Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модель экспериментального стеатоза in vitro:культура клеток гепатоцитов в липидной среде, обусловленной перегрузкой

7.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62543

⸱

18 мая 2021 г.

 , 
1Laboratorio de Hígado, Páncreas y Motilidad, Unidad de Medicina Experimental, Facultad de Medicina-UNAM, Hospital General de México “Dr. Eduardo Liceaga”

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол предназначен для изучения стеатоза и молекулярных, биохимических, клеточных изменений, вызванных чрезмерным воздействием липидов in vitro нагепатоциты.

Аннотация

Метаболическая дисфункция,связанная с жировой болезнью печени (МАЖБП), ранее известная как неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП), является наиболее распространенным заболеванием печени во всем мире из-за его связи с ожирением, диабетом 2 типа и дислипидемией. Стеатоз печени, накопление липидных капель в паренхиме печени, является ключевым признаком заболевания, предшествующего воспалению, наблюдаемому при стеатогепатите, фиброзе и конечной стадии заболевания печени. Накопление липидов в гепатоцитах может мешать правильному метаболизму ксенобиотиков и эндогенных молекул, а также индуцировать клеточные процессы, ведущие к прогрессированию заболевания. Хотя экспериментальное исследование стеатоза может быть выполнено in vivo,подходы in vitro к изучению стеатоза являются дополнительными инструментами с различными преимуществами. Культура гепатоцитов в среде, обусловленной перегрузкой липидов, является отличным воспроизводимым вариантом для изучения стеатоза печеночной области, позволяя идентифицировать клеточные процессы, связанные с накоплением липидов, такие как окислительные и ретикулярные стрессы, аутофагия, пролиферация, гибель клеток и т. Д., А также другие испытания, включая эффективность лекарств, и токсикологическое тестирование, среди многих других возможных применений. Здесь было направлено на описание методики культивирование клеток гепатоцитов в липидной среде, обусловленной перегрузкой. Клетки HepG2 культивировали в среде RMPI 1640, кондиционированной пальмитатом натрия и олеатом натрия. Важно отметить, что соотношение этих двух липидов имеет решающее значение для благоприятство накоплению липидных капель, сохраняя при этом пролиферацию клеток и умеренную смертность, как это происходит в печени во время заболевания. Показана методика приготовления запасов липидного раствора, смеси, добавления в среду и культуры гепатоцитов. С помощью этого подхода можно идентифицировать липидные капли в гепатоцитах, которые легко наблюдаются при окрашивание Oil-red O, а также кривые показателей пролиферации / смертности.

Введение

Жировая дистрофия печени, связанная с метаболической дисфункцией, широко распространена во всем мире1,2; по оценкам, до 25% населения страдает3. Это заболевание, ранее известное как неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП), обновило свою номенклатуру к метаболической дисфункции, связанной с жировой болезнью печени (МАЖБП), чтобы точно отразить патогенез, связанный с ожирением, резистентностью к инсулину, диабетом 2 типа и дислипидемией, а также возможные методы лечения заболевания3,4.

Независимо от названия, заболевание включает в себя широкий спектр гистопатологических изменений, характеризующихся аномально высоким накоплением липидов в печени (>5% жира в гепатоцитах5)и может прогрессировать через накопление липидов, обычно встречающееся при простом стеатозе, до стеатогепатита, что, в свою очередь, может привести к развитию фиброза, цирроза, гепатоцеллюлярная карцинома и печеночная недостаточность5,6,7,8. Ожидается, что из-за его растущей распространенности МАЖБП станет первым признаком трансплантации печени и основной причиной гепатоцеллюлярной карциномы9.

