Method Article

Модулирующая форма полимеров на основе полиэстера с использованием осмотического давления

DOI:

10.3791/62548

⸱

April 21st, 2021

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Clemson University, 2Department of Biological Sciences, Clemson University, 3Department of Bioengineering, Clemson University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полимеромы представляют собой самосборные полимерные везикулы, которые образуются в сферических формах, чтобы минимизировать свободную энергию Гибба. В случае доставки препарата полезны более вытянутые структуры. Этот протокол устанавливает методы для создания большего количества стержнеобразных полимеров с удлиненными соотношениями сторон, используя соль для индуцирования осмотического давления и уменьшения объемов внутренних везикул.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полимеромы представляют собой мембранно-связанные, двухслойные везикулы, созданные из амфифильных блок-сополимеров, которые могут инкапсулировать как гидрофобные, так и гидрофильные полезные нагрузки для применения в доставке лекарств. Несмотря на их перспективность, полимеромы ограничены в применении из-за их сферической формы, которая не легко воспринимается клетками, как показали ученые из твердых наночастиц. В данной статье описан метод на основе соли для увеличения пропорций сферических полимеров на основе поли(этиленгликоля) (ПЭГ). Этот метод может удлинить полимеромы и в конечном итоге контролировать их окончательную форму, добавляя хлорид натрия в послеформационный диализ. Концентрацию соли можно варьировать, как описано в данном способе, исходя из гидрофобности блок-сополимера, используемого в качестве основы для полимеромы и целевой формы. Удлиненные наночастицы могут лучше нацеливаться на эндотелий в кровеносных сосудах большего диаметра, таких как вены, где наблюдается маржинирование. Этот протокол может расширить терапевтическое применение наночастиц за счет использования методов удлинения в тандеме с преимуществами полимеров с двойной нагрузкой и длительной циркуляцией.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модуляция формы является относительно новым и эффективным способом улучшения доставки лекарств, опосредованных наночастицами. Изменение морфологии не только увеличивает площадь поверхности частиц, что, в свою очередь, обеспечивает большую несуществощесть, но также имеет последствия по всем направлениям для улучшения стабильности, времени циркуляции, биодоступности, молекулярного нацеливания и контролируемого высвобождения1. Полимерсомы, наночастицы фокуса в этом методе, имеют тенденцию термодинамически самособираться в сферическую форму, которая оказалась непрактичной при клеточном поглощении и легче обнаруживается в иммунной системе как инородное тело. Возможность удлинить структуру в выступ или стержень позволит носителю препарата уклоняться от макрофагов, имитируя нативные клетки, и более успешно доставлять к желаемой цели2,3,4,5,6,7. Значительные преимущества полимерсом, включая мембранно-связанную защиту полезных нагрузок, стимулы-реакцию мембраны и двойную инкапсуляцию гидрофильных и гидрофобных препаратов8,9,10,которые делают их сильными кандидатами на доставку лекарств, сохраняются во время модуляции формы.

Существует много различных методов модуляции форм полимером, и каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Однако большинство из этих методов подразделяются на две категории: изменение осмотического давления на основе растворителей и на основе соли11. Оба подхода направлены на преодоление энергии изгиба, присутствующей после образования полимером в сферической равновесной форме. Вводя осмотический градиент давления, полимеромы могут быть вынуждены изгибаться в вытянутые структуры, несмотря на сильные энергии изгиба11,12.

Метод на основе растворителей исследует изменение формы, вдохновленное работой Кима и ван Хеста13. Они пластифицируют полимеромы в смеси органического растворителя и воды, чтобы улавливать органические растворители в мембране везикул и вытеснять воду из ядра везикулы. В конце концов, внутренний объем частицы настолько низок, что она удлиняется. Хотя этот метод показал многообещающие результаты, ему не хватает практичности. Этот метод требует различных растворителей для каждой отдельной полимерной основы, участвующей в модуляции. Поэтому он не имеет широкого распространения для содействия изменению формы. И наоборот, метод на основе соли является однородным и использует один универсальный драйвер, который может вводить осмотическое давление во многие полимеромы на основе блок-сополимеров.

