ее 5 мл предварительно выжженного RPMI + B27 - инсулина.
   10. Созревание СМ: На 7-й, 9-й и 11-й день аспирировать среду из каждой скважины и заменить ее 5 мл предварительно выровненного RPMI + B27 + инсулин. Спонтанное избиение должно наблюдаться примерно в эти дни.
   11. Очистка СМ: На 13-й и 16-й день начните глюкозное голодание, аспирируя среду из каждой скважины, промывая каждую скважину 1 мл 1x DPBS, а затем добавляя 5 мл предварительного RPMI минус глюкоза + B27 + инсулин, дополненный 4 мМ лактата натрия.
   12. На 19-й день аспирировать отработанную среду и заменить ее 5 мл предварительно выгремленного RPMI + B27 + инсулина в каждую скважину, чтобы обеспечить восстановление клеток после очистки.
   13. На 21-й день повторно размещайте клетки, следуя описанной ниже протоколу диссоциации СМ (шаг 3.3). Стремитесь к пластине 1,5-2 х 10⁶ ячеек на скважину в 6-скважинной пластине. Например, если это высокоэффективная дифференциация, как правило, расширение 6 скважин в 9 скважин является хорошим.
   14. Начиная с 21-го дня, аспирировать среду из каждой скважины и заменять ее 4 мл RPMI + B27 + инсулина каждые 2-3 дня.
       ПРИМЕЧАНИЕ: HiPSC-CMs готовы к экспериментальному использованию после 23-го дня.

3. Создание 3D сердечной ткани в микрофлюидном устройстве: (Приблизительная продолжительность: 2-3 ч)

1. Культура hCF
   1. Культивируем желудочковые сердечные фибробласты человека (hCF; получены коммерчески из Lonza) в колбах T75 (по 250K клеток на колбу) в Fibroblast Growth Media-3 (FGM3). Меняйте сми через день, и проход при 70% слиянии. Используйте hCF перед пассажем 10, так как они могут начать дифференцироваться до миофибробластов в высоких проходах^29.
2. Диссоциация hCF
   1. Чтобы диссоциировать hCF, сначала выньте колбу из инкубатора. Поместите колбу внутрь шкафа биобезопасности и начните аспирировать отработанные среды из колбы. Затем промыть колбу T75 3 мл 1x DPBS. Закройте колпачок и закрутите колбу.
   2. Аспирировать DPBS. Принимайте 3 мл предварительного 1x Трипсина-ЭДТА (0,05%) и добавьте его в колбу. Наклоните колбу и закрутите, чтобы покрыть дно. Оставьте его в инкубаторе с 37 °C в течение 4-6 минут, проверяя колбу под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки отсоеживаются, о чем свидетельствует круглая форма клетки и плавающие клетки. Если нет, то поставьте колбу обратно в инкубатор еще на минуту.
   3. Нейтрализуют действие трипсина, добавив в колбу 3 мл предварительно выплавленного FGM3. Затем пипеткой нажмите раствор вверх и вниз на дно колбы, чтобы выбить ХФ.
   4. Соберите клеточную суспензию в микроцентрифужную трубку 15 мл. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии и дозируют ее в гемоцитометре, чтобы подсчитать клетки с помощью микроскопа.
   5. Центрифугировать клеточную суспензию при 200 х г в течение 4 мин. Аспирировать супернатант, стараясь не потревожить клеточную гранулу.
   6. Повторно суспендировать гранулы в свежем FGM3, чтобы получить желаемые 75 x 10⁶ клеток/мл. Либо проходите часть (250K клеток на колбу T75), либо следуйте приведенному ниже протоколу для создания 3D-сердечной ткани.
3. Диссоциация СМ
   ПРИМЕЧАНИЕ: После дифференцировки и очистки подготовьте КМ для использования в инъекциях в микрофлюидные устройства.
   1. Вытащайте пластину СМ из инкубатора и аспирировать жимы. Затем промывайте скважины 1 мл 1x DPBS на скважину 6-скважинной плиты. Возьмите 6 мл DPBS и пипетку по 1 мл на скважину.