Хотя он считается доброкачественной или легкой формой жировой болезни печени, стеатоз печени на самом деле является метаболическим ключом в MAFLD10. Различные метаболические пути зависят от накопления липидов в печени, включая, но не ограничиваясь, синтезом, экспортом и метаболизмом липидов10. Инсулинорезистентность, окислительный стресс, ретикулярный стресс и клеточная дисфункция тесно связаны с печеночной липотоксичностью11,12. С другой стороны, жировые гепатоциты являются мишенью активных форм кислорода, претворяя метаболиты в виде перекисей липидов, белковых карбонилов и аддуктов нуклеиновых кислот13. На клеточном уровне жировые гепатоциты могут подвергаться митохондриальному повреждению14,клеточному старению15,апоптозу16,пироптозу12и аутофагии17,среди других событий.

Гепатоциты высоко отвечают за метаболизм, детоксикацию и синтез широкого спектра молекул. Многие из этих функций могут быть скомпрометированы накоплением липидов, наблюдаемым при стеатозе. Поэтому очень важно иметь воспроизводимые инструменты, позволяющие точно оценить стеатоз. В этом смысле модели in vitro легко применимы и воспроизводимы. Стеатоз in vitro использовался с различными целями16,18,19. Клетки HepG2 широко используются в качестве клеточной линии гепатоцитов. Он имеет такие преимущества, как легкость в культуре и хорошая характеристика. Пожалуй, единственным недостатком клеток HepG2 является тот факт, что это канцерогенная клеточная линия, поэтому это необходимо учитывать при анализе исходов. Здесь показано применение смеси жирных кислот, широко используемых в клеточной культуре: пальмитиновой кислоты (ПА) и олеиновой кислоты (ОА). И PA, и OA предлагают разные результаты в культуре20. ПА (С 16:0) является наиболее распространенной насыщенной жирной кислотой, получаемой из рациона16. ПА рассматривается как биомаркер де-ново липогенеза,важнейшего шага в развитии НАЖБП21. Показано, что ПА высокотоксична22; поэтому может быть не рекомендуется индуцировать стеатоз in vitro. ОА (C 18:1) является мононенасыщенной жирной кислотой. В отличие от ПА, было высказано предположение, что ОА обладает противовоспалительными и антиоксидантными свойствами, будучи способным противодействовать ПА12. Как ПА, так и ОА являются основными жирными кислотами, присутствующими в триглицеридах, независимо от состояния здоровья или заболевания16. В таблице 1 приведены примеры культуры гепатоцитов с ПА, ОА и их смесью, а также результаты, о которыхсообщается12,23,24,25,26,27. Другие жирные кислоты также использовались в культуре гепатоцитов, включая стеариновую кислоту (C 18:0)28,29,30,линолевую кислоту (C18:1) 28,30,31 и ее конъюгаты (CLA)28,32,пальмитолеиновую кислоту (C 16:1)29. Тем не менее, их использование реже всего сообщается в литературе, возможно, потому, что их печеночное изобилие ниже, чем PA и OA16.

В сочетании обе жирные кислоты напоминают стеатоз in vitro,обеспечивая пролиферируя клетки, с повышенной гибелью клеток и более низкой жизнеспособностью по сравнению с контрольными условиями. Стоит отметить, что соответствующие соли этих жирных кислот доступны и могут быть использованы. Одна из основных проблем при оценке липидной перегрузки в культуре клеток гепатоцитов приведена в дифференциации токсикологических моделей и модели, наилучшим образом представляющей стеатоз. Многие модели можно отнести в первом случае. Фактически, использование только ПА можно рассматривать среди них, и высокая смертность является наиболее очевидным исходом12,16,23,24,25,26,27. Применение высоких доз даже в случае ОА также можно рассматривать как токсикологическую модель. Показанный здесь протокол находится в более высоком соответствии с развитием стеатоза, поскольку он показывает низкую смертность по сравнению с той, которая наблюдается в других моделях, и позволяет соблюдать его в течение нескольких дней с прогрессирующим накоплением липидов, как это происходит при НАЖБП. Возможность оценить легкий и тяжелый стеатоз через экспериментальные условия считается еще одним преимуществом.

