Методическая статья

Подготовка тканей человека, встроенных в оптимальное компаундирование температуры резания для масс-спектрометрического анализа

DOI:

10.3791/62552

⸱

27 апреля 2021 г.

 ,  , 
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2VCU Lipidomics/Metabolomics Shared Resource, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 3Massey Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сфинголипиды являются биологически активными метаболитами с хорошо известной ролью в заболеваниях человека. Характеристика изменений в тканях с помощью масс-спектрометрии может выявить роли в этиологии заболевания или определить терапевтические мишени. Однако OCT-соединение, используемое для криоконсервации в биорепозиториях, мешает масс-спектрометрии. Описаны методы анализа сфинголипидов в тканях человека, встроенных в ОКТ с помощью LC-ESI-MS/MS.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сфинголипиды являются клеточными компонентами, которые имеют хорошо установленную роль в метаболизме и болезнях человека. Масс-спектрометрия может быть использована для определения того, изменяются ли сфинголипиды при заболевании, и для изучения того, могут ли сфинголипиды быть клинически нацелены. Тем не менее, надлежащим образом подготовленные проспективные исследования, которые приобретают ткани непосредственно из хирургического набора, могут быть трудоемкими и технически, логистически и административно сложными. Напротив, ретроспективные исследования могут использовать криоконсервированные человеческие образцы, уже доступные, обычно в больших количествах, в тканевых биорепозиториях. Другие преимущества получения тканей из биорепозиториев включают доступ к информации, связанной с образцами тканей, включая гистологию, патологию и в некоторых случаях клинико-патологические переменные, все из которых могут быть использованы для изучения корреляций с данными липидомики. Однако технические ограничения, связанные с несовместимостью оптимальной температуры резания соединения (ОКТ), используемого в криоконсервации и масс-спектрометрии, являются техническим барьером для анализа липидов. Тем не менее, ранее мы показали, что OCT может быть легко удален из образцов биорепозиториев человека посредством циклов промывки и центрифугирования без изменения их содержания сфинголипидов. Мы также ранее установили, что сфинголипиды в тканях человека, криоконсервированные в ОКТ, стабильны до 16 лет. В этом отчете мы описываем этапы и рабочий процесс анализа сфинголипидов в образцах тканей человека, которые встроены в OCT, включая промывку тканей, взвешивание тканей для нормализации данных, извлечение липидов, подготовку образцов для анализа с помощью жидкостной хроматографии электрораспылительной ионизационной тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS / MS), интеграцию данных масс-спектрометрии, нормализацию данных и анализ данных.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сфинголипиды являются биологически активными метаболитами, известными своей ролью в метаболизме человека и заболеваниях 1,2. Они регулируют сложные клеточные процессы, такие как миграция клеток, выживание и гибель клеток, движение клеток, везикулярный трафик, клеточная инвазия и метастазирование, ангиогенез и производство цитокинов 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Дефекты в регуляции метаболизма сфинголипидов способствуют инициации и прогрессированию рака, определяют, насколько агрессивны раковые заболевания, и как рак реагирует и развивает устойчивость к терапии 3,10. Поэтому из-за этих широких воздействий на этиологию заболевания аналитические методы, которые могут точно установить специфические для заболевания изменения сфинголипидов, являются важными инструментами. Масс-спектрометрия (МС) является наиболее точным и надежным методом анализа изменений сфинголипидов.

