Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Целью этого протокола является объяснение и демонстрация разработки трехмерной (3D) микрофлюидной модели высокоровневой сердечной ткани человека, состоящей из кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, совместно культивируемых с сердечными фибробластами (FF) в биомиметическом гидрогеле на основе коллагена, для применения в инженерии сердечной ткани, скрининге лекарств и моделировании заболеваний.

Abstract

Основной причиной смерти во всем мире по-прежнему является сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ). Тем не менее, моделирование физиологической и биологической сложности сердечной мышцы, миокарда, как известно, трудно выполнить in vitro. В основном, препятствия заключаются в потребности в кардиомиоцитах человека (КМ), которые либо являются взрослыми, либо демонстрируют взрослые фенотипы и могут успешно воспроизводить клеточную сложность миокарда и сложную 3D-архитектуру. К сожалению, из-за этических проблем и отсутствия доступной первичной сердечной ткани человека, полученной от пациента, в сочетании с минимальным распространением КМ, поиск жизнеспособных человеческих КМ был ограничивающим шагом для инженерии сердечной ткани. С этой целью большинство исследований перешли к сердечной дифференцировке индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) в качестве основного источника ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ СМ, что привело к широкому включению hiPSC-CMs в анализы in vitro для моделирования сердечной ткани.

Здесь, в этой работе, мы демонстрируем протокол для разработки 3D-зрелой сердечной ткани человека, полученной из стволовых клеток, в микрофлюидном устройстве. Мы специально объясняем и визуально демонстрируем производство 3D-модели анизотропной сердечной ткани in vitro на чипе из КМ, полученных из hiPSC. Мы в первую очередь описываем протокол очистки для выбора для КМ, ко-культуру клеток с определенным соотношением путем смешивания КМ с человеческими ХФ (hCF) и суспензию этой кокультуры в гидрогеле на основе коллагена. Далее мы демонстрируем инъекцию нагруженного клетками гидрогеля в наше четко определенное микрофлюидное устройство, встроенное в шахматном порядке эллиптические микропосты, которые служат топографией поверхности, чтобы вызвать высокую степень выравнивания окружающих клеток и гидрогелевой матрицы, имитируя архитектуру нативного миокарда. Мы предполагаем, что предлагаемая 3D-анисотропная модель сердечной ткани на чипе подходит для фундаментальных биологических исследований, моделирования заболеваний и, благодаря ее использованию в качестве инструмента скрининга, фармацевтического тестирования.

Introduction

В последние годы широко изучены подходы к тканевой инженерии для сопровождения клинических результатов in vivo в регенеративной медицине и моделировании заболеваний^1,2. Значительное внимание было уделено моделированию сердечной ткани in vitro из-за присущих трудностей в поиске первичной сердечной ткани человека и производстве физиологически значимых суррогатов in vitro, ограничивая фундаментальное понимание сложных механизмов сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ)^1,3. Традиционные модели часто включали 2D-анализы монослойной культуры. Тем не менее, важность культивирования сердечных клеток в 3D-среде для имитации как нативного ландшафта миокарда, так и сложных клеточных взаимодействий была широко охарактеризована^4,5. Кроме того, большинство моделей, произведенных до сих пор, включали монокультуру КМ, дифференцированных от стволовых клеток. Тем не менее, сердце состоит из нескольких типов клеток⁶ в сложной 3D-архитектуре^7,что оправдывает критическую необходимость улучшения сложности состава тканей в рамках 3D-моделей in vitro для лучшей имитации клеточных компонентов нативного миокарда.

На сегодняшний день было изучено много различных подходов к созданию биомиметических 3D-моделей миокарда^8. Эти подходы варьируются от экспериментальных установок, которые позволяют в режиме реального времени рассчитывать генерируемую силу, от монокультурных КМ, посеянных на тонких пленках (считающихся мышечными тонкими пленками (MTF))^9,до совместной культивирования сердечных клеток в 3D-гидрогелевых матрицах, взвешенных среди отдельно стоящих кантилеверов (считающихся инженерными тканями сердца (ET))^10. Другие подходы были сосредоточены на реализации методов микроформования для имитации анизотропии миокарда, от монокультурных КМ в 3D-гидрогеле, суспендированном среди выступающих микропостов в тканевом^{пятне 11,}до монокультурных КМ, посеянных среди вдавленных микроплодов^12,13. Каждому из этих методов присущи ими преимущества и недостатки, поэтому уместно использовать технику, которая согласуется с предполагаемым применением и соответствующим биологическим вопросом.