Жирные кислотыУсловияРезультатыСсылка
ПАПАКонцентрация: 200 мкМНакопление липидовЯн и др., 201925.
Время экспозиции: 24 чПовреждение гепатоцитов
Возвышение трансаминаз
ПАПАКонцентрация: 50, 100 и 200 мкМНакопление липидовXing et al, 201924.
Время экспозиции: 24 ч
ПАПАКонцентрация: 250 мкМ, 500 мкМ, 750 мкМ и 1 000 мкМНакопление липидовWang et al, 202026.
Время экспозиции: 24 чПрогрессивное снижение жизнеспособности клеток
Смесь ОА/ПАКонцентрация: 1 мМНакопление липидовXiao et al, 202027.
Время экспозиции: 24 чНе сообщает о липотоксичности
Скорость: 2OA: 1PA
Смесь ОА/ПАПервая стимуляция 200 мкМ и 400 мкМ ПА, а затем вторая стимуляция 200 мкМ ОАНакопление липидов.Цзэн и др., 202012.
Концентрация:400 мкМ ПА: 200 мкМ ОАДоказательства липотоксичности, индуцированной ПА, были уменьшены стимуляцией ОА.
Скорость: 2PA: 1OA
Время экспозиции: 24 ч
Смесь ОА/ПАКонцентрация: 400 мкМ ПА: 200 мкМ ОАНакопление липидовChen et al, 201823.
Скорость: 2PA: 1OA
Время экспозиции: 24 ч
Смесь ОА/ПАКонцентрация:50 и 500 мкМГенерация двух типов стеатоза: легкого стеатоза и
тяжелый стеатоз.		Кампос и Гусман 2021
Скорость: 2PA: 1OAМоделирует хроническую экспозицию липидной перегрузки
Время экспозиции: 24 ч, 2 дня, 3 дня и 4 дня.

Таблица 1. Культура гепатоцитов в стеатогенных условиях. В таблице представлен тип используемой жирной кислоты, поддерживаемые условия и наблюдаемые результаты в культуре гепатоцитов. О.А.: Пальмитиновая кислота. ОА: Олеиновая кислота.

Наконец, эта модель применима не только к изучению стеатоза и жировой дистрофии печени, но и к печеночному метаболическому, синтетическому и детоксикационному пути в контексте стеатоза. Кроме того, индуцированный стеатоз in vitro может предоставить доказательства для идентификации потенциальных маркеров заболевания, а также терапевтических целей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Стандартная и кондиционированная подготовка среды

  1. Для приготовления стандартного RPMI 1640 добавляем питательную среду RPMI 1640 10% (v/v) фетальной бычий сыворотки (FBS, предварительно инактивированную тепло) и 1% (v/v) раствора пенициллина-стрептомицина. Хранить среду при 4 °C.Стерилизуйте с помощью фильтров 0,22 мкм.
  2. Для приготовления раствора пальмитата готовят раствор пальмитата 50 мМ в стандартном RPMI 1640, предварительно дополненном 1% бычим сывороточным альбумином (без липидов). Достаточно будет объема в 5-10 мл этого запаса. Стерилизуйте раствор с помощью фильтров 0,22 мкм. Хранить при 4 °C защищенным от света до 1 месяца.
  3. Для приготовления раствора олеата готовят раствор олеата 50 мМ в стандартном RPMI 1640, предварительно дополненном 1% бычим сывороточным альбумином (без липидов). Достаточно будет объема в 10 мл. Стерилизуйте раствор с помощью фильтров 0,22 мкм. Хранить при -20 °C защищенным от света до 1 месяца.
  4. Для приготовления стеатогенной среды из предварительно приготовленных бульев готовят 1-частную пальмитат: 2-х части олеатную стеатогенную среду на двух возможных уровнях: легком и тяжелом стеатозе.
    1. Легкий стеатоз: Приготовьте 100 мл смеси из 1 части пальмитата: 2 части олеата (50 мкМ) в стандартном RPMI 1640. Стерилизуйте с помощью фильтров 0,22 мкм. Хранить при 4 °C до 1 недели.
    2. Тяжелый стеатоз: Приготовьте 100 мл 1-части пальмитата: 2-х части олеата (500 мкМ) смеси в стандартном RPMI 1640. Стерилизуйте с помощью фильтров 0,22 мкм. Хранить при 4 °C до 1 недели.
    3. Альтернативная подготовка для стоковых растворов.
      1. Приготовьте оба стоковых раствора, используя соответствующие жирные кислоты, используя свободный липидный альбумин, как указано выше.
      2. При недостатке свободного липидного альбумина используют пальмитатные и олеатные соли.
        1. Растворить либо пальмитат, либо олеат в 2 мл абсолютного этанола, а затем смешать в конечном объеме стандартного RPMI 1640 (5-10 мл). Растворяют олеат непосредственно путем перемешивания в стандартной питательной среде RPMI 1640.
        2. Допускать испарение этанола путем инкубации на водяной бане при 70 °C; тщательно перемешать.
      3. В каждом случае стерилизуйте оба стоковых раствора с помощью фильтров 0,22 мкм. Хранить раствор пальмитата при 4 °C и раствор олеата при - 20 °C. Защитите оба решения от света. Эти растворы стабильны в течение 1 месяца.

