RIBO-seq in Bacteria: коллекция образцов и протокол подготовки библиотеки для секвенирования NGS

Summary

Здесь мы опишем этапы отбора проб и подготовки к RIBO-seq у бактерий. Секвенирование библиотек, подготовленных в соответствии с этими руководящими принципами, приводит к получению достаточных данных для всестороннего биоинформатического анализа. Протокол, который мы представляем, прост, использует стандартное лабораторное оборудование и занимает семь дней от лизиса до получения библиотек.

Abstract

Метод профилирования рибосом (RIBO-seq) в настоящее время является наиболее эффективным инструментом для изучения процесса синтеза белка in vivo. Преимуществом этого метода, по сравнению с другими подходами, является его способность контролировать трансляцию путем точного отображения положения и количества рибосом на транскрипте мРНК.

В этой статье мы опишем последовательные этапы сбора проб и подготовки к методу RIBO-seq у бактерий, выделив детали, имеющие отношение к планированию и выполнению эксперимента.

Поскольку RIBO-seq опирается на интактные рибосомы и связанные с ними мРНК, ключевым шагом является быстрое ингибирование трансляции и адекватный распад клеток. Таким образом, мы предлагаем фильтрацию и мгновенное замораживание жидкого азота для сбора клеток с дополнительной предварительной обработкой хлорамфениколом для остановки трансляции бактерий. Для распада мы предлагаем шлифовать замороженные клетки раствором и пестиком в присутствии оксида алюминия, чтобы механически разрушить клеточную стенку. В этом протоколе не требуется сахарозная подушка или ультрацентрифугирование градиента сахарозы для очистки моносом. Вместо этого проводится разделение мРНК с использованием электрофореза полиакриламидного геля (PAGE) с последующим иссечением рибосомного следа (полоса 28-30 нт) и дает удовлетворительные результаты. Это значительно упрощает метод, а также сокращает время и требования к оборудованию для процедуры. Для подготовки библиотеки мы рекомендуем использовать коммерчески доступный небольшой набор РНК для секвенирования Illumina от New England Biolabs, следуя рекомендациям производителя с некоторой степенью оптимизации.

Полученные библиотеки кДНК представляют соответствующее количество и качество, необходимые для секвенирования следующего поколения (NGS). Секвенирование библиотек, подготовленных в соответствии с описанным протоколом, приводит к 2-10 млн однозначно нанесенных на карту считывания на образец, что обеспечивает достаточные данные для всестороннего биоинформатического анализа. Протокол, который мы представляем, является быстрым и относительно простым и может быть выполнен с помощью стандартного лабораторного оборудования.

Introduction

Методика профилирования рибосом (RIBO-seq) была разработана в лаборатории Джонатана Вайсмана в Калифорнийском университете в Сан-Франциско^1. По сравнению с другими методами, используемыми для изучения экспрессии генов на трансляционном уровне, RIBO-seq фокусируется на связывании каждой рибосомы с мРНК и предоставляет информацию о ее местоположении и относительном количестве рибосом на транскрипте. Он позволяет контролировать процесс синтеза белка in vivo и может обеспечить одно разрешение и точность кодона, что позволяет измерять плотность рибосом как на отдельной мРНК, так и на всем транскриптоме в клетке. В основе методики RIBO-seq лежит тот факт, что во время трансляции рибосома связывает молекулу мРНК и тем самым защищает погребенный фрагмент транскрипта от переваривания рибонуклеазы. При добавлении рибонуклеазы незащищенная мРНК переваривается, и фрагменты, заключенные рибосомами - обычно длиной ~ 28-30 нт - остаются нетронутыми. Эти фрагменты, называемые рибосомными следами (RF), затем могут быть выделены, секвенированы и нанесены на транскрипт, из которого они произошли, что приводит к обнаружению точного положения рибосом. Фактически, способность рибосомы защищать фрагменты мРНК используется с 1960-х годов для изучения рибосомных сайтов связывания и инициации трансляции (TIS)^2,3,4. Однако с развитием технологии глубокого секвенирования RIBO-seq стал золотым стандартом для мониторинга трансляции^5, который благодаря взаимодействию с рибосомами может предоставить общегеномную информацию о синтезе белка^6. Профилирование рибосом заполнило технологический пробел, который существовал между количественной оценкой транскриптома и протеома^6.