Человеческие образцы, которые могут быть использованы для анализа сфинголипидных изменений, могут быть получены перспективно из хирургического набора или ретроспективно из тканевых биорепозиториев. Свежие ткани от операции выгодны, потому что они могут быть непосредственно проанализированы РС или другими аналитическими методами. Тем не менее, приобретение тканей в перспективе имеет административные, технические и логистические препятствия, и сбор достаточного количества образцов для достижения статистической мощности может быть сложной задачей. Получение тканей из биорепозиториев выгодно, потому что они могут быть приобретены ретроспективно, в большом количестве, а биорепозитории подтверждают гистологию и патологию, используют стандартные операционные процедуры для криогенного сохранения и хранения тканей и могут предоставлять клинико-патологические данные, которые могут быть использованы для корреляционного анализа. Однако для сохранения молекулярных и структурных особенностей биорепозитории могут криоконсервировать ткани, встраивая их в соединение оптимальной температуры резания (ОКТ), которое, как мы показали, мешает анализам нормализации данных и количественному определению сфинголипидов с помощью жидкостной хроматографии электрораспылительной ионизационной тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS/MS)11 . Также было показано, что поливиниловый спирт и полиэтиленгликоль, первичные компоненты в соединении OCT, приводят к подавлению ионов в других платформах анализаMS 12,13,14,15. Поэтому соединение OCT должно быть удалено из тканей перед сфинголипидомическим анализом РС.

В предыдущем отчете мы подтвердили протокол удаления соединения OCT из образцов человека для анализа LC-ESI-MS/MS11 и методологию, используемую для взвешивания тканей для нормализации данных11. Здесь мы подробно описываем этапы протокола удаления соединений sphingolipidomic OCT (sOCTrP) и показываем репрезентативные данные опухолей аденокарциномы легких человека и нормальных прилегающих невовлеченных тканей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Деидентифицированные легочные ткани человека были получены из Университета Содружества Вирджинии (VCU) Tissue and Data Acquisition and Analysis Core в соответствии с протоколом (#HM2471), утвержденным внутренним наблюдательным советом (IRB). Использование мышей для исследования и сбора тканей мышей было одобрено институциональным комитетом по уходу и использованию животных VCU (IACUC).

1. Подготовка материалов

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги должны быть выполнены за день до промывания тканей.