2. Докультура

  1. Посеять 100 000 клеток HepG2 на скважину в 24-скважинную пластину. Добавьте 1 мл стандарта RPMI 1640.
  2. Предварительно инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 ч, что позволяет прикреплять клетки.

3. Стеатогенная культура

  1. После предварительной культивки отбросьте стандартную среду RPMI 1640 и добавьте соответственно стеатогенную среду.
  2. Выбросьте супернатант и добавляйте свежую стеатогенную среду каждые 24 ч.

4. Оценка жизнеспособности и смертности

  1. Посеять 100 000 клеток HepG2 на скважину в 24-скважинную пластину. Добавьте 1 мл стандарта RPMI 1640.
  2. Предварительно инкубировать в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO2.
  3. Замените стандарт rpmI 1640 на стеатогенную среду.
  4. Инкубировать в течение 24 ч, 2 дней, 3 дней и 4 дней, обновляя стеатогенную среду каждые 24 ч.
  5. По истечении соответствующего времени выбросьте супернатант.
  6. Отсоедините клетки от скважины, добавив 500 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА. Инкубировать в течение 5 мин при 37 °C и 5% CO2.
  7. Соберите повторно суспендированные клетки в микропробирку.
  8. Центрифуга при 300 х г и выбросьте супернатант.
  9. Добавьте 200 мкл стандартного RPMI 1640 и повторно суспендируете ячейки.
  10. Добавить 15 мкл 0,4% раствора трипана синего в свежую микропробирку. Смешать с 15 мкл предыдущей клеточной суспензии.
  11. Подсчитайте окрашенные и неокраженные клетки в гемоцитометре.
  12. Рассчитайте показатели жизнеспособности и смертности соответственно.
    Жизнеспособность =
    figure-protocol-1
    Смертность =
    figure-protocol-2

5. Липидное окрашивание маслом Red O

  1. Поместите крышку клеточной культуры в каждую скважину в 24-скважинной пластине.
  2. Посеять 100 000 клеток HepG2 на скважину. Добавьте 1 мл стандарта RPMI 1640.
  3. Предварительно инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 ч.
  4. Замените стандарт rpmI 1640 на стеатогенную среду.
  5. Инкубировать в течение 24 ч, 2 дней, 3 дней и 4 дней, освежая стеатогенную среду каждые 24 ч.
  6. По истечении соответствующего времени выбросьте супернатант.
  7. Промыть 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Выбросьте супернатант.
  8. Фиксировать с 1 мл 4% параформальдегида в PBS.
  9. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
  10. Отбросьте избыток параформальдегида.
  11. Промыть клетки 1 мл дистиллированной воды.
  12. Добавить 1 мл 70% изопропанола и инкубировать в течение 5 мин.
  13. Отбросьте избыток изопропанола. На данном этапе стирка PBS не требуется.
  14. Добавить 1 мл раствора Oil-red O и инкубировать в течение 30 мин.
  15. Отбросьте избыток раствора масло-красного О.
  16. Промыть 1 мл дистиллированной воды.
  17. Добавьте 500 мкл раствора гематоксилина. Инкубировать в течение 3 мин.
  18. Отбросьте избыток раствора гематоксилина.
  19. Промыть 1 мл дистиллированной воды.
  20. Наблюдать под микроскопом с увеличением 400х (Объектив 40х, Глаз 10х).