Для проведения рибосомного профилирования необходимо получить лизат клеток организма, выросших в исследуемых условиях. Нарушение этих условий во время сбора и лизиса клеток может обеспечить ненадежные данные. Чтобы предотвратить это, обычно используются ингибиторы трансляции, быстрый сбор и мгновенное замораживание в жидком азоте. Клетки могут быть лизированы криогенным измельчением в механическом гомогенизаторе, таком как смеситель мельницы^7,8 или бисерный взбиватель^9,и путем тритурации через пипетку¹⁰ или с помощью иглы^11. Буфер лизиса может быть добавлен непосредственно перед или вскоре после измельчения клеток. В нашем протоколе мы используем жидкий азот для предварительного охлаждения раствора и пестиков, а также оксид алюминия в качестве более мягкого подхода к разрушению бактериальной клеточной стенки, что предотвращает сдвиг РНК, часто встречающийся при применении таких методов, как сонификация. После измельчения мы добавляем ледяной буфер лизиса в охлажденный содержимое раствора. Выбор подходящего буфера лизиса важен для получения наилучшего разрешения рибосомных следов. Поскольку ионная сила влияет как на размер ВЧ, так и на точность кадра считывания, в настоящее время рекомендуется использовать лизисные буферы с низкой ионной силой и буферной емкостью, даже если окажется, что буферный состав не влияет на рибосомную занятость на мРНК^11,12. Важными компонентами лизисного буфера являются ионы магния, наличие которых предотвращает диссоциацию рибосомных субъединиц и подавляет спонтанные конформационные изменения в бактериальных рибосомах^11,13. Ионы кальция также играют значительную роль и необходимы для активности микрококковой нуклеазы (МНазы), используемой в методе профилирования бактериальных рибосом^14. Добавление гуанозина 5'-[β,γ-имидо]трифосфата (GMP-PNP), негидролизуемого аналога ГТФ, вместе с хлорамфениколом ингибирует трансляцию во время лизиса^15.

При получении лизата его осветляют центрифугированием и делят на две части, каждая для RIBO-seq и высокопроизводительного полного секвенирования мРНК (RNA-seq), поскольку они выполняются одновременно(фиг.1). RNA-seq обеспечивает точку отсчета, которая позволяет сравнивать данные как RIBO-seq, так и RNA-seq во время анализа данных. Исследуемый транслейлом определяется нормализацией рибосомных следов до обилия мРНК^16. Данные из RNA-seq также могут помочь идентифицировать артефакты клонирования или секвенирования¹⁷.

Рисунок 1. Схемы пробоподготовки мРНК для RIBO-seq и RNA-seq. Для подготовки библиотеки RIBO-seq РНК переваривается МНазой (A), с последующим выбором размера РЧ ~28-30 nt длины (B); для РНК-seq РНК выделяют (С), истощают рРНК (D), а полученную мРНК случайным образом фрагментируют на фрагменты различной длины (Е). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Начальные этапы процедуры пробоподготовки для RIBO-seq и RNA-seq отличаются незначительно(рисунок 1). Для рибосомного профилирования лизат должен быть переварен специфической эндонуклеазой, чтобы раздуть молекулы мРНК, не защищенные рибосомами. В стандартных протоколах полученные моносомы восстанавливают ультрацентрифугированием сахарозной подушки или ультрацентрифугированием градиента сахарозы^8,14. В этой статье мы показываем, что этот шаг не является необходимым для выделения РЧ, необходимого для RIBO-seq у бактерий, аналогично для эукариотических клеток^18,и что выбор размера фрагментов мРНК соответствующей длины из полиакриламидного геля является достаточным.

Для РНК-seq мРНК получается путем истощения рРНК из общей РНК - молекулы рРНК гибридизируются с биотинилированными олигонуклеотидными зондами, которые связываются с магнитными шариками, покрытыми стрептавидином. Комплексы рРНК-олигонуклеотид-шарики затем удаляются из образца магнитом, в результате чего рРНК истощается образцом^19,20. Очищенные молекулы мРНК затем случайным образом фрагментируются щелочным гидролизом. Полученные фрагменты мРНК, а также рибосомные следы преобразуются в библиотеки кДНК и подготавливаются к глубокому секвенированию(рисунок 2). Это включает в себя восстановление концов, необходимое после щелочного гидролиза (для мРНК) и ферментативного пищеварения (для RF): дефосфорилирование 3' концов с последующим фосфорилированием 5' концов. Следующими шагами являются лигирование адаптеров и обратная транскрипция для создания вставок кДНК, обрамленных последовательностями, необходимыми для секвенирования следующего поколения (NGS) с использованием платформы Illumina. Последняя фаза подготовки библиотеки представляет собой реакцию ПЦР, в которой конструкции усиливаются и маркируются штрих-кодами для конкретных образцов, чтобы обеспечить мультиплексирование и секвенирование различных образцов на одном канале. Перед секвенированием качество и количество библиотек оцениваются с помощью высокочувствительного электрофореза ДНК на кристалле. Затем библиотеки cDNA с соответствующими параметрами могут быть объединены в пул и секвенированы. Секвенирование может выполняться на различных платформах Illumina, таких как MiSeq, NextSeq или HighSeq, в зависимости от количества библиотек, требуемой длины чтения и глубины секвенирования. После секвенирования проводится биоинформатический анализ.