  1. Предварительно маркировать и взвешивать 1,5 мл полипропиленовых центрифужных трубок с краткими, но четкими идентификационными кодами для каждого образца, который будет обработан на следующий день. Используйте химически стойкий перманентный маркер (см. Таблицу материалов), который не исчезнет при повторной обработке трубы.
  2. Откройте электронную таблицу и пометьте последовательные столбцы со следующими заголовками столбцов: идентификатор трубки (ID), только трубка, трубка с тканью и общая ткань. Введите идентификаторы трубок, которые будут обработаны, в столбец с маркировкой идентификатор трубки.
  3. Предварительная калибровка и обнуление аналитической шкалы. Поместите чистую колбу Эрленмейера объемом 10 мл в центр балансировочной пластины (колба будет действовать как держатель трубки). Закройте дверцу весовой камеры и обведите колбой весы.
  4. Вес 1,5 мл центрифужных трубок. Осторожно поместите трубку в колбу и закройте дверцу весовой камеры. Дайте весу стабилизироваться и запишите вес только в колонке, помеченной трубкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте перемещения колбы Эрленмейера объемом 10 мл при взвешивании трубок. Если колба перемещена, перецентрируйте колбу и снова снимите баланс. Поместите закрытые трубки в стеллаж и храните до тех пор, пока это не понадобится.
  5. Предварительно этикетируйте стеклянные трубки и колпачки с винтовым верхом 13 х 100 мм с идентификационными кодами и заполняйте их 2 мл метанола марки LC-MS. Поместите их в стойку для трубок, закройте трубки крышкой и храните в холодильнике (4 °C) до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте дозатор растворителя для бутылок (см. Таблицу материалов). Если один из них недоступен, используйте стеклянные пипетки, чтобы избежать использования пластмасс при дозировании органических растворителей.
  6. Предмаркировочные стеклянные пробирки 13 x 100 мм. Накройте крышкой и храните пробирки при комнатной температуре.
  7. Флаконы с автоинжектором предварительной маркировки с идентификационными кодами. Накройте крышкой и храните флаконы с автоинжектором при комнатной температуре до использования.
  8. Приготовьте фитили для сушки тканей.
    1. Начните с чистки хирургических ножниц, погрузив их в метанол класса LC-MS на 5 минут, а затем протрите их чистой лабораторной тканью.
    2. Используя перчатки без порошка, закрутите конец ткани лабораторного сорта (см. Таблицу материалов) до образования мелкоконечного фитиля диаметром 30-40 мм.
    3. С помощью ножниц, очищенных метанолом, вырежьте фитиль на толстом конце. Поместите фитили в чистую картонную коробку. Сделайте вдвое больше фитилей, чем потребуется для обработки всех образцов.
  9. Подготовьте укороченные наконечники пипетки объемом 1 мл. С помощью хирургических ножниц, очищенных метанолом, отрежьте 4-5 мм от наконечника пипетки объемом 1 мл и поместите наконечник обратно в держатель наконечника. Подготовьте в два раза больше подсказок, чем образцов для обработки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Они будут использоваться при извлечении промытых тканей из трубок. Не прикасайтесь к концу наконечника.
  10. Предварительный прохлад молекулярной биологии сорт фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) до 4 °C (достаточно 0,5 л). Это будет использоваться для извлечения образцов. Для каждого образца, который будет обработан, предварительно охладите (4 °C) 60 мл сверхчистой деионизированной воды.
  11. Подготовка внутренних стандартов масс-спектрометрии. Растворяют следующие липиды в этаноле:метанол:вода (7:2:1; v/v/v) в концентрации 25 нмоль/мл: d17:1-сфингозин, (2S,3R,4E)-2-аминогептадек-4-ен-1,3-диол; d17:1-сфингозин-1-фосфат, гептадекасфинг-4-энин-1-фосфат; C12-керамид (d18:1/C12:0), N-(додеканоил)-сфинг-4-энин; C12-сфингомиелин (d18:1/C12:0), N-(додеканоил)-сфинг-4-энин-1-фосфохолин; C12-глюкозилцерамид (d18:1/C12:0), N-(додеканоил)-1-β-глюкозил-сфинг-4-эйн; C12-лактозилцерамид (d18:1/C12:0), N-(додеканоил)-1-ß-лактозил-сфинг-4-ен.

2. Промывка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение всех шагов в разделе 1 за один день до этого позволяет квалифицированному исследователю обрабатывать до 40 образцов в день, а новичкам ~ 10-15 образцов в день. Начинайте рано утром и не останавливайтесь, пока не будут завершены все шаги в разделах 2.1-3.8.