В этом проекте используется метод на основе соли, введенный L'Amoreaux et al14. Этот протокол включает в себя два раунда диализа. Один из них направлен на очистку и затвердевание полимеров поли(этиленгликоль)-b-поли(молочная кислота) (PEG-PLA) путем удаления органического растворителя, который мог попасть в бислой во время производства, и тот, который способствует изменению формы. На втором этапе диализа вводится раствор NaCl 50 мМ, который создает градиент осмотического давления для изменения формы. Этот метод поддерживается Salva et al., которые отмечают, что гипертонический стресс в растворе приведет к тому, что везикула уменьшитсяна 15. Этот способ основан на ранее опубликованном способе14, рассматривая два различных полимеромы на основе полиэстера и различные градиенты солей от 50-200 мМ NaCl. Полиэфиры используются из-за их биосовместимости и биодеградации. Градиент соли оказывает различное влияние на форму в зависимости от гидрофобности блока сополимерной основы. Его можно использовать для создания пролатов, стержней и стоматоцитов. Этот солевой метод был выбран из-за простоты репликации и экспериментальной универсальности.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Сферическое полимеромообразование методом впрыска растворителя

  1. Растворение полиэфиры в органическом растворителе
    ПРИМЕЧАНИЕ: Только один полиэстер должен быть растворен в соответствующем органическом растворителе за один раз с образованием полимером.
    1. Растворяют полиэфиры PEG-PLA или PEG-b-поли (молочно-согликолевая кислота) (PEG-PLGA) в диметилсульфоксиде (DMSO) в концентрации 1,5% масс. В частности, растворить 0,015 г выбранного полиэстера в 1 мл ДМСО (15 мг/мл). Полное растворение полимера может потребовать периодов до 15 мин вихря.
  2. Пока полиэстер растворяется в органическом растворителе, настройте аппарат для впрыска растворителя согласно рисунку 1.
    1. Поместите перемешиваемую пластину непосредственно под вертикальным шприцевым насосом. Поместите стеклянный флакон емкостью 5 мл с 1 мл деионизированной воды типа II и миниатюрный перемешиватель на перемешиваемую пластину.
    2. Отрегулируйте высоту шприцевого насоса, чтобы наконечник иглы был полностью погружен в деионизированную воду типа II.
    3. Установите скорость инфузии шприцевого насоса на 5 мкл/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется шприцевой насос небольшого объема, адаптер со шприцем можно установить на кольцевую подставку. Если используется шприцевой насос большого объема, насос можно разместить вертикально на лабораторном домкрате для регулировки высоты.
  3. Выполните инъекцию растворителя, втянув раствор органического растворителя и полиэстера (этап 1.1.1) в иглу 27 Г с длиной иглы 1/2 дюйма.
    1. Поместите иглу в шприцевой насос и убедитесь, что она полностью безопасна. Отрегулируйте толкающий блок так, чтобы он касался конца плунжера шприца.
    2. Запустите перемешиваемую пластину так, чтобы вода вращалась со скоростью 100 оборотов в минуту, а затем запустите шприцевой насос.
  4. После того, как шприцевой насос полностью влил органический растворитель и полимер в перемешивающую воду, извлеките из перемешивающего батончика и крышкой стеклянный флакон.
  5. Характеризуют полимеромы с помощью динамического рассеяния света (DLS).
    1. Возьмите 1 мл воды, теперь с небольшим процентом органического растворителя и полимера, и поместите в кювету объемом 1 мл.
    2. Используя настройки из таблицы 1,выполните DLS, поместив в систему кювету 1 мл и настроив запуск. Считывание и сбор взвешенного по интенсивности полимером диаметра и индекса полидисперсности (PDI).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластиковая кювета отлично работает в этом случае, так как количество органического растворителя очень низкое. Тем не менее, стеклянная кювета также будет работать, если есть какие-либо проблемы.
  6. Подтвердите образование сферических полимеров с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM) и сканирующей электронной микроскопии (SEM).
    1. Оптимизируйте протоколы TEM и SEM в зависимости от доступного оборудования. Репрезентативные результаты были получены при 120 кВ в ТЕА и 5,0 кВ в СЭМ.
    2. Если полимеромы не видны с помощью ЭМ, нанесите уранилацетат в качестве фонового пятна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о визуализации TEM и SEM для модуляции формы полимеров на основе полиэстера содержится в ссылке14. Информация о методах электронной микроскопии мягких наночастиц подробно описана в ссылке16.