Рисунок 2. Подготовка библиотеки. Подготовка библиотеки включает в себя ремонт концов, перевязку адаптеров, обратную транскрипцию и усиление штрих-кодированием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Профилирование рибосом является универсальным методом, который может быть легко модифицирован и скорректирован в соответствии с научным вопросом. Первоначально он использовался в дрожжах^1,но вскоре после этого он был применен к бактериальным клеткам^21, а также к эукариотическим модельным организмам, включая мышь^10,рыбку данио^22,плодовую^{муху 23} и Arabidopsis thaliana^24. Он также использовался для изучения различных типов рибосом: цитоплазматических, митохондриальных^25,26 и хлоропластов^27,28. У эукариот RIBO-seq обычно адаптируется и уточняется для исследования конкретных аспектов трансляции, включая инициацию^{10,11,29,30,31,32,}удлинение^{1,10,11,31,33,}рибосомное сваливание³³ и изменение конформации^33. Большинство модификаций предполагают использование различных ингибиторов трансляции. Однако на бактериях аналогичные исследования было трудно провести из-за нехватки ингибиторов с требуемым механизмом действия^34. Наиболее часто используемым ингибитором трансляции у бактерий является хлорамфеникол (CAM), который связывается с центром пептидилтрансферазы (PTC) и предотвращает правильное позиционирование аминоацил-тРНК в А-сайте. В результате CAM предотвращает образование пептидной связи, что приводит к остановке удлиняющихся рибосом^35. Другими примерами ингибиторов трансляции у бактерий являются тетрациклин (TET)^36,ретапамулин (RET)³⁴ и Onc112^37, которые использовались для исследования сайтов инициации трансляции. ТЕТ, который предотвращает доставку тРНК в рибосому путем прямого перекрытия с антикодоном стволовым контуром тРНК в А-месте, первоначально применялся для проверки результатов, полученных от лечения CAM, поскольку они оба являются антибиотиками, ингибируя удлинение трансляции^38. Было обнаружено, что TET обнаруживает первичный TIS, однако не смог выявить внутренний TIS^36. RET связывается в PTC бактериальной рибосомы и предотвращает образование первой пептидной связи путем вмешательства в элонгатор аминоацил-тРНК в месте А. Применение RET приводит к остановке рибосом как на первичном, так и на внутреннем TISs^34. Onc112, богатый пролином антимикробный пептид, связывается в выходном туннеле и блокирует связывание аминоацил-тРНК в рибосомном участке А. В результате Onc112 предотвращает вход комплексов инициации в фазу^{удлинения 37.}

Основной информацией, которую обеспечивает профилирование рибосом, является плотность рибосом и их положение на мРНК. Он был успешно применен для исследования дифференциальной экспрессии генов на уровне трансляции в различных условиях роста^1,6,измерения поступающей эффективности^1,38,39 и обнаружения событий регуляции трансляции, таких как рибосомная пауза^10. RIBO-seq также позволяет раскрыть трансляцию аннотированных ncRNA, псевдогенов и неаннотированных малых открытых кадров чтения (ORF), что приводит к идентификации новых и/или очень коротких генов, кодирующих белки^{10,12,22,30,37.} В таких случаях RIBO-seq может точно настроить и улучшить аннотацию генома. Обладая высокой чувствительностью к идентификации переведенных ОРФ и его количественной природой, профилирование рибосом может также служить прокси для определения протеома или в оказании помощи протеомным исследованиям^31,34,39. Путем картирования TIS, профилирование рибосом выявляет N-терминально расширенные и усеченные изоформы известных белков^10,32. RIBO-seq также был адаптирован для изучения ко-трансляционного сворачивания белков^14,21,24. Этот метод позволяет измерять скорости удлинения^1,10,39 или скорость декодирования отдельных кодонов⁶ и помогает в разработке количественных моделей трансляции^17. Метод профилирования рибосом также способен обеспечить механистическое понимание паузы рибосомы у бактерий^7,15,17,сдвига кадра^40,стоп-кодона через^21,дефектов терминации/рециркуляции^41,42 и рибосомных конформационных изменений³³ у эукариот. RIBO-seq также был адаптирован для изучения влияния специфических трансдействующих факторов на трансляцию, таких как миРНК⁶ и РНК-связывающие белки у эукариот^16,43. Однако важно признать, что экспериментальная конструкция и полученная разрешение RIBO-seq определяют объем информации, которая может быть извлечена из полученных данных секвенирования^12.