Способность усиливать созревание КМ, полученных из стволовых клеток, имеет важное значение для успешной инженерии in vitro взрослой ткани миокарда и трансляции последующих результатов в клинические интерпретации. С этой целью методы зрелых КМ были широко исследованы, как в 2D, так и в 3D^14,15,16. Например, электрическая стимуляция, включенная в ЭХТ, принудительное выравнивание КМ с топографией поверхности, сигнальными сигналами, факторами роста от кокультуры и / или условиями 3D-гидрогеля и т. Д., Все это приводит к изменению в пользу созревания СМ по меньшей мере в одном из следующих: морфология клеток, обработка кальция, саркомерная структура, экспрессия генов или сократительная сила.

Из этих моделей подходы, использующие микрофлюидные платформы, сохраняют определенные преимущества в природе, такие как контроль градиентов, ограниченный ввод клеток и минимальные необходимые реагенты. Кроме того, многие биологические реплики могут быть сгенерированы одновременно с использованием микрофлюидных платформ, служащих для лучшего препарирования интересующего биологического механизма и увеличения размера экспериментальной выборки в пользу статистической мощности^17,18,19. Кроме того, использование фотолитографии в процессе изготовления микрофлюидных устройств позволяет создавать точные признаки (например, топографии) на микро- и наноуровне, которые служат мезоскопическими сигналами для улучшения окружающей клеточной структуры и архитектуры тканей на макроуровне^{18,20,21, 22} для различных применений в регенерации тканей и моделировании заболеваний.

Ранее мы продемонстрировали разработку новой 3D-модели сердечной ткани на чипе, которая включает топографию поверхности в виде врожденных эллиптических микропостов для выравнивания гидрогелево-инкапсулированных кокумулированных сердечных клеток во взаимосвязанную анисотропную ткань^20. После 14 дней культивирования ткани, образующиеся в микрофлюидном устройстве, являются более зрелыми по своему фенотипу, профилю экспрессии генов, характеристикам обработки кальция и фармацевтическому ответу по сравнению с монослойным и 3D-изотропным контролем^23. Протокол, описанный в настоящем описании, описывает способ создания этой 3D-совместно культивируемой, выровненной (т.е. анизотропной) сердечной ткани человека в микрофлюидном устройстве с использованием ХМ, полученных из hiPSC. В частности, мы объясняем способы дифференцировки и очистки hiPSC в сторону КМ, добавление hCF с КМ для получения установленной популяции кокультур, введение клеточной популяции, инкапсулированной в гидрогеле коллагена, в микрофлюидные устройства, и последующий анализ 3D-сконструированных тканей с помощью сократительных и иммунофлуоресцентных анализов. Полученные 3D-инженерные микроткани подходят для различных применений, включая фундаментальные биологические исследования, моделирование сердечно-сосудистых заболеваний и фармацевтические испытания.