  1. В день, когда ткани будут обработаны, подготовьте рабочую зону шкафа биобезопасности, оснастив ее вихрем, полностью заряженным серологическим пипеттором и лотком для льда. Для всех этапов в этом разделе надевайте соответствующие СИЗ, включая лабораторный халат, двойной слой перчаток и защитные очки. ВНИМАНИЕ: Человеческие ткани и жидкости следует рассматривать и рассматривать как биологически опасные материалы.
  2. Предварительное охлаждение (4 °C) центрифуги с качающимся ковшом, любые адаптеры, необходимые для хранения конических центрифужных трубок объемом 15 мл, и крышки биоконтейнмента центрифуги. Предварительное охлаждение (4 °C) центрифуга с фиксированным углом, способная удерживать 1,5 мл центрифужных трубок.
  3. Если ткани не распределены в 15 мл полипропиленовых центрифужных пробирок, используйте очищенный метанолом шпатель (чистый для каждого нового образца ткани), чтобы перенести их в предварительно маркированные полипропиленовые трубки объемом 15 мл. Также нанесите маркировку на колпачки объемом 15 мл.
    1. Поместите трубчатую стойку, способную удерживать трубки центрифуги объемом 15 мл, в лоток для льда и наполните лоток льдом. Оттаивайте ткани, которые будут обработаны в этот день, поместив их в стойку на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимум 3-4 мг ткани должно быть запрошено из биорепозитория для обработки, поскольку ранее было показано, что протоколы промывания и взвешивания тканей являются точными и надежными при этих весах11.
  4. Переместите лоток для льда с образцами в шкаф биобезопасности.
  5. Выполните три цикла sOCTrP11 , как описано ниже (т.е. выполните шаги 2.5.1-2.5.5 три раза).
    1. Добавьте 10 мл ледяной сверхчистой деионизированной воды в каждую трубку и плотно закрывайте их крышкой. Дайте пробиркам инкубироваться в течение 10 минут.
    2. Энергично вихрьте каждую трубку в течение 10-20 с или до тех пор, пока вся ткань, нанесенная на стенки трубки, или тканевая гранула, не будет полностью повторно суспендирована.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В циклах sOCTrP 2-3 крайне важно, чтобы гранула была повторно суспендирована таким образом, чтобы любой ОКТ в грануле был разбавлен в промывочном растворе.
    3. Переложите трубки в предварительно охлажденную (4 °C) центрифугу с качающимся ковшом. Образцы центрифуг при 4000-5000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования и воздействия биоопасных аэрозолей, образующихся во время центрифугирования, путем герметизации носителей центрифуг крышкой биоконтейнмента (см. Таблицу материалов).
    4. Извлеките образцы из центрифуги и перенесите в лоток для льда. Поместите лоток в шкаф для биобезопасности и расстегните трубки. Сохраните колпачки.
    5. Осторожно аспирируйте раствор для мытья. Избегайте аспирации тканевого материала в грануле, оставляя ~ 0,5 мл супернатанта в пробирке. Закройте трубки крышками и избегайте перекрестного загрязнения, сопоставляя меченые колпачки с трубками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Моющий раствор (супернатант) на этапе 2.5.5 представляет собой биологически опасный материал; обрабатывать и утилизировать его в соответствии с руководящими принципами биобезопасности, подходящими для образцов человеческого происхождения.