6. Морфометрическая оценка содержания липидов

  1. Случайным образом выберите и сфотографируйте 10 оптических полей со всей площади скважины. Повторите для каждой скважины.
  2. Оцените процент окрашенной в красный цвет области с помощью инструмента «Порог цвета» в программном обеспечении ImageJ в соответствии с Ferreira и Rasband33.
  3. Сравните окрашенную область с полной площадью оптического поля с помощью инструмента «Анализ частиц» в программном обеспечении ImageJ в соответствии с Ferreira и Rasband33.
  4. Рассчитайте средний процент каждой скважины.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Гепатоциты, культивируется в стеатогенной среде, демонстрируют рост по всей поверхности колодца; однако жировые гепатоциты показывают более низкую скорость роста по сравнению с клетками, культивируемыми в контрольной среде. Предлагаемое соотношение и концентрация ОА и ПА, гарантируют выживание клеток во время культивирования. Посев 1 х 105 ячеек на скважину в 24-скважинных пластинах обеспечивает оптимальное слияние, как показано на рисунке 1.

Жизнеспосо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол предназначен для обеспечения стратегии изучения стеатоза in vitro. Клеточная культура является мощным инструментом для изучения клеточных, молекулярных, биохимических и токсикологических аспектов клеток, подвергающихся воздействию различных условий. При таком подходе стеатоз можно визуализировать не только как стадию сложного заболевания, которым является МАЖБП, но и как чрезмерное воздействие липидов гепатоцитов и возможные исходы, возникающие в результате такого воздействия. Поэтому его применени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа финансировалась Национальной национальной консилией науки и технологии (Conacyt, CB-221137). Адриана Кампос является докторантом в Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, и была поддержана Conacyt (CVU: 1002502).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шкаф биобезопасностиESCO AirstreamAC2-452+C2:C26Класс II  Тип A2  Шкаф биологической безопасности
Бутылочный фильтрCorning, US430513  Непирогенный, полистироловый, стерильный. 1 фильтр/мешок. 0,22 μ м, 500 мл.
Сыворотка крупного рогатого скота albimun (BSA)Gold Biotechnology, USA-421-10BSA Жирные кислоты без жирных кислот для клеточных культур
Питательные среды RPMI 1640ThermoFisher-Gibco, US31800-022-Фетальная
бычья сыворотка (FBS)ThermoFisher-Gibco, US
A4766801-гемоцитометрMarienfeld, DE640010-HepG2
клеточная линияATCC, USHB-8065Гепатоцеллюлярная карцинома клетки человека.
Увлажнённый инкубаторThermo Electronic Corporation, СШАМодель: 3110Температура (37 °°; C ± 1 ° C), влажность (90% ± 5%), CO2 (5% ± 1%)
Инвертированный микроскоп EclipseNIKON, JPNМодель: TE2000-S-Isopropanol
Sigma-Aldrich, USI9030-4L-Oil
Red O KitAbcam, USab150678Набор для гистологической визуализации нейтрального жира.
ПараформальдегидSigma-Aldrich, USP6148-500G-пенициллин
/стрептомицинThermoFisher-Gibco, US15140-122антибиотики 10 000 ед/мл пенициллина, 10 000 мкм; г/мл стрептомицина
pH-метрBeckman, СШАМодель: 360 PH/Temp/MV
Метр-фосфат буферизованный физиологический растворThermoFisher-Gibco, US10010-023-Серологические
пипеткиSarstedt, AUS86.1253.001  Непирогенный, стерильный, 5 мл
серологических пипетокSarstedt, AUS  86.1254.001  Непирогенный, стерильный, 10 мл
бикарбоната натрияSigma-Aldrich, USS5761-1KGПриготовление питательных сред
Олеат натрияSanta Cruz Biotechnology, USsc-215879A-Пальмитат
натрияSanta Cruz Biotechnology, USsc-215881-Шассирный
фильтрCorning, US431219  Пирогенный, стерильный, 28 мм, 0,2 мкм.
Trypan BlueSigma-Aldrich, UST6146-25G-Трипсин
0,05% /EDTA 0,53 мМCorning, US25-052-Cl-24
луночный кластер клеточных культурCorning, US3524Плоское дно с крышкой. Культура тканей обработана. Непирогенный, полистирол, стерильный. 1/Упаковка.
96 луночный кластер клеточных культурCorning, US3599Плоское дно с крышкой. Культура тканей обработана. Непирогенный, полистирол, стерильный. 1/Упаковка.