Protocol

Выполнять все обработки клеток и подготовку реагентов в шкафу биобезопасности. Убедитесь, что все поверхности, материалы и оборудование, которые вступают в контакт с клетками, стерильны (т. Е. Распыляйте 70% этанола). Клетки следует культивировали в увлажненный инкубатор при 37 °C, 5% CO2. Вся культура и дифференциация hiPSC выполняется в 6-скважинных пластинах. 1. Создание микрофлюидного устройства (приблизительная продолжительность: 1 неделя) фотолитографияПРИМЕЧАНИЕ: Маска, разработанная с использованием файла CAD (предоставляется в виде дополнительного файла 1),содержит конструкцию микрофлюидного канала. Распечатайте дизайн на прозрачной маске. Затем выполните стандартную фотолитографию с отрицательным фоторезистом SU8 2075 на 4-дюймовой кремниевой пластине в чистой комнате. Очистите кремниевую пластину изопропиловым спиртом (IPA) и высушите азотом. Выпекать при 200 °C в течение 5 мин для обезвоживания.ПРИМЕЧАНИЕ: Обработайте пластину пинцезом. Поместите пластину в спин-коатер. Внесите 3-4 мл SU8 в центр пластины, затем вращайтесь, чтобы сформировать слой 200 мкм (т. Е. Нарастите до 15 с до 500 об/мин, открутите в течение 10 с, увеличь от 5 с до 1 200 об/мин и вращайтесь в течение 30 с, затем понижайте в течение 15 с, пока не остановитесь). Выньте и мягко запекайте в течение 7 мин при 65 °C, затем 45 мин при 95 °C. Переместите пластину в элайнер маски и поместите прозрачную маску в держатель маски с помощью УФ-фильтра. Подвергайте пластину 2 циклам по 230мДж/см2, с задержкой 30 с, при общей экспозиции 460 мДж/см2. Выполните выпекание после воздействия на открытой вафле в духовке с 50 °C в течение ночи. Выключите духовку на следующее утро, а после того, как вафля остынет до комнатной температуры, погружайте ее в SU8-разработчик. Снимайте пластину с разработчика каждые 5 минут и мойте с помощью IPA, а затем поместите ее обратно в разработчика. Примерно через 20 минут или когда IPA очистится, высушите пластину воздушным азотом и запекайте в духовке, установленной на 150 °C; как только духовка достигнет 150 °C, выключите ее, но не открывайте. Оставьте в духовке до тех пор, пока она не достигнет комнатной температуры, затем снимите. Подтвердите высоту SU8 с помощью профилометра и оптические характеристики с помощью светового микроскопа. После подтверждения заклейте пластину внутрь пластиковой чашки Петри толщиной 150 мм. Мягкая литографияПРИМЕЧАНИЕ: Пластина, приклеенная к чашке Петри, должна быть силанизирована, чтобы предотвратить присоединение PDMS к функциям SU8. Переверните пластину (прикосните к пластиковой чашке Петри) поверх стеклянной чашки Петри того же размера, содержащей 0,4 мл метилтрихлорсилана (MTCS), и подвергните пластину воздействию паров в течение 4 мин. Поверните пластину в вертикальном положении и положите крышку на чашку Петри. Смешайте 30 г силиконовой эластомерной основы с отверждающим агентом в соотношении 10:1. Снимите крышку с чашки Петри и вылейте полидиметилсилоксан (PDMS) на пластину, затем дегазируйте в адсорбаторе. Как только все пузырьки исчезнут, поместите пластину при 80 °C в течение 1,5 ч, чтобы вылечить PDMS. Тщательно отклейте PDMS и пробивайте входы и выходы для тканевых портов и медиаканалов с помощью 1 мм и 1,5 мм биопсийного перфоратора соответственно. Очистите каналы PDMS лентой для удаления пыли. Далее замочите крышки (18 х 18 мм, No1) в 70% этаноле не менее чем на 15 мин. Затем высушите их салфетками. Подвергите как крышки, так и каналы PDMS (выставляемые со стороны объекта) плазме (установка на высокий уровень) в течение 1 мин, затем быстро соедините вместе и поместите в печь с 80 °C на ночь, чтобы закрепить связь.ПРИМЕЧАНИЕ: Во время склеивания важно оказывать мягкое давление на края каналов PDMS, чтобы обеспечить хорошее уплотнение между PDMS и стеклом, избегая при этом самого канала, чтобы предотвратить разрушение канала. Подготовка прибора Погружайте связанные pdms-устройства в деионизированную воду (DI H2O) и автоклав с жидкостным циклом. Затем аспирировать жидкость из устройств и автоклава снова с помощью гравитационного цикла. Затем обезвоживают стерилизованные устройства в течение ночи при 80 °C. 2. Культура стволовых клеток (приблизительная продолжительность: 1-2 месяца) Культура и обслуживание hiPSCПРИМЕЧАНИЕ: HiPSCs необходимо культивировать в течение трех последовательных проходов после оттаивания in vitro перед криоконсервацией или дифференцировкой. hiPSCs культивируют в среде E8 или mTeSR1, в зависимости от клеточной линии, на пластинах24с покрытием матрицы базальной мембраны. Чтобы покрыть пластины матрицей базальной мембраны качества hESC, разморозить одну аликвоту матричной среды (объем, зависящий от лота, обычно 200-300 мкл; хранить при -80 °C), добавив ее к 25 мл DMEM/F-12K на льду. Распределить по 1 мл этой суспензии в каждую скважину из 6-скважинной пластины. Оставьте пластину в инкубаторе при 37 °C не менее чем на 1 ч. После оттаивания модифицируйте носитель E8 для культуры hiPSC, добавив 5 мкМ Y-2763225 (E8+RI). Используйте этот носитель в течение 24 ч после этого, затем измените его на свежий E8.