Protocol

1. Сбор образцов

1. Подготовьте бактериальную культуру. Мы рекомендуем культуру объемом 100 мл на образец.
2. Подготовка оборудования и реагентов для отбора проб: две мерные ложки на образец, стерильные мембранные фильтры смешанных эфиров целлюлозы (MCE) 0,45 мкм, стерильные пробирки объемом 50 мл, жидкий азот, 50 мг/мл хлорамфеникола в 70% (об/об)этанола (опционально). Проколите крышку трубок объемом 50 мл, чтобы обеспечить испарение жидкого азота и предотвратить взрыв закрытых трубок. Обеззараживайте совки лабораторным моющим средством и 70% этанолом.
3. Предварительно прогрейте фильтрующее оборудование и одну из мерных совков до температуры роста бактериальной культуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем полностью стеклянный фильтрационный аппарат с воронкой, фритированной основой, колба для заземления и пружинным зажимом Ø диаметром 47 мм.
4. Перед сбором пробы добавьте хлорамфеникол в бактериальную культуру до конечной концентрации 100 мкг/мл и инкубируют 1 минуту (необязательно).
5. Налейте жидкий азот в стерильную трубку объемом 50 мл и поместите вторую мерную ложку внутрь трубки для охлаждения.
   осторожность! Жидкий азот может привести к взрыву закрытых контейнеров из-за изменения давления при испарении. Чтобы этого не допустить, необходимо создать несколько отверстий в крышке пробирок объемом 50 мл, чтобы можно было испарить жидкий азот.
6. Собирайте клетки путем фильтрации. Прекратите фильтрацию, когда среда прошла через мембрану, но не дайте фильтру полностью высохнуть.
7. Собирайте бактериальные гранулы, быстро соскребая клетки с фильтрующего диска с помощью предварительно выпуклой совки. Немедленно поместите всю мерную ложку с собранными клетками в трубку объемом 50 мл, заполненную жидким азотом. Заготовленная гранула должна быть полностью покрыта жидким азотом.
8. Дайте грануле тщательно замерзнуть и вытесните замороженные клетки, используя предварительно охлажденный второй совок. Закройте проколотую крышку и перенесите трубку на -80°C. Точка ОСТАНОВКИ
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дезинфицируйте совки после каждого сбора проб.