   2. Аспирировать DPBS осторожно, чтобы не потревожить клетки, прикрепленные к пластине. Пипетку 6 мл теплого клеточного отслоения раствора (например, TrypLE express) и добавляют 1 мл на колодец. Инкубируют клетки в инкубаторе при 37 °C в течение 10 мин.
   3. Нейтрализовать фермент равным объемом RPMI + B27+ инсулина (т.е. 1 мл на скважину) и механически диссоциировать клетки путем пипетки вверх и вниз против сосуда культуры пипеткой 1 мл.
   4. Соберите КМ в 15 мл центрифужной трубки. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин.
   5. Аспирировать супернатанта. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 5 мл RPMI + B27 + инсулина. Пипетка раствора вверх и вниз с помощью пипетки 1 мл для обеспечения правильного перемешивания. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии и дозируют ее в гемоцитометре для определения общего количества клеток.
   6. Центрифугируют клетки снова при 300 х г в течение 3 мин (чтобы обеспечить полное удаление TrypLE) и аспирируют супернатант. Затем добавьте соответствующий объем RPMI + B27 + инсулина для достижения 75 х 10⁶ клеток / мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если сердечная дифференцировка/отбор не приводит к высокому CM% (т.е. >80%), о чем свидетельствует иммуноокрашивание или проточная цитометрия для CM-специфических белков, таких как cTnT, не рассматривайте клетки как подходящие для формирования ткани. Процесс дифференциации должен быть оптимизирован, когда это происходит, путем корректировки концентраций CHIR99021 и начальной начальной плотности. Если очистка СМ нуждается в улучшении, могут быть использованы другие методы, такие как сортировка для КМ с флуоресцентной активацией сортировки клеток (FACS) или магнитно-активированной сортировки ячеек (MACS)^30,31,32.
4. Препарат коллагена
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте коллаген из высокой концентрации коллагенового запаса (в пределах 8-11 мг/мл). Коллаген, используемый для создания смеси клетки: гидрогель, составляет 6 мг / мл, а конечная концентрация составляет 2 мг / мл. В зависимости от количества устройств для инъекции, объем коллагенового раствора, который должен быть сделан, должен быть снова рассчитан.
   1. Храните все необходимые реагенты на льду внутри вытяжки биобезопасности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коллаген представляет собой термореагнитный гидрогель. Поэтому температура должна оставаться низкой, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию.
   2. Возьмите 75 мкл коллагена (8 мг/мл) и раздайте его в микроцентрифужную трубку на льду. Раствор коллагена очень вязкий, поэтому медленно аспирировать его пипеткой.
   3. Возьмите 13,85 мкл среды (т.е. RPMI + B27 + инсулин) и дозируют ее в той же пробирке.
   4. Затем берут 10 мкл фенола красного цвета, добавляют в смесь и повторно суспендировали.
   5. Наконец, возьмите 1,15 мкл 1N NaOH и добавьте к суспензии.
   6. Используя наконечник пипетки 200 мкл, повторно суспензию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковый коллаген имеет кислый рН, что требует добавления NaOH для нейтрализации перед использованием его для инкапсуляции сердечных клеток. Фенол красный действует как показатель рН; поэтому добавьте это перед добавлением NaOH. В этот момент раствор коллагена будет желтым, обозначающим его кислотность. После добавления NaOH раствор должен превратиться из оранжевого в светло-розовый, что свидетельствует о его нейтрализации.
5. Гидрогелевая смесь и клеточный препарат
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе выполняется инкапсуляция клеток в гидрогеле на основе коллагена. Клетки, как и все предшественники гидрогеля, должны быть помещены на лед во время следующих этапов.
   1. На этом этапе, если ХФ еще не были трипсинизированы, храните суспензию СМ в центрифуге 15 мл с открученной крышкой, чтобы обеспечить поток газа, в инкубаторе с 37 °C. Параллельно диссоциируют КС и собирают при плотности 75 х 10⁶ ячеек/мл для загрузки устройства.
   2. Смешайте взвешенные СМ с КФ в соотношении 4:1. Возьмите аликвоту в 8 мкл КМ и добавьте в свежую центрифужную трубку на льду. Затем берут 2 мкл ХФ и добавляют к ячейке суспензию в трубке центрифуги.