ПРИМЕЧАНИЕ: Для рутинных изменений носителей для языка и культуры hiPSC используется немодифицированный носитель E8. Для регулярного технического обслуживания носитель E8 необходимо менять каждый день, примерно через 24 ч после предыдущей смены носителя. Проход клетки на 3-й или 4-й день, аспиратную жиму, затем промыть каждую скважину 1 мл 1x фосфатно-буферного раствора Dulbecco (DPBS).ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клетки находятся на 70% в слиянии. Не позволяйте им расти дальше 70% слияния. Аспирировать DPBS, затем добавить 1 мл 0,5 мМ ЭДТА в каждую скважину и инкубировать при комнатной температуре в течение 6-7 мин. Осторожно аспирировать ЭДТА, добавить 1 мл E8 + RI в каждую скважину и взорвать поверхность пипеткой 1 мл (~ 5-10 раз, чтобы собрать все клетки). Соберите клеточную суспензию в микроцентрифужную трубку 15 мл. Подсчитайте суспензию и прохождение ячейки при желаемой плотности ячейки (т.е. ~200 К на скважину) в E8+RI. Смена носителя на E8 (без RI) через 24 ч. Не оставляйте клетки с RI более 24 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: E8 не следует нагревать до 37 °C. Всегда оставляйте его при комнатной температуре для согревания перед посевом клеток. Кардиомиоцитная (СМ) направленная дифференцировкаПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить существование неоднородности между различными линиями hiPSCs26, 27,поэтому следующие шаги, возможно, потребуется оптимизировать для каждой клеточной линии. Выполните следующие действия для дифференциации CM. Готовят RPMI + B27 – инсулин, добавляя 10 мл B27 минус инсулин и 5 мл пенициллина/стрептомицина (ручка/стрептококк) к 500 мл RPMI 1640. Приготовьте RPMI + B27 + инсулин, добавив 10 мл B27 и 5 мл ручки / стрептококка к 500 мл RPMI 1640. Приготовьте RPMI минус глюкоза + B27 + инсулин, добавив 10 мл B27, 5 мл ручки / стрептококка и 4 мМ лактата натрия к 500 мл RPMI 1640 без глюкозы. Как только hiPSCs достигнут 85% конфлюентности, начинают дифференцировку (день 0) путем замены старой среды 4 мл RPMI + B27 – инсулиновой среды, содержащей 10 мкМ CHIR99021, к каждой скважине 6-скважинной пластины (т.е. добавляют 25 мкл 10 мМ CHIR99021 в 25 мл RPMI + B27 – инсулина, а затем сразу добавляют 4 мл на скважину).ПРИМЕЧАНИЕ: CHIR99021 является ингибитором GSK и приводит к активации Wnt. Оптимальная концентрация CHIR99021 и начальная концентрация варьируются для каждой клеточной линии28. Всегда проверяйте градиент концентрации 6-12 мкМ CHIR99021 и серию плотностей посева перед фактическим экспериментом, чтобы определить оптимальные условия для начала дифференциации. Ровно через 24 ч (1 день) аспирируют среду и заменяют 5 мл предварительно выпевенного RPMI +B27 – инсулина в каждую скважину. Ровно через 72 ч после добавления CHIR99021 (День 3) соберите 2,5 мл отработанного носителя из каждой скважины 6-скважинной плиты, в общей сложности 15 мл отработанного носителя в трубе. К этому добавляют 15 мл свежей RPMI + B27 – инсулиновой среды. Добавьте IWP2 к концентрации 5 мкМ в комбинированную среду (т.е. 1 мкл IWP2 при 5 мМ на 1 мл комбинированной среды или 30 мкл IWP2 в 30 общих мл среды). Удалите ~1,5 мл оставшейся среды на скважину пластины так, чтобы остался 1 мл среды. Энергично закрутите пластину, чтобы обеспечить адекватное удаление остатков клеток. Затем аспирируют остальную часть старой среды и добавляют 5 мл комбинированной среды, содержащей IWP2, на скважину пластины.ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление IWP2 к клеткам приводит к ингибированию Wnt. На 5 день аспирировать среду из каждой скважины и заменить ее 5 мл предварительно выжженного RPMI + B27 – инсулина. Созревание СМ: На 7-й, 9-й и 11-й день аспирировать среду из каждой скважины и заменить ее 5 мл предварительно выровненного RPMI + B27 + инсулин. Спонтанное избиение должно наблюдаться примерно в эти дни. Очистка СМ: На 13-й и 16-й день начните глюкозное голодание, аспирируя среду из каждой скважины, промывая каждую скважину 1 мл 1x DPBS, а затем добавляя 5 мл предварительного RPMI минус глюкоза + B27 + инсулин, дополненный 4 мМ лактата натрия. На 19-й день аспирировать отработанную среду и заменить ее 5 мл предварительно выгремленного RPMI + B27 + инсулина в каждую скважину, чтобы обеспечить восстановление клеток после очистки. На 21-й день повторно размещайте клетки, следуя описанной ниже протоколу диссоциации СМ (шаг 3.3). Стремитесь к пластине 1,5-2 х 106 ячеек на скважину в 6-скважинной пластине. Например, если это высокоэффективная дифференциация, как правило, расширение 6 скважин в 9 скважин является хорошим. Начиная с 21-го дня, аспирировать среду из каждой скважины и заменять ее 4 мл RPMI + B27 + инсулина каждые 2-3 дня.ПРИМЕЧАНИЕ: HiPSC-CMs готовы к экспериментальному использованию после 23-го дня. 3. Создание 3D сердечной ткани в микрофлюидном устройстве: (Приблизительная продолжительность: 2-3 ч) Культура hCF Культивируем желудочковые сердечные фибробласты человека (hCF; получены коммерчески из Lonza) в колбах T75 (по 250K клеток на колбу) в Fibroblast Growth Media-3 (FGM3). Меняйте сми через день, и проход при 70% слиянии. Используйте hCF перед пассажем 10, так как они могут начать дифференцироваться до миофибробластов в высоких проходах29. Диссоциация hCF Чтобы диссоциировать hCF, сначала выньте колбу из инкубатора. Поместите колбу внутрь шкафа биобезопасности и начните аспирировать отработанные среды из колбы. Затем промыть колбу T75 3 мл 1x DPBS. Закройте колпачок и закрутите колбу. Аспирировать DPBS. Принимайте 3 мл предварительного 1x Трипсина-ЭДТА (0,05%) и добавьте его в колбу. Наклоните колбу и закрутите, чтобы покрыть дно. Оставьте его в инкубаторе с 37 °C в течение 4-6 минут, проверяя колбу под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки отсоеживаются, о чем свидетельствует круглая форма клетки и плавающие клетки. Если нет, то поставьте колбу обратно в инкубатор еще на минуту. Нейтрализуют действие трипсина, добавив в колбу 3 мл предварительно выплавленного FGM3. Затем пипеткой нажмите раствор вверх и вниз на дно колбы, чтобы выбить ХФ. Соберите клеточную суспензию в микроцентрифужную трубку 15 мл. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии и дозируют ее в гемоцитометре, чтобы подсчитать клетки с помощью микроскопа. Центрифугировать клеточную суспензию при 200 х г в течение 4 мин. Аспирировать супернатант, стараясь не потревожить клеточную гранулу. Повторно суспендировать гранулы в свежем FGM3, чтобы получить желаемые 75 x 106 клеток/мл. Либо проходите часть (250K клеток на колбу T75), либо следуйте приведенному ниже протоколу для создания 3D-сердечной ткани. Диссоциация СМПРИМЕЧАНИЕ: После дифференцировки и очистки подготовьте КМ для использования в инъекциях в микрофлюидные устройства. Вытащайте пластину СМ из инкубатора и аспирировать жимы. Затем промывайте скважины 1 мл 1x DPBS на скважину 6-скважинной плиты. Возьмите 6 мл DPBS и пипетку по 1 мл на скважину. Аспирировать DPBS осторожно, чтобы не потревожить клетки, прикрепленные к пластине. Пипетку 6 мл теплого клеточного отслоения раствора (например, TrypLE express) и добавляют 1 мл на колодец. Инкубируют клетки в инкубаторе при 37 °C в течение 10 мин. Нейтрализовать фермент равным объемом RPMI + B27+ инсулина (т.е. 1 мл на скважину) и механически диссоциировать клетки путем пипетки вверх и вниз против сосуда культуры пипеткой 1 мл. Соберите КМ в 15 мл центрифужной трубки. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин. Аспирировать супернатанта. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 5 мл RPMI + B27 + инсулина. Пипетка раствора вверх и вниз с помощью пипетки 1 мл для обеспечения правильного перемешивания. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии и дозируют ее в гемоцитометре для определения общего количества клеток. Центрифугируют клетки снова при 300 х г в течение 3 мин (чтобы обеспечить полное удаление TrypLE) и аспирируют супернатант. Затем добавьте соответствующий объем RPMI + B27 + инсулина для достижения 75 х 106 клеток / мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Если сердечная дифференцировка/отбор не приводит к высокому CM% (т.