2. Лизис клеток

1. Для лизатов готовят 0,1 М GMP-PNP в реакционных трубках 10 мМ Tris pH 8, DNase I и 1,5 мл и держат их на льду. Охладите центрифугу до 4 °C.
2. Готовят лизисный буфер (20 мМ TRIS pH 7,6, 10 мМ MgAcet, 150 мМ KAcet, 0,4% TRITON X-100, 6 мМ β-меркаптоэтанола, 5 мМ_CaCl2 и опционально 1 мМ хлорамфеникола). Аликвота 500 мкл лизисного буфера на образец в 1,5 мл реакционных пробирок и поместите их на лед.
3. Обеззаражьте раствор и пестик лабораторным моющим средством и 70% этанолом и высушите их. Охладите раствор и пестик, налив в раствор жидкий азот.
4. Переложите замороженные гранулы в предварительно охлажденный раствор и измельчите его в порошок. Шпателем добавьте примерно 1 объем оксида алюминия и продолжайте измельчение. Держите раствор, пестик и клетки в прохладном, заливая жидким азотом, когда это необходимо, не дайте содержимому раствора оттаять.
5. Непосредственно перед использованием лизисного буфера добавляют GMP-PNP и ДНКазу I в аликвоту буфера лизиса до конечной концентрации 2 мМ и 100 Ед/мл соответственно. Переложить раствор в раствор с ячейками и оксидом алюминия и продолжить измельчение. Дайте лизат медленно оттаять во время измельчения и перенесите смесь в предварительно охлажденный реакционный пробирку 1,5 мл и немедленно поместите на лед.
6. Центрифужные лизаты при 20 000 х г в течение 5 минут при 4 °C. Переложите супернатанты в новые, предварительно охлажденные реакционные трубки 1,5 мл и держите их на льду.
7. Измерьте концентрацию РНК в каждом образце с помощью NanoDrop. Используйте разбавления образцов 1:10 и разбавление лизисного буфера 1:10 в воде без нуклеаз в качестве заготовки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что хлорамфеникол демонстрирует значительную абсорбцию при 260 нм.
8. Разделите каждый лисат на две порции: одну для RIBO-seq (0,5 - 1 мг РНК) и вторую для RNA-seq (остальные).
9. Очистите образцы для RNA-seq с помощью коммерчески доступного комплекта для очистки РНК в соответствии с протоколом производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем использовать набор Zymo RNA Clean & Concentrate -25 (см. Таблицу материалов). Мы также рекомендуем добавлять 4,5 объема этанола (по сравнению с объемом образца) в смесь образца и связывающего буфера для рибосомных следов и фрагментированной мРНК, чтобы повысить эффективность очистки коротких фрагментов РНК.
10. Хранить образцы, предназначенные для РНК-seq, при -80 °C. Процедура РНК-seq будет продолжаться с шага 5.

3. МНазное переваривание образцов для RIBO-seq

1. К 1 мг РНК добавляют 3,8 мкл 187,5 Ед/мкл МНазы в 10 мМ Tris pH 8 и засыпку его лизисным буфером до общего объема 500 мкл.
2. Инкубировать при 25 °C, 300 об/мин, в течение 45 минут в термомиксаторе.
3. Очистите образцы с помощью коммерчески доступного комплекта для очистки РНК (как на шаге 2.9).
4. Храните образцы для RIBO-seq при -80 °C (точка STOP) или переходите к выбору размера.

4. Электрофорез полиакриламидного геля (PAGE) и подбор размеров образцов для RIBO-seq

1. Приготовьте 15% полиакриламид-ТБЭ-гель с 8 М мочевины и поместите в емкость с буфером ТБЭ. Предварительный запуск в течение минимум 10 минут при постоянном напряжении 200 В.
2. Смешайте образцы с буфером образцов TBE-мочевины, денетрируйте при 95 °C в течение 1 минуты и немедленно поместите их на лед.
3. Вымойте мочевину, введя буфер TBE в гелевые колодцы с помощью шприца. Загрузите образцы, оставляя пространство между ними в одном колодезном пространстве, чтобы отделить каждый образец и предотвратить перекрестное загрязнение. Используйте 29 nt олигонуклеотид и смесь 26 nt и 32 nt олигонуклеотидов в качестве маркеров. Проводят электрофорез при постоянном напряжении 180 В.
4. Подготовьте стерильный буфер для ночной инкубации (5 мМ ЭДТА, 10 мМ NaOAc pH 5).
5. После электрофореза окрасьте гель в SYBR Gold-ванна примерно на 2-3 минуты и промойте гель водой без нуклеаз.
6. Иссейте фрагменты геля от 26 до 32 нт стерильными иглами или лезвиями бритвы и поместите фрагменты геля в отдельные пробирки по 1,5 мл для каждого образца. Замените иглу или лезвие бритвы между образцами.
7. Добавьте 200 мкл ночного инкубационного буфера в каждую реакционную трубку.
8. Инкубировать образцы при 10 °C, 1000 об/мин в течение ночи в термомикшере.
9. На следующий день очистите образцы, как по шагам 2.9. Элюют следы в 80 мкл воды без нуклеаз.
10. Храните образцы при -80 °C. STOP точка. Процедура RIBO-seq будет продолжена с шага 7.

5. Очистка бактериальной мРНК путем истощения рРНК из образцов для РНК-seq

1. Удалите рРНК из образцов с помощью набора для очистки бактериальной мРНК (например, Invitrogen MICROBExpress). Следуйте протоколу производителя.
2. Очистите образцы, как по шагам 2.9. Элюют мРНК в 50 мкл безнуклеазной воды.
3. Храните образцы для РНК-seq при -80 °C (точка STOP) или продолжайте щелочную фрагментацию.