   3. Повторно суспендируют клеточную суспензию, возьмите 5,6 мкл клеточной суспензии и поместите ее в свежую микроцентрифужную трубку.
   4. Возьмите 4 мкл коллагена, только что приготовленного на вышеуказанных этапах, и добавьте в смесь 4: 1 СМ: CF. Добавьте 2,4 мкл матрицы базальной мембраны с пониженным фактором роста (СКФ), сделав конечную плотность клеток 35 х^{10 6} клеток / мл для инъекции устройства. Пипетка смеси вверх и вниз, чтобы убедиться, что клеточная суспензия однородна.
6. Вставка устройства
   ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как смесь ячеек: гидрогель подготовлена, ее необходимо вставить в устройства.
   1. Возьмите автоклавные микрофлюидные устройства из печи с температурой 80 °C и установите их в шкаф биобезопасности не менее чем на 1 ч до введения клеточной суспензии, чтобы устройства остыли до комнатной температуры при сохранении стерильности.
   2. Поместите приборы в чашки Петри 60 х 15 мм, по 3-4 устройства на чашку. Наполните чашку Петри 150 x 15 мм тонким слоем DI H₂O, чтобы вместить 3 из чаш Петри 60 x 15 мм. Этот шаг создает увлажненную среду, окружающую микрофлюидные устройства.
   3. Используйте новый наконечник и тщательно суспендирование смеси ячейки: гидрогеля путем пипетки суспензии, пока трубка остается на льду.
   4. Вставьте наконечник в инъекционный порт устройства и медленно и неуклонно вводят 3 мкл клеточной:гидрогелевой суспензии в область ткани на входе микрофлюидного устройства с помощью наконечника пипетки 20 мкл. Как только порт заполнен, остановите инъекцию и извлеките наконечник. Повторить для всех устройств или всей приготовленной гидрогелевой суспензии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшой объем ячейки: суспензия гидрогеля нагревается / охлаждается очень быстро, поэтому уместно держать суспензию на льду как можно дольше. При вставке пипетку раствора со льда и вставляют в устройства как можно быстрее, так как гидрогель может начать полимеризоваться в наконечнике пипетки. Важно создавать небольшие объемы клеточной: гидрогелевая суспензия за раз, поэтому, если вводится много устройств, суспензия ячейки: гидрогель должна быть сделана свежей для каждого набора из 4 устройств.
   5. Переверните устройства в чашки Петри пинцеем и поместите их в большую чашку Петри с водой. Инкубировать в инкубаторе при 37 °C в течение 9 мин для полимеризации гидрогеля.
   6. Выньте устройства из инкубатора, переверните устройства в вертикальном положении и инкубируете при 37 °C в течение 9 мин до полной полимеризации гидрогеля.
   7. Вводят RPMI + B27 + инсулин во фланкинговые медиаканалы (~20 мкл на устройство). Поместите устройства обратно в инкубатор при 37 °C. Меняйте медиа в медиаканалах свежим RPMI + B27 + инсулин каждый день. Было продемонстрировано, что устройства культивированы от 14-21^{дня 20.}
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за небольшого объема среды на чип, чтобы предотвратить испарение среды, важно поддерживать устройства в большой чашке Петри, заполненной DI H₂O, которая служит увлажненной камерой. Кроме того, небольшие капли избытка RPMI + B27 + инсулина могут быть пипетированы на верхней части входов / выходов канала во время рутинных изменений среды.

4. Анализ тканей

1. Визуализация в реальном времени
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все живые изображения должны выполняться с помощью сценического инкубатора для поддержания 37 °C и 5% CO_2.
   1. Поместите устройства в экологически контролируемый сценический инкубатор. Записывайте 30-с видео нескольких точек внутри каждого устройства с максимальной частотой кадров.
   2. Чтобы оценить сократимость тканей после извлечения сигналов биения, используйте дополнительный специально написанный код MATLAB для извлечения пиков(Дополнительный файл 2)для расчета вариабельности интервала между ударами.
   3. Измените жижи в устройствах в вытяжке клеточной культуры, а затем поместите обратно в инкубатор клеточной культуры.
2. Иммунофлуоресцентное окрашивание
   1. Приготовить PBS-глицин: растворить глицин 100 мМ в PBS и добавить 0,02% NaN₃ для длительного хранения. Отрегулируйте pH до 7,4.