2. Диализ для удаления органического растворителя

  1. Промывайте мембрану диализа 300 кДа в соответствии с протоколами, предоставленными производителем.
  2. Добавьте 1 мл полимерного раствора в резервуар диализного устройства.
  3. Поместите диализное устройство в 250 мл со 150 мл деионизированной воды типа II на перемешиваемую пластину. Установите перемешиваемую пластину на скорость, которая позволяет мягкое движение диализного устройства и оставьте перемешиваться на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если во время диализа образуется вихрь, скорость необходимо уменьшить.
  4. После завершения диализа извлекают полимеромный раствор 1 мл из диализного устройства. Охарактеризуют полимеромный раствор, следуя шагу 1.5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор этой информации имеет отношение к определению успешности протокола модуляции формы, поскольку следует уметь идентифицировать увеличение PDI, если полимерома была удлинена.

3. Диализ против солевых градиентов

  1. Создайте 150 мл желаемого соляного буфера с концентрацией хлорида натрия 50 мМ, 100 мМ или 200 мМ на основе конечных желаемых полимеромных свойств. В целом, повышенная концентрация соли приводит к увеличению удлинения полимером.
  2. Возьмите полимерный раствор, который был диализирован и охарактеризован, и повторно поместите в диализное устройство. Поместите загруженное диализное устройство в 150 мл нужного раствора соли и дайте осторожно перемешать в течение 18 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Форм-модулированные полимеры могут храниться и сохранять свою форму в изотоническом растворе в течение периодов до 7 дней.

4. Форма модулированная полимеромная характеристика

  1. После модуляции формы выполняют полимерную характеристику с помощью DLS, TEM и SEM. Если полимеромы не видны с помощью ЭМ, нанесите уранилацетат в качестве фонового пятна.
  2. Выполняйте измерения DLS, как описано на этапе 1.5, уделяя особое внимание измерениям PDI по сравнению со сферическими полимеромами, поскольку изменение PDI предполагает эффективное изменение формы полимеров.
  3. Обеспечить использование соответствующих элементов управления для визуализации, особенно полимеров с неформной модуляцией, чтобы обеспечить успех метода.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В таблице 2 представлены ожидаемые результаты при выполнении этапа 1 протокола. Обратите внимание, что DMSO используется в качестве растворителя как для PEG-PLA, так и для PEG-PLGA в образовании полимером. Отклонение от этого растворителя возможно, так как другие смешиваемые с водой растворители растворяют сополимеры, но, как ожидается, изменят результаты. Ожидается, что PDI составит менее 0,2, что указывает на образование монодисперсных полимером17. Обратите внимание, что повышен...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Самосборные системы, как известно, неуправляемы. Их конечные свойства, включая размер, форму и структуру, определяются гидрофобными свойствами выбранного амфифила и выбранной средой растворителя. Амфифильные блок-сополимеры стремятся к сферическим формам, что минимизирует свободную энергию Гибба и приводит к термодинамическому равновесию23,образуя таким образом полимеромы. Из-за своей равновесной природы полимеромы значительно сложнее удлинять или изменять форму и, следовательно, менее изучены, че...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот проект был частично профинансирован Проектом Национальных институтов здравоохранения No 5P20GM103499-19 в рамках Программы исследовательских проектов, инициированных студентами. Эта работа также была частично поддержана Программой творческого исследования Клемсона. Мы также благодарим Николаса Л'Аморо и Аона Али, которые первоначально работали над созданием этого протокола, опубликовав свою первую статью, процитированную здесь14.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 * 45 флаконов с резьбой с прикрепленной крышкойFisherbrand9609104000
ДиметилсульфоксидFisher ChemicalD128-1
ДиметилсульфоксидBDHBDH1115-1LP
Изоремные мешалки, нагревательные плиты и мешалкиFisher ScientificCIC00008110V19
LEGATO 130 ШПРИЦЕВОЙ НАСОСkd Scientific788130
PEG(1000)-b-PLA(5000), Diblock Polymer PolysciencesInc24381-1обратите внимание на молекулярные массы при репликации
поли(этиленгликоль) (2000) Метиловый эфир-блок-поли(лактид-ко-гликолид) (4500)Sigma aldrich764825-1Gобратите внимание на молекулярную массу при репликации
комбинации одноразового шприца/иглы BD PrecisionGlide, стерильная, BD медицинскаяBD медицинскаяBD305620Туберкулин
натрия хлоридBDHBDH9286
Zetasizer Nano ZSMalvern