6. Щелочная фрагментация образцов для РНК-seq

1. Готовят щелочной гидролизный буфер (смешивают 220 мкл 0,1 М NaHCO_3,30 мкл 0,1_{М Na2СО3} и 1 мкл 0,5 М ЭДТА). Смешайте 1 объем (50 мкл) щелочного буфера с 1 объемом (50 мкл) образца и инкубируют при 95 °C в течение 25 минут.
2. Добавьте 5 мкл 3 М NaOAc pH 5,5, чтобы остановить реакцию.
3. Очистите образцы, как на этапе 2.9, и элюйте образцы в 80 мкл воды без нуклеазы.
4. Возможная точка ОСТАНОВКИ: хранить образцы РНК-сек при -80 °C. Однако мы рекомендуем перейти непосредственно к шагу 7, чтобы избежать ненужного замораживания и оттаивания.

7. Дефосфорилирование и фосфорилирование образцов как для РНК-, так и для RIBO-seq

1. Добавьте 10 мкл 10-кратного реакционного буфера PNK и 5 мкл T4 PNK к каждому образцу. Инкубировать при 37 °C в течение 1,5 часа, чтобы дефосфорилировать 3' концы.
2. Добавьте 3 мкл 1 мМ АТФ и инкубировать при 37 °C в течение 1 часа, чтобы фосфорилировать 5' концы.
3. Очистите образцы, как на этапе 2.9, элюйте в воде без нуклеазы 30 мкл.
4. Храните образцы при -80 °C. STOP точка.

8. Подготовка библиотеки с использованием NEBNext Мультиплекс Малая библиотека РНК Подготовительный Набор для Illumina

1. Подготовьте 100-1000 нг входной РНК (полученных фрагментов мРНК и рибосомных следов) в 6 мкл безнуклеазной воды и добавьте 1 мкл 3' SR Adaptor. Инкубировать по протоколу производителя.
2. Добавьте 10 мкл 3'-го буфера реакционной лигиции (2X) и 3 мкл 3'-го лигационного ферментного микса и инкубировать при 37 °C в течение 2,5 часов вместо 1 часа при 25 °C, как указано в протоколе производителя.
3. Гибридизируйте праймер обратной транскрипции в соответствии с протоколом производителя с модифицированной программой: 5 минут при 75 °C, 30 минут при 37 °C и держите при 4 °C.
4. Ligate 5' SR адаптер. Следуйте протоколу производителя с одним изменением: выполняйте инкубацию при 37 °C в течение 2,5 часов вместо 1 часа при 25 °C.
5. Выполните обратную транскрипцию в соответствии с протоколом производителя.
6. Возможная точка ОСТАНОВКИ: инкубировать образцы, содержащие синтезированные кДНК при 70 °C, в течение 15 минут для инактивации обратной транскриптазы и хранить их при -80 °C. Однако мы рекомендуем перейти непосредственно к следующим шагам, чтобы избежать ненужного замораживания и размораживания образцов.
7. Храните половину каждой библиотеки кДНК при -80 °C в качестве резервной.
8. Выполните амплификацию ПЦР по протоколу производителя. Используйте половину реакционной смеси. Храните полученные библиотеки при -80 °C. ТОЧКА STOP.

9. Выбор размера библиотек кДНК с помощью PAGE

1. Приготовьте 6% полиакриламид-ТБЭ гель и поместите его в резервуар с буфером ТБЭ. Предварительный запуск в течение минимум 10 минут при постоянном напряжении 200 В.
2. Смешайте образцы с гелевым красителем Blue (6X) и загрузите их на гель. Используйте Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest в качестве лестницы. В начале запустите электрофорез при постоянном напряжении 120 В, чтобы позволить ДНК войти в гель, а затем измените напряжение до 180 В.
3. Когда электрофорез закончится, окрасьте гель в SYBR Gold-ванна примерно на 2-3 минуты и промойте гель водой без нуклеазы.
4. Фрагменты акцизного геля, содержащие библиотеки. Для образцов РНК-seq акцизируется между 135-180 нт, а для RIBO-seq - между 135-170 нт. Используйте стерильную иглу или лезвие бритвы и поместите иссеченные фрагменты геля в отдельные реакционные трубки по 1,5 мл. Не забудьте поменять иглу или лезвие бритвы между образцами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптеры и штрих-код из NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina имеют в общей сложности 119 nt, что определяет более низкую отсечку иссечения.
5. Добавьте 100 мкл воды без нуклеазы к каждому иссеченному фрагменту геля.
6. Инкубировать фрагменты геля при 10 °C, 450 об/мин в течение ночи в термомикшере.
7. Очистите и сконцентрируйте библиотеки кДНК с помощью коммерческого комплекта для очистки ДНК в соответствии с протоколом производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем использовать комплект Zymo DNA Clean & Concentrate -5 (см. Таблицу материалов).
8. Храните очищенные библиотеки кДНК при -80 °C. Точка ОСТАНОВКИ.