   2. Подготовьте PBS-Tween-20: добавьте 0,05% Tween-20 в PBS и добавьте 0,02% NaN₃ для длительного хранения. Отрегулируйте pH до 7,4.
   3. Подготовка буфера ПЧ: добавьте в PBS 0,2% Triton X-100, 0,1% BSA и 0,05% Tween-20 и добавьте 0,02% NaN₃ для длительного хранения. Отрегулируйте pH до 7,4.
   4. Приготовьте 10% козьей сыворотки: повторно суспендировать лиофилизированную козью сыворотку в 2 мл PBS, чтобы получить 100% козью сыворотку. Затем разбавьте 2 мл 18 мл PBS, чтобы получить 10% козьей сыворотки.
   5. Зафиксируйте образцы, добавив 4% параформальдегида (PFA) в тканевые каналы и инкубируя при 37 °C в течение 20 мин.
   6. Промыть клетки, добавив PBS-Глицин в тканевые каналы 2x в течение 10 мин инкубации при комнатной температуре.
   7. Промыть ячейки, добавив PBS -Tween-20 в течение 10 мин при комнатной температуре.
   8. Пермеабилизируют клетки, добавляя буфер ПЧ в тканевые каналы в течение 30 мин при комнатной температуре.
   9. Блокируют клетки, добавляя 10% раствор козьей сыворотки в тканевые каналы в течение 1 ч при комнатной температуре.
   10. Разбавляют неконъюгированные первичные антитела в 10% козьей сыворотке при желаемых концентрациях (см. Дополнительный файл 3),добавляют в тканевые каналы и инкубируют образцы при 4 °C в течение ночи.
   11. На следующий день промывайте образцы, добавляя PBS-Tween-20 в тканевые каналы 3x в течение 20 минут каждый при комнатной температуре.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с шага 4.2.12 включительный, выполняйте все задачи в темноте, чтобы образцы были защищены от света.
   12. Разводят вторичные антитела в PBS-Tween-20 в нужных концентрациях, центрифугу при 10 000 х г в течение 10 мин для сбора любых осадков, затем добавляют в тканевые каналы.
   13. Через 30 мин-1 ч промыть образцы PBS-Tween-20 3x в течение 10 мин каждый при комнатной температуре.
   14. Добавьте анти-выцветающей или желаемую монтажную среду к тканевым каналам. Затем образцы могут быть визуалированы с помощью флуоресцентной микроскопии или конфокального микроскопа, если желательно более высокое увеличение. Чтобы визуализировать всю 3D-ткань, изображения в разных z-плоскостях могут быть сложены и реконструированы для формирования репрезентативных 3D-изображений.

Для получения высокоочищеной популяции КМ из hiPSCs используется модифицированная версия, включающая комбинацию протокола дифференциацииЛиан 33 и этапов очистки Тохьямы34 (см. Фиг.1A для экспериментальной временной шкалы). HiPSCs должны быть колониеобразными, ~85% слизыми и равномерно распространяться по всей культуре хорошо через 3-4 дня после прохождения, в начале дифференциации CM(рисунок 1B). В частности, в День 0 колонии hiPSC должны иметь высокую экспрессию факторов транскрипции плюрипотентности, включая SOX2 и Nanog(рисунок 1C). Основываясь на этом протоколе, доказательства успешного процесса дифференцировки и очистки стволовых клеток демонстрируются на рисунке 1D,с плотными колониями КМ, экспрессирующими саркомерический α-актинин, с минимальным окружающим не-КМ. Кроме того, hCF должны поддерживать морфологию фибробластов с высокой экспрессией виментина(рисунок 1E),поэтому их следует использовать до P10, поскольку они могут начать дифференцироваться в миофибробласты в более высоких проходах29.