Ссылки

  1. Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease - a global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
  2. Younossi, Z., et al. Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 69 (6), 2672-2682 (2019).
  3. Eslam, M., et al. A new definition for metabolic dysfunction-associated fatty liver disease: An international expert consensus statement. Journal of Hepatology. 73 (1), 202-209 (2020).
  4. Eslam, M., Sanyal, A. J., George, J. MAFLD: A consensus-driven proposed nomenclature for metabolic associated fatty liver disease. Gastroenterology. 158 (7), 1999-2014 (2020).
  5. Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American association for the study of liver diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
  6. Calzadilla Bertot, L., Adams, L. A. The natural course of non-alcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Science. 17 (5), 774(2016).
  7. Reccia, I., et al. Non-alcoholic fatty liver disease: A sign of systemic disease. Metabolism. 72, 94-108 (2017).
  8. Tomita, K., et al. Free cholesterol accumulation in hepatic stellate cells: Mechanism of liver fibrosis aggravation in nonalcoholic steatohepatitis in mice. Hepatology. 59 (1), 154-169 (2014).
  9. Byrne, C. D., Targher, G. Nafld: A multisystem disease. Journal of Hepatology. 62, 1 Suppl 47-64 (2015).
  10. Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. Molecular mechanisms of hepatic lipid accumulation in non-alcoholic fatty liver disease. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (18), 3313-3327 (2018).
  11. Diehl, A. M., Day, C. Cause, pathogenesis, and treatment of nonalcoholic steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
  12. Zeng, X., et al. Oleic acid ameliorates palmitic acid induced hepatocellular lipotoxicity by inhibition of ER stress and pyroptosis. Nutrition and Metabolism. 17, London. 11(2020).
  13. Ore, A., Akinloye, O. A. Oxidative stress and antioxidant biomarkers in clinical and experimental models of non-alcoholic fatty liver disease. Medicina (Kaunas). 55 (2), 26(2019).
  14. Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. Oxidative stress, cardiolipin and mitochondrial dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 20 (39), 14205-14218 (2014).
  15. Aravinthan, A., et al. Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease. Journal of Hepatology. 58 (3), 549-556 (2013).
  16. Gomez, M. J., et al. A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis. Chemico Biological Interactions. 165 (2), 106-116 (2007).
  17. Wu, W. K. K., Zhang, L., Chan, M. T. V. Autophagy, NAFLD and NAFLD-related HCC. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1061, 127-138 (2018).
  18. Levy, G., Cohen, M., Nahmias, Y. In vitro cell culture models of hepatic steatosis. Methods in Molecular Biology. 1250, 377-390 (2015).
  19. Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Science. 14 (6), 11963-11980 (2013).
  20. Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
  21. Lee, Y., et al. Serial biomarkers of de novo lipogenesis fatty acids and incident heart failure in older adults: The cardiovascular health study. Journal of the American Heart Association. 9 (4), 014119(2020).
  22. Alnahdi, A., John, A., Raza, H. Augmentation of glucotoxicity, oxidative stress, apoptosis and mitochondrial dysfunction in Hepg2 cells by palmitic acid. Nutrients. 11 (9), 1979(2019).
  23. Chen, X., et al. Oleic acid protects saturated fatty acid mediated lipotoxicity in hepatocytes and rat of non-alcoholic steatohepatitis. Life Sciences. 203, 291-304 (2018).