е. >80%), о чем свидетельствует иммуноокрашивание или проточная цитометрия для CM-специфических белков, таких как cTnT, не рассматривайте клетки как подходящие для формирования ткани. Процесс дифференциации должен быть оптимизирован, когда это происходит, путем корректировки концентраций CHIR99021 и начальной начальной плотности. Если очистка СМ нуждается в улучшении, могут быть использованы другие методы, такие как сортировка для КМ с флуоресцентной активацией сортировки клеток (FACS) или магнитно-активированной сортировки ячеек (MACS)30,31,32. Препарат коллагенаПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте коллаген из высокой концентрации коллагенового запаса (в пределах 8-11 мг/мл). Коллаген, используемый для создания смеси клетки: гидрогель, составляет 6 мг / мл, а конечная концентрация составляет 2 мг / мл. В зависимости от количества устройств для инъекции, объем коллагенового раствора, который должен быть сделан, должен быть снова рассчитан. Храните все необходимые реагенты на льду внутри вытяжки биобезопасности.ПРИМЕЧАНИЕ: Коллаген представляет собой термореагнитный гидрогель. Поэтому температура должна оставаться низкой, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию. Возьмите 75 мкл коллагена (8 мг/мл) и раздайте его в микроцентрифужную трубку на льду. Раствор коллагена очень вязкий, поэтому медленно аспирировать его пипеткой. Возьмите 13,85 мкл среды (т.е. RPMI + B27 + инсулин) и дозируют ее в той же пробирке. Затем берут 10 мкл фенола красного цвета, добавляют в смесь и повторно суспендировали. Наконец, возьмите 1,15 мкл 1N NaOH и добавьте к суспензии. Используя наконечник пипетки 200 мкл, повторно суспензию.ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковый коллаген имеет кислый рН, что требует добавления NaOH для нейтрализации перед использованием его для инкапсуляции сердечных клеток. Фенол красный действует как показатель рН; поэтому добавьте это перед добавлением NaOH. В этот момент раствор коллагена будет желтым, обозначающим его кислотность. После добавления NaOH раствор должен превратиться из оранжевого в светло-розовый, что свидетельствует о его нейтрализации. Гидрогелевая смесь и клеточный препаратПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе выполняется инкапсуляция клеток в гидрогеле на основе коллагена. Клетки, как и все предшественники гидрогеля, должны быть помещены на лед во время следующих этапов. На этом этапе, если ХФ еще не были трипсинизированы, храните суспензию СМ в центрифуге 15 мл с открученной крышкой, чтобы обеспечить поток газа, в инкубаторе с 37 °C. Параллельно диссоциируют КС и собирают при плотности 75 х 106 ячеек/мл для загрузки устройства. Смешайте взвешенные СМ с КФ в соотношении 4:1. Возьмите аликвоту в 8 мкл КМ и добавьте в свежую центрифужную трубку на льду. Затем берут 2 мкл ХФ и добавляют к ячейке суспензию в трубке центрифуги. Повторно суспендируют клеточную суспензию, возьмите 5,6 мкл клеточной суспензии и поместите ее в свежую микроцентрифужную трубку. Возьмите 4 мкл коллагена, только что приготовленного на вышеуказанных этапах, и добавьте в смесь 4: 1 СМ: CF. Добавьте 2,4 мкл матрицы базальной мембраны с пониженным фактором роста (СКФ), сделав конечную плотность клеток 35 х10 6 клеток / мл для инъекции устройства. Пипетка смеси вверх и вниз, чтобы убедиться, что клеточная суспензия однородна. Вставка устройстваПРИМЕЧАНИЕ: После того, как смесь ячеек: гидрогель подготовлена, ее необходимо вставить в устройства. Возьмите автоклавные микрофлюидные устройства из печи с температурой 80 °C и установите их в шкаф биобезопасности не менее чем на 1 ч до введения клеточной суспензии, чтобы устройства остыли до комнатной температуры при сохранении стерильности. Поместите приборы в чашки Петри 60 х 15 мм, по 3-4 устройства на чашку. Наполните чашку Петри 150 x 15 мм тонким слоем DI H2O, чтобы вместить 3 из чаш Петри 60 x 15 мм. Этот шаг создает увлажненную среду, окружающую микрофлюидные устройства. Используйте новый наконечник и тщательно суспендирование смеси ячейки: гидрогеля путем пипетки суспензии, пока трубка остается на льду. Вставьте наконечник в инъекционный порт устройства и медленно и неуклонно вводят 3 мкл клеточной:гидрогелевой суспензии в область ткани на входе микрофлюидного устройства с помощью наконечника пипетки 20 мкл. Как только порт заполнен, остановите инъекцию и извлеките наконечник. Повторить для всех устройств или всей приготовленной гидрогелевой суспензии.ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшой объем ячейки: суспензия гидрогеля нагревается / охлаждается очень быстро, поэтому уместно держать суспензию на льду как можно дольше. При вставке пипетку раствора со льда и вставляют в устройства как можно быстрее, так как гидрогель может начать полимеризоваться в наконечнике пипетки. Важно создавать небольшие объемы клеточной: гидрогелевая суспензия за раз, поэтому, если вводится много устройств, суспензия ячейки: гидрогель должна быть сделана свежей для каждого набора из 4 устройств. Переверните устройства в чашки Петри пинцеем и поместите их в большую чашку Петри с водой. Инкубировать в инкубаторе при 37 °C в течение 9 мин для полимеризации гидрогеля. Выньте устройства из инкубатора, переверните устройства в вертикальном положении и инкубируете при 37 °C в течение 9 мин до полной полимеризации гидрогеля. Вводят RPMI + B27 + инсулин во фланкинговые медиаканалы (~20 мкл на устройство). Поместите устройства обратно в инкубатор при 37 °C. Меняйте медиа в медиаканалах свежим RPMI + B27 + инсулин каждый день. Было продемонстрировано, что устройства культивированы от 14-21дня 20.ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за небольшого объема среды на чип, чтобы предотвратить испарение среды, важно поддерживать устройства в большой чашке Петри, заполненной DI H2O, которая служит увлажненной камерой. Кроме того, небольшие капли избытка RPMI + B27 + инсулина могут быть пипетированы на верхней части входов / выходов канала во время рутинных изменений среды. 4. Анализ тканей Визуализация в реальном времениПРИМЕЧАНИЕ: Все живые изображения должны выполняться с помощью сценического инкубатора для поддержания 37 °C и 5% CO2. Поместите устройства в экологически контролируемый сценический инкубатор. Записывайте 30-с видео нескольких точек внутри каждого устройства с максимальной частотой кадров. Чтобы оценить сократимость тканей после извлечения сигналов биения, используйте дополнительный специально написанный код MATLAB для извлечения пиков(Дополнительный файл 2)для расчета вариабельности интервала между ударами. Измените жижи в устройствах в вытяжке клеточной культуры, а затем поместите обратно в инкубатор клеточной культуры. Иммунофлуоресцентное окрашивание Приготовить PBS-глицин: растворить глицин 100 мМ в PBS и добавить 0,02% NaN3 для длительного хранения. Отрегулируйте pH до 7,4. Подготовьте PBS-Tween-20: добавьте 0,05% Tween-20 в PBS и добавьте 0,02% NaN3 для длительного хранения. Отрегулируйте pH до 7,4. Подготовка буфера ПЧ: добавьте в PBS 0,2% Triton X-100, 0,1% BSA и 0,05% Tween-20 и добавьте 0,02% NaN3 для длительного хранения. Отрегулируйте pH до 7,4. Приготовьте 10% козьей сыворотки: повторно суспендировать лиофилизированную козью сыворотку в 2 мл PBS, чтобы получить 100% козью сыворотку. Затем разбавьте 2 мл 18 мл PBS, чтобы получить 10% козьей сыворотки. Зафиксируйте образцы, добавив 4% параформальдегида (PFA) в тканевые каналы и инкубируя при 37 °C в течение 20 мин. Промыть клетки, добавив PBS-Глицин в тканевые каналы 2x в течение 10 мин инкубации при комнатной температуре. Промыть ячейки, добавив PBS -Tween-20 в течение 10 мин при комнатной температуре. Пермеабилизируют клетки, добавляя буфер ПЧ в тканевые каналы в течение 30 мин при комнатной температуре. Блокируют клетки, добавляя 10% раствор козьей сыворотки в тканевые каналы в течение 1 ч при комнатной температуре. Разбавляют неконъюгированные первичные антитела в 10% козьей сыворотке при желаемых концентрациях (см. Дополнительный файл 3),добавляют в тканевые каналы и инкубируют образцы при 4 °C в течение ночи. На следующий день промывайте образцы, добавляя PBS-Tween-20 в тканевые каналы 3x в течение 20 минут каждый при комнатной температуре.ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с шага 4.2.12 включительный, выполняйте все задачи в темноте, чтобы образцы были защищены от света. Разводят вторичные антитела в PBS-Tween-20 в нужных концентрациях, центрифугу при 10 000 х г в течение 10 мин для сбора любых осадков, затем добавляют в тканевые каналы. Через 30 мин-1 ч промыть образцы PBS-Tween-20 3x в течение 10 мин каждый при комнатной температуре. Добавьте анти-выцветающей или желаемую монтажную среду к тканевым каналам. Затем образцы могут быть визуалированы с помощью флуоресцентной микроскопии или конфокального микроскопа, если желательно более высокое увеличение. Чтобы визуализировать всю 3D-ткань, изображения в разных z-плоскостях могут быть сложены и реконструированы для формирования репрезентативных 3D-изображений.