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Varma, L. T., et al. Recent advances in self-assembled nanoparticles for drug delivery. Current Drug Delivery. 17 (4), 279-291 (2020).
  2. Salatin, S., Maleki Dizaj, S., Yari Khosroushahi, A. Effect of the surface modification, size, and shape on cellular uptake of nanoparticles. Cell Biology International. 39 (8), 881-890 (2015).
  3. Baio, J. E., et al. Reversible activation of pH-sensitive cell penetrating peptides attached to gold surfaces. Chemical Communications. 51 (2), 273-275 (2015).
  4. Zhou, Y., et al. Mesoporous silica nanoparticles for drug and gene delivery. Acta Pharmaceutica Sinica B. 8 (2), 165-177 (2018).
  5. Champion, J. A., Mitragotri, S. Role of target geometry in phagocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 4930-4934 (2006).
  6. Banerjee, A., Qi, J., Gogoi, R., Wong, J., Mitragotri, S. Role of nanoparticle size, shape and surface chemistry in oral drug delivery. Journal of Controlled Release. 238, 176-185 (2016).
  7. Kolhar, P., et al. Using shape effects to target antibody-coated nanoparticles to lung and brain endothelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (26), 10753-10758 (2013).
  8. Meng, F., Zhong, Z., Feijen, J. Stimuli-responsive polymersomes for programmed drug delivery. Biomacromolecules. 10 (2), 197-209 (2009).
  9. Iqbal, S., Blenner, M., Alexander-Bryant, A., Larsen, J. Polymersomes for therapeutic delivery of protein and nucleic acid macromolecules: from design to therapeutic applications. Biomacromolecules. 21 (4), 1327-1350 (2020).
  10. Discher, D. E., Ahmed, F. Polymersomes. Annual review of biomedical engineering. 8, 323-341 (2006).
  11. Seifert, U., Berndl, K., Lipowsky, R. Shape transformations of vesicles: Phase diagram for spontaneous- Curvature and bilayer-coupling models. Physical Review A. 44 (2), 1182-1202 (1991).
  12. Rikken, R. S. M., et al. Shaping polymersomes into predictable morphologies via out-of-equilibrium self-assembly. Nature Communications. 7, 1-7 (2016).
  13. Kim, K. T., et al. Polymersome stomatocytes: Controlled shape transformation in polymer vesicles. Journal of the American Chemical Society. 132 (36), 12522-12524 (2010).
  14. L'Amoreaux, N., Ali, A., Iqbal, S., Larsen, J. Persistent prolate polymersomes for enhanced co-delivery of hydrophilic and hydrophobic drugs. Nanotechnology. 31 (17), 175103(2020).
  15. Salva, R., et al. Polymersome shape transformation at the nanoscale. ACS Nano. 7 (10), 9298-9311 (2013).
  16. Skoczen, S. L., Stern, S. T. Characterization of Nanoparticles Intended for Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1682, Springer New York. New York, NY. (2018).
  17. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
  18. Men, Y., Li, W., Lebleu, C., Sun, J., Wilson, D. A. Tailoring polymersome shape using the Hofmeister effect. Biomacromolecules. 21 (1), 89-94 (2020).