3. Взвешивание тканей (для нормализации данных)

  1. После последнего цикла промывки sOCTrP тщательно аспирируйте большую часть моющего раствора, но не нарушайте гранулу. Оставьте ~0,5 мл промывочного раствора в пробирке.
  2. Используя укороченные наконечники пипетки (подготовленные на этапе 1.9), возьмите 500 мкл ледяного PBS и добавьте его в трубку.
    1. Используя тот же наконечник, аккуратно повторно суспендируйте гранулу и извлеките всю ткань. Избегайте турбулентного пипетирования, чтобы уменьшить потерю ткани за счет ее прикрепления к стенкам трубки и наконечника пипетки.
  3. Добавьте повторно суспендированную ткань в соответствующую предварительно маркированную и предварительно взвешенную трубку центрифуги объемом 1,5 мл и поместите трубку на лед. Повторите для всех тканей в наборе данных.
  4. Поместите пробирки объемом 1,5 мл в предварительно охлажденную центрифугу и гранулируйте ткани при 7000 х г в течение 5-7 мин и 4 °C.
    1. Извлеките трубки и тщательно аспирируйте как можно больше PBS, не нарушая гранулы. Поместите трубку обратно на лед.
  5. Центрифужные трубки в течение дополнительных 3 мин при 7000 х г для обеспечения хорошего гранулирования тканей. Переложите трубки на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная стадия центрифугирования важна для предотвращения потери тканей при удалении всего промывочного раствора и впитывания. При обработке более пяти образцов повторите стадию центрифугирования 3 мин 7000 х г после обработки каждого пятого образца, чтобы обеспечить гранулирование тканей.
  6. Используя фитили, приготовленные на этапе 1.8, аккуратно удалите оставшийся раствор для мытья. Используйте чистый фитиль для каждого образца. Допустимо аккуратно смазать ткань фитилем, который поможет удалить большую часть моющего раствора, но избежать потери какой-либо ткани при прилипании к фитилю. Закройте трубку и поместите ее на лед.
  7. Взвесьте каждую трубку в недавно откалиброванных, смолистых и обнуленных аналитических весах.
    1. Поместите каждую трубку в стеклянную колбу Erlenmeyer и закройте дверцу камеры. Когда вес стабилизируется, запишите его в колонку электронной таблицы, помеченную трубкой с тканью.
    2. После взвешивания поместите трубку обратно на лед.
  8. Добавьте 300 мкл ледяного PBS. Используя укороченный наконечник пипетки (этап 1.9), осторожно извлеките всю ткань и нанесите в предварительно маркированную стеклянную трубку с винтовым верхом (подготовленную на этапе 1.5), содержащую 2 мл ледяного метанола класса LC-MS (добавьте ткань к метанолу, а не к боковой части трубки).
  9. Рассчитайте количество ткани, которая была промыта, вычитая только трубку из трубки со значением ткани. Запишите это число в столбец общей ткани. Общее значение ткани будет использоваться для нормализации данных масс-спектрометрии на шаге 6.12.
  10. Храните образцы при температуре -80 °C до готовности к выполнению шагов 4.1-4.15.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это хорошая остановка, и образцы могут безопасно храниться в течение нескольких недель при -80 °C. Для других методов нормализации тканей, таких как концентрация белка или содержание липидного фосфата, обратитесь к Rohrbach et al.11.