Results

Примерные результаты, представленные здесь, были получены в исследовании, изучающего регуляцию трансляции в спорулирующих клетках WT Bacillus subtilis. Ночные культуры разбавляли до OD_600, равного 0,1 в 100 мл богатой среды, и инкубировали при 37 °C с энергичным встряхиванием до тех пор, пока OD₆₀₀ не достиг 0,5-0,6. Затем богатая среда была заменена минимальной средой, чтобы вызвать процесс споруляции, и инкубация продолжалась до четырех часов. Клетки собирали каждый час, начиная с T0 - ин...

Discussion

Ключевой технической проблемой профилирования рибосом является необходимость быстрого ингибирования трансляции, чтобы захватить снимок рибосом на мРНК в определенном физиологическом состоянии, представляющих интерес. Для этого обычно используются ингибиторы трансляции, быстрый сбор и мгновенное замораживание в жидком азоте. Применение антибиотиков не является обязательным, поскольку они могут вызвать артефакты. Хлорамфеникол является широко используемым препаратом для остановки удлиняющихся рибосом в бактериальном RIBO-s...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X TBE (порошок)	Invitrogen	AM9864
2-меркаптоэтанол, 99%, чистый	Acros Organics	125472500
аденозин 5'-трифосфат (АТФ)	New England Biolabs	P0756S
Оксид алюминия кальцинированный чистый p.a.	Chempur	114560600
Дигидрат хлорида кальция	Sigma-Aldrich	C3881-500G
Хлорамфеникол	MP Biomedicals	190321
ДНК Clean & Концентратор -5	Zymo Research	D4004
Dnase I рекомбинантный, безрназный	Roche	4716728001
ЭДТА динатриевая соль	Fisher Scientific	E/P140/48
Абсолют этилового спирта 99,8%  Pure-P.A.-Basic	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	BA6480111
Фильтрационный аппарат	VWR Collection	511-0265	цельностеклянный фильтрующий аппарат, с воронкой, фриттированным основанием, колпачком, 47 мм & Oslash; пружинный зажим и колба для шлифованных швов
Гель 40 (19:1)	Rotiphorese	3030.1
Гель для загрузки, синий, 6X	New England Biolabs	E6138G
Гуанозин 5′-[β,γ-imido]трифосфат тринатриевая соль гидрат	Sigma-Aldrich	G0635-25MG
labZAP	A& Биотехнология	040-500
Тетрагидрат ацетата магния	Sigma-Aldrich	M5661-250G
MCE подгонщик мембран	Alfatec Технология	M47MCE45GWS	размер пор: 0,45 мкм
МИКРОБкспресс Бактериальная очистка мРНК	Invitrogen	AM1905
Мультиплексная малая библиотека РНК Набор для подготовки для Illumina	New England Biolabs	E7300S
Безнуклеазовая вода	Ambion	AM9937
Ацетат калия безводный чистый ПА	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest	New England Biolabs	E7323A
RNA Clean & Концентратор -25	Zymo Research	R1018
Ацетат натрия	Sigma-Aldrich	S2889-250G
Карбонат натрия	Sigma-Aldrich	223530-500G
Гидрокарбонат натрия чистый p.a.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	810530115
SYBR Золото нуклеиновая кислота гель окрашивание	Life Technologies	S11494
T4 Полинуклеотидкиназа	New England Biolabs	M0201L
T4 Полинуклеотидкиназный реакционный буфер	New England Biolabs	B0201S
TBE-мочевина Буфер для проб (2x)	Invitrogen	LC6876
Трис(гидроксиметил)аминометан, ультрачистый, 99,9%	AlfaAesar	J65594
Triton X-100, 98%	Acros Organics	327371000
Urea G.R.	ЛАХ: NER	40096-AP0