Для поддержания надежного характера этого протокола уместно реализовать повторное покрытие hiPSC-CMs после метаболической очистки. Из-за наличия мертвых клеток и мусора, которые возникают от глюкозного голодания, КМ нуждаются в дальнейшем этапе очистки, чтобы максимизировать чистоту и здоровье СМ перед использованием в эксперименте; поэтому используется покрытие, поскольку оно помогает разрыхлить мусор / мертвые не-КМ(рис. 2A-B, видео 1-2). Видео 1 показывает пример популяции КМ перед повторной покрытием, представляя собой высокую чистоту КМ в нескольких слоях, однако с большим количеством мусора, присутствующего на клетках и плавающего в среде из-за реализованной очистки. Соответственно, Видео 2 показывает ту же популяцию СМ сразу после повторного покрытия, представляя КМ в монослое со значительно меньшим количеством мусора, демонстрируя эффекты переваривания тканей и диссоциации одноклеточных клеток, которые происходят во время повторного покрытия.

При введении встроенного в клетку гидрогеля в микрофлюидное устройство (т.е. чип; вставное изображение на рисунке 3)клетки получают плотную и равномерно расположенные по всем столбам. Клетки начинают распространяться на 1-й день(рисунок 3А),затем к 7-му дню они возобновляют биение и становятся более синхронными в своих сократительных паттернах(рисунок 3B). Кроме того, 3D-ткани конденсируются вокруг столбов, образуя повторяющиеся эллиптические поры, и клетки удлиняются. К 14-му дню зрелые ткани демонстрируют высокую степень анизотропии (т.е. направленную организацию), состоящую из клеток с вытянутой формой(рисунки 3C, 4A),полосатых, выровненных саркомеров и локализованных щелевых соединений(рисунок 4B). Кроме того, спонтанные сократительные паттерны этих тканей очень синхронны(рисунок 4C,видео 3)из-за взаимосвязанной, выровненной природы сердечных клеток.

Рисунок 1:Экспериментальные схематические и репрезентативные изображения клеточной морфологии при подготовке к инъекции устройства: Схема протокола, описывающего этапы после изготовления микрофлюидного устройства, от культуры hiPSC до микрофлюидного формирования сердечной ткани(A). hiPSCs должны поддерживать колониеподобную морфологию(B)и высокую экспрессию маркеров плюрипотентности (SOX2, зеленый; Наног, красный)(С)о наступлении дифференцировки. После дифференциации hiPSC-CM должны быть обильные, плотные пятна КМ, окрашенные саркомерическим альфа-актинином (SAA, зеленый), с минимальным окружающим не-КМ, о чем свидетельствует окрашивание виментином (vim, красный)(D). hCF должны иметь высокий уровень экспрессии виментина и поддерживать морфологию фибробластов(E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:популяции hiPSC-CM на последних стадиях дифференцировки: процесс очистки вызывает гибель не-CMs, производя мусор в клеточной культуре, присутствующий до повторного покрытия CM(A). После повторного покрытия(B)обломки и не-КМ смещаются, служа для дальнейшей очистки популяции КМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Формирование сердечной 3D-ткани человека в микрофлюидном устройстве: На следующий день после инъекции в устройство (показана в верхней левой вставке, рядом с УС-центом для шкалы) клетки начнут распространяться и будут плотными и однородно распределенными по всему устройству(A). После недели культивации клетки возобновят спонтанное биение и образуют уплотненные, выровненные ткани(В). За две недели культивации клетки образуют конденсированные, выровненные ткани вокруг эллиптических столбов(С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Репрезентативные характеристики сердечной ткани человека после культивирования в течение 14 дней в микрофлюидном устройстве: Клетки сформировали удлиненные, сильно выровненные ткани, что обозначается актиневым окрашиванием(А). Саркомериты параллельны и полосатые, и существует локализация щелеобразных соединений, о чем свидетельствует окрашивание саркомерических α-актинина (SAA) и коннексина 43 (CX43) соответственно(B). Спонтанное сокращение синхронно(С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: Спонтанное сокращение hiPSC-CMs на 21-й день после очистки лактата и перед повторной покрытием Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Видео 2: Спонтанное сокращение hiPSC-CMs на 23-й день после повторного покрытия Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 3: Синхронное, спонтанное сокращение сердечной ткани человека в течение 14 дней Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительный файл 1: Файл AutoCAD для устройства heart on-a-chip Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Программа MATLAB для извлечения пиков для определения изменчивости интервала между ударами от сигналов биения Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Таблица первичных и вторичных антител Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.