4. Экстракция липидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Важно начинать эти шаги утром, особенно когда будет обработано много образцов. Перед началом работы предварительно нагрейте водяную баню или инкубатор до 48 °C.

  1. Извлеките образцы, подготовленные на этапе 3.8, и стандарты липидов MS (подготовленные на этапе 1.11) из морозильной камеры. Дайте им уравновеситься до комнатной температуры в течение 20 мин.
  2. Вихрь и погружение внутреннего стандартного раствора в ультразвуковую водяную баню (см. Таблицу материалов) на 2-3 мин или до полного растворения липидных эталонов MS перед дозированием в образцы. Это позволит избежать ошибок при нормализации данных.
  3. Используя повторяющуюся пипетку, добавляют 250 пмоль (10 мкл из раствора 25 нмоль/мл, приготовленного на стадии 1.11) внутренних стандартов масс-спектрометрии в каждую трубку. Слегка обложите трубки.
  4. Для облегчения гомогенизации отрегулируйте объем метанола до 2 мл. Используйте только метанол марки LC-MS/MS.
  5. Работая по одной трубке за раз, используйте гомогенизатор для тритурации ткани до тех пор, пока не будут видны сгустки (обычно 5-20 с). Переместите наконечник гомогенизатора круговыми движениями и осторожно прижмитесь к стенке трубки, чтобы облегчить тритурацию. Снова закройте трубку крышкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечение того, чтобы все ткани были тонко тритурированы, максимизирует извлечение липидов. Не добавляйте хлороформ в образцы перед гомогенизацией, так как одноразовые наконечники гомогенизатора изготовлены из пластика, который растворится в растворах, содержащих хлороформ.
  6. Погружайте трубку под углом 45° в ультразвуковую водяную баню на 5-10 с.
    1. Если при погружении в ультразвуковую ванну не образуются сгустки ткани, закройте ее крышкой и перейдите к следующей трубке.
    2. Если сгустки тканей образуются, когда трубка погружается в ультразвуковую ванну, повторно гомогенизируйте и нацеливайтесь на сгустки.
    3. Повторяйте этот процесс (гомогенизация/погружение в ультразвуковую ванну) итеративно до тех пор, пока не будут разрушены все крупные сгустки тканей.
  7. В вытяжке добавьте хлороформ и метанол LC-MS в каждую трубку (используйте верхний дозатор для бутылок), чтобы достичь соотношения 2:1:0,1 метанол:хлороформ:вода. Используя чистые колпачки, плотно запечатайте трубки и оставьте на столешнице до конца дня.
    1. Для тканей массой 50 мг или менее используйте общий объем экстракции 4 мл и регулируйте с помощью этого соотношения (50 мг: 4 мл экстракционного раствора) для более крупных образцов.
  8. Перед выходом вечером поместите плотно закрытые трубки в водяную баню или инкубатор с температурой 48 °C и высиживайте их на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы трубки были плотно закрыты, чтобы соотношение растворителей не изменялось из-за испарения.
  9. На следующее утро извлеките образцы с водяной бани с температурой 48 °C и гранулируйте любой нерастворимый в растворителе мусор путем центрифугирования при 4000-5000 х г при 4 °C в течение 20 мин.
  10. Работая в вытяжке, тщательно декантируйте супернатант в предварительно маркированные 13 x 100 мм боросиликатные стеклянные пробирки. Наклоните трубку размером 13 x 100 мм под углом 30-45° для облегчения декантирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При обработке более 12 образцов не допускайте, чтобы центрифугированные трубки сидели в течение длительных периодов времени, так как гранулы будут размягчаться и нерастворимый мусор будет перенесен при выполнении этапа 4.10. Чтобы избежать этого, вынимайте только 12 трубок из центрифуги за раз и продолжайте центрифугировать другие трубки, пока вы не будете готовы их декантировать.
  11. Перенесите трубки в вакуумный концентратор, способный удерживать трубки размером 13 x 100 мм. Испарите весь растворитель с начальным шагом нагрева 1 ч (40 °C) и работайте под максимальным вакуумом.
  12. Извлеките трубки из вакуумного концентратора и добавьте 500 мкл метанола марки LC-MS (используйте верхний дозатор для бутылок) в каждую трубку.
  13. Повторно суспендируют высушенные липидные экстракты путем вихря в течение 5-10 с с последующим погружением трубок под углом 45° в ультразвуковую водяную баню на 2 мин при вращении трубки. Повторно вихрь на 5 с и погружение в ультразвуковую водяную баню на дополнительную минуту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это критический шаг для обеспечения максимального восстановления экстрагированных липидов. Не двигайтесь вперед, пока весь высушенный материал на стенке трубки не будет повторно суспендирован.
  14. Поместите трубки размером 13 x 100 мм в предварительно охлажденную (4 °C) центрифугу и удалите нерастворимый мусор центрифугированием при 4000-5000 х г при 4 °C в течение 20-30 мин.
  15. Тщательно декантируйте осветленный супернатант в предварительно маркированный флакон автоинжектора. Наклон флакона автоинжектора под углом 30-45° облегчит декантирование. Убедитесь, что все содержимое трубки размером 13 x 100 мм декантировано во флакон автозагрузчика.
  16. Плотно закройте трубки и храните трубки при -80 °C до анализа LC-ESI-MS/MS.

5. Анализ LC-ESI-MS/MS

ПРИМЕЧАНИЕ: В следующей процедуре используется двоичная насосная система, соединенная с автоинжектором, дегазатором и системой LC-MS/MS, работающей в трехквадрупольном режиме. Температуру колонны поддерживали с помощью колонной печи. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации об используемом оборудовании.