  24. Xing, J. H., et al. NLRP3 inflammasome mediate palmitate-induced endothelial dysfunction. Life Sciences. 239, 116882(2019).
  25. Yan, H., et al. Insulin-like Growth Factor Binding Protein 7 accelerates hepatic steatosis and insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 46 (12), 1101-1110 (2019).
  26. Wang, J., Hu, R., Yin, C., Xiao, Y. Tanshinone IIA reduces palmitate-induced apoptosis via inhibition of endoplasmic reticulum stress in Hepg2 liver cells. Fundamental and Clinical Pharmacology. 34 (2), 249-262 (2020).
  27. Xiao, Z., Chu, Y., Qin, W. IGFBP5 modulates lipid metabolism and insulin sensitivity through activating ampk pathway in non-alcoholic fatty liver disease. Life Sciences. 256, 117997(2020).
  28. Avila, G., et al. In vitro effects of conjugated linoleic acid (CLA) on inflammatory functions of bovine monocytes. Journal of Dairy Science. 103 (9), 8554-8563 (2020).
  29. Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 12093-12101 (2006).
  30. Oh, J. M., et al. Effects of palmitic acid on TNF-alpha-induced cytotoxicity in SK-Hep-1 cells. Toxicology In Vitro: An International Journal Published in Association with BIBRA. 26 (6), 783-790 (2012).
  31. Stellavato, A., et al. In vitro assessment of nutraceutical compounds and novel nutraceutical formulations in a liver-steatosis-based model. Lipids in Health and Disease. 17 (1), 24(2018).
  32. Pachikian, B. D., et al. Implication of trans-11, trans-13 conjugated linoleic acid in the development of hepatic steatosis. PLoS One. 13 (2), 0192447(2018).
  33. Ferreira, T., Rasband, W. Analyze. ImageJ User Guide. , Ch. 30 132-135 (2012).
  34. Geng, Y., Wu, Z., Buist-Homan, M., Blokzijl, H., Moshage, H. Hesperetin protects against palmitate-induced cellular toxicity via induction of GRP78 in hepatocytes. Toxicology and Applied Pharmacology. , 404(2020).
  35. Geng, Y., et al. Protective effect of metformin against palmitate-induced hepatic cell death. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1866 (3), 165621(2020).
  36. Sarnyai, F., et al. Effect of cis- and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Science. 21 (7), 2626(2020).
  37. Chen, J. W., et al. Tetrahydrocurcumin ameliorates free fatty acid-induced hepatic steatosis and improves insulin resistance in HepG2 cells. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (3), 1075-1085 (2018).
  38. Burhans, M. S., et al. Hepatic oleate regulates adipose tissue lipogenesis and fatty acid oxidation. Journal of Lipid Research. 56 (2), 304-318 (2015).
  39. Abenavoli, L., Milanovic, M., Milic, N., Luzza, F., Giuffre, A. M. Olive oil antioxidants and non-alcoholic fatty liver disease. Expert Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 13 (8), 739-749 (2019).
  40. Nagarajan, S. R., et al. Lipid and glucose metabolism in hepatocyte cell lines and primary mouse hepatocytes: A comprehensive resource for in vitro studies of hepatic metabolism. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 316 (4), 578-589 (2019).
  41. Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Стеатоз печениокрашивание Oil-Red Oклетки HepG2стеатогенная средасмесь пальмитата и олеатаанализ жизнеспособности клетоквнутриклеточные липидные каплианализ в ImageJ
Модель экспериментального стеатоза in vitro:культура клеток гепатоцитов в липидной среде, обусловленной перегрузкой
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.