Representative Results

Для получения высокоочищеной популяции КМ из hiPSCs используется модифицированная версия, включающая комбинацию протокола дифференциацииЛиан 33 и этапов очистки Тохьямы34 (см. Фиг.1A для экспериментальной временной шкалы). HiPSCs должны быть колониео…

Discussion

Формирование модели сердечной ткани человека in vitro с усиленными клеточными взаимодействиями и биомиметической 3D-структурой является обязательным для фундаментальных сердечно-сосудистых исследований и соответствующих клинических применений^1. Этот описанный проток…

Materials

0.65 mL centrifuge tubes	VWR	87003-290
1 mm Biopsy punch	VWR	95039-090
1.5 mm Biopsy punch	VWR	95039-088
15 mL Falcon tubes	VWR	89039-670
18x18mm coverslips	VWR	16004-308	The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging
4% paraformaldehyde	ThermoFisher	101176-014
6-well flat botttom tissue-culture plates	VWR	82050-844
B27 minus insulin	LifeTech	A1895602
B27 plus insulin	LifeTech	17504001
CHIR99021	VWR	10188-030
Collagen I, rat tail	Corning	47747-218
DMEM F12	ThermoFisher	11330057
DPBS	ThermoFisher	21600069
E8	ThermoFisher	A1517001	can also be made in house
EDTA	VWR	45001-122
Ethanol
FGM3	VWR	10172-048
GFR-Matrigel	VWR	47743-718
Glycine	Sigma	G8898-500G
Goat serum	VWR	10152-212
hESC-Matrigel	Corning	BD354277
IPA
IWP2	Sigma	I0536-5MG
Kimwipes	VWR	82003-820
MTCS	Sigma	440299-1L
NaN3	Sigma	S2002-25G
NaOH	Sigma	S5881-500G
Pen/Strep	VWR	15140122
Petri dish (150x15mm)	VWR	25384-326
Petri dish (60x15mm)	VWR	25384-092
Phenol Red	Sigma	P3532-5G
RPMI 1640	ThermoFisher	MT10040CM
RPMI 1640 minus glucose	VWR	45001-110
Silicon Wafers (100mm)	University Wafer	1196
Sodium lactate	Sigma	L4263-100ML
SU8 2075	Microchem	Y111074 0500L1GL
SU8 Developer	ThermoFisher	NC9901158
Sylgard Elastomer	Essex Brownell	DC-184-1.1
T75 flasks	VWR	82050-856
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
TrypLE	ThermoFisher	12604021
Trypsin-EDTA (0.5%)	ThermoFisher	15400054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Y-27632	Stem Cell Technologies	72304
EVG620 Aligner	EVG
Plasma cleaner PDC-32G	Harrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 microscope	Nikon
Leica SP8 Confocal microscope	Leica