  1. Подготовьте подвижную фазу A1 (CH3OH:H2O:HCOOH, 58:41:1, v:v:v, с формитом аммония 5 мМ) и подвижную фазу B1 (CH3OH:HCOOH, 99:1, v:v, с формиатом аммония 5 мМ). Используйте только растворители класса LC-MS, воду и реагенты.
  2. Для каждого набора образцов подготовьте четыре заготовительных флакона, содержащих 500 мкл метанола марки LC-MS.
  3. Для каждого набора образцов готовят два внутренних стандартных (этикетка как IS) флакона автозагрузчика путем разбавления 10 мкл (всего 250 пмоль в каждом стандарте) внутреннего стандартного раствора, приготовленного на стадии 1.11 в 500 мкл метанола марки LC-MS.
  4. Установите температуру колонной печи на уровне 60 °C, а температуру источника ионов на 500 °C.
  5. Для анализа MS/MS используйте трехквадрупольный режим спектрометра. Установите первый квадруполь (Q1) для прохождения ионов-предшественников, в то время как третий квадруполь (Q3) для прохождения молекулярно отличительных ионов продукта (или сканирование через несколько m/z в Q1 или Q3), используя N2 для коллизионного индуцирования диссоциаций в квадруполе 2 (Q2), который смещен от Q1 на 30-120 эВ.
  6. Установите окно обнаружения нескольких пар мониторинга реакций (MRM) на 120 с с целевым временем сканирования 1,0 с. В таблице 1 приведен список пар МИМ, энергий ионизации и энергий столкновений.
  7. Используйте следующие параметры для разрешения сфинголипидов на стадии LC: используя скорость потока 0,7 мл/мин, уравновешивайте столбец обратной фазы C18 размером 2,1 (т.д.) x 50 мм в течение 0,5 мин смесью растворителей 95% подвижной фазы A1 и 5% подвижной фазы B1.
    1. После инъекции образца поддерживайте соотношение подвижной фазы A1/B1 на уровне 95/5 в течение 2,25 мин с последующим линейным градиентом до 100% B1 в течение 1,5 мин, который затем удерживают при 100% B1 в течение 5,5 мин с последующим возвратом градиента до 95/5 A1/B1.
    2. После прогона повторно уравновешивают колонну смесью 95/5 А1/В1 в течение 0,5 мин.
  8. Используйте следующие настройки для автозагрузчика образцов: объем промывки, 500 мкл; ход иглы, 52 мм (это должно быть отрегулировано в зависимости от размера флакона и объема в каждом флаконе); скорость промывки, 35 мкл/с; скорость дискретизации, 5,0 мкл/с; время погружения промывки, 2 с; режим полоскания, до и после аспирации; время промывки,2 с.
  9. Поместите образцы, подготовленные на этапе 4.15, в лоток автозагрузчика в следующем порядке: Пустой; ЕСТЬ; Пустой; Образцы, подготовленные на этапе 4.15; Пустой, IS, Пустой.
  10. Анализируйте 5-10 мкл каждого образца с помощью LC-ESI-MS/MS. Анализируйте один и тот же объем для всех образцов в наборе данных.

6. Обработка, интеграция и нормализация данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя следующие шаги описывают процедуру для конкретного программного обеспечения (см. Таблицу материалов), аналогичные процедуры на эквивалентных приборах и программном обеспечении LC-MS могут быть использованы для интеграции пар MRM для анализируемых классов липидов и соответствующих внутренних стандартов.