  19. Decuzzi, P., et al. Size and shape effects in the biodistribution of intravascularly injected particles. Journal of Controlled Release. 141 (3), 320-327 (2010).
  20. Liu, Y., Tan, J., Thomas, A., Ou-Yang, D., Muzykantov, V. R. The shape of things to come: Importance of design in nanotechnology for drug delivery. Therapeutic Delivery. 3 (2), 181-194 (2012).
  21. Tao, L., et al. Shape-specific polymeric nanomedicine: Emerging opportunities and challenges. Experimental Biology and Medicine. 236 (1), 20-29 (2011).
  22. L'Amoreaux, N., Ali, A., Iqbal, S., Larsen, J. Persistent prolate polymersomes for enhanced co-delivery of hydrophilic and hydrophobic drugs. BioRxiv. , 796201(2019).
  23. Chandler, D. Interfaces and the driving force of hydrophobic assembly. Nature. 437 (7059), 640-647 (2005).
  24. Wong, C. K., Mason, A. F., Stenzel, M. H., Thordarson, P. Formation of non-spherical polymersomes driven by hydrophobic directional aromatic perylene interactions. Nature Communications. 8 (1), (2017).
  25. Abdelmohsen, L. K. E. A., et al. Shape characterization of polymersome morphologies via light scattering techniques. Polymer. 107, 445-449 (2016).
  26. Men, Y., et al. Nonequilibrium Reshaping of polymersomes via polymer addition. ACS Nano. 13 (11), 12767-12773 (2019).
  27. Meeuwissen, S. A., Kim, K. T., Chen, Y., Pochan, D. J., van Hest, J. C. M. Controlled shape transformation of polymersome stomatocytes. Angewandte Chemie. 123 (31), 7208-7211 (2011).
  28. Wong, C. K., et al. Faceted polymersomes: A sphere-to-polyhedron shape transformation. Chemical Science. 10 (9), 2725-2731 (2019).
  29. Chidanguro, T., Ghimire, E., Simon, Y. C. Shape-transformation of polymersomes from glassy and crosslinkable ABA triblock copolymers. Journal of Materials Chemistry B. 8 (38), 8914-8924 (2020).
  30. Van Oers, M. C. M., Rutjes, F. P. J. T., Van Hest, J. C. M. Tubular polymersomes: A cross-linker-induced shape transformation. Journal of the American Chemical Society. 135 (44), 16308-16311 (2013).
  31. Che, H., et al. Pathway dependent shape-transformation of azide-decorated polymersomes. Chemical Communications. 56 (14), 2127-2130 (2020).
  32. Haryadi, B. M., et al. Nonspherical nanoparticle shape stability is affected by complex manufacturing aspects: Its implications for drug delivery and targeting. Advanced Healthcare Materials. 8 (18), 11-13 (2019).
  33. Katterman, C., Pierce, C., Larsen, J. Combining nanoparticle shape modulation and polymersome technology in drug delivery. ACS Applied Bio Materials. , (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Polymersome ShapeOsmotic PressurePolyester PolymersomesDrug DeliveryShape ModulationDynamic Light ScatteringDialysis MembraneSodium Chloride GradientPEG PLA PolymersomesCellular Uptake

Related Articles