  1. Откройте программное обеспечение для количественного определения. На вкладке Quantitate дважды щелкните мастер quantitation. Во всплывающем окне в крайней левой рабочей области перейдите к нужному набору данных и щелкните его левой кнопкой мыши. Доступные образцы будут показаны в средней рабочей области.
  2. Выделите анализируемые образцы, а затем щелкните стрелку вправо, чтобы добавить образцы в рабочую область Выбранные образцы . Нажмите кнопку Далее , чтобы перейти к экрану настроек и запросов, где обычно используются параметры по умолчанию.
  3. Нажмите Далее , чтобы перейти к экрану выбора метода интеграции. Выберите подходящий метод интеграции, содержащий пары переходов MRM для анализируемых липидов. Пары переходов управления записями сообщений приведены в таблице 1 . Нажмите «Финиш».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время хранения зависит от приборов и индивидуальных настроек и поэтому должно быть проверено для каждой отдельной установки.
  4. На панели навигации щелкните панель Пиковый обзор , чтобы можно было проверить пары управления записями сообщений. Чтобы упростить просмотр, щелкните правой кнопкой мыши панель «Обзор пиков », измените автоматическое масштабирование на 100% от наибольшего пика и окно масштабирования 1,00 - 2,00 минуты.
  5. Щелкните правой кнопкой мыши на окне Quantitation Display и выберите Analyte и нужный sphingolipid для изучения. Убедитесь, что в образцах Blank нет пиков и что правильный пик интегрирован в образцы IS.
  6. Начните интеграцию неизвестных образцов. Работая по одному классу sphingolipid за раз, проверяйте время удержания пары MRM внутреннего стандарта (т.е. C12:0). ceramide) и убедитесь, что программное обеспечение интегрировало правильный пик.
  7. Продолжайте переходить к аналитам того же класса липидов (т.е. C14:0) керамид, C16:0-керамид и др.), начиная с самого короткого липида длины цепи в классе. Убедитесь, что для каждого липида длиной цепочки программная процедура интегрировала правильный пик пары управления записями сообщений.
  8. Когда все аналиты будут интегрированы, создайте электронную таблицу для каждого анализируемого вида сфинголипидов (например, керамиды, сфингомиелины и т. Д.). Заголовки столбцов меток соответствуют порядку анализируемых веществ и длине цепи в программном обеспечении для количественного определения LC-MS/MS. Также включите заголовок столбца для идентификатора образца и весов нормализации образца, определенных на шаге 3.9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как описано ранее11, другие общие меры нормализации включают общее содержание липидфосфата или количество белка.
  9. Экспортируйте или скопируйте пиковые области для всех анализируемых веществ и внутренних стандартов в электронную таблицу.
  10. Нормализуйте данные, разделив интегрированную пиковую площадь каждого вида длиной цепи для данного класса сфинголипидов на пиковую площадь соответствующего ему внутреннего стандарта. Например, C14:0 керамид, C16:0 керамид, церамид C18:1 и т.д. должны быть разделены на C12:0 керамидная внутренняя стандартная пиковая область.
  11. Преобразование пиковой площади в моли восстановленного липида путем умножения нормализованной пиковой площади (рассчитанной на шаге 6.10) на количество внутреннего стандарта в пикомоле, которое было добавлено к образцу на этапе 4.3. В этом протоколе это количество составляет 250 пмоль.
  12. Чтобы получить относительное количество липидов в каждом образце, разделите пикомолы длины каждой липидной цепи на вес ткани, определенный на этапе 3.9. Это даст единицы пикомолей липидов на мг ткани.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе мы подробно описываем метод удаления ОКТ из крио-сохраненных тканей человека и взвешиваем ткани для анализа LC-ESI-MS/MS. Материалы, необходимые для этой процедуры, перечислены в Таблице материалов. На рисунке 1 показаны результаты типичного эксперимента, в котором 10 опухолей аденокарциномы легкого человека и 10 нормальных соседних тканей были промыты для удаления ОКТ и проанализированы LC-ESI-MS / MS. Важно отметить, что, как мы ранее показали

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ОКТ является распространенным долгосрочным криосохраняющим агентом, используемым в биорепозиториях. Однако ОКТ может привести к подавлению ионов, когда ткани анализируются различными масс-спектрометрическими платформами 12,13,14,15, или привести к потере сигнала, когда образцы анализируются LC-ESI-MS/MS11. OCT в криоконсервированных тканях также может мешать методам норм...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Услуги и поддержка исследовательского проекта были предоставлены VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core и VCU Lipidomics and Metabolomics Core, которые частично поддерживаются финансированием nih-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Эта работа была поддержана Национальными институтами грантов здравоохранения R21CA232234 (Сантьяго Лима).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мл полипропиленовые наконечники для пипеткиNANA Используется для извлечения образцов
1,5 мл полипропиленовые центрифужные пробиркиNANA
10 мл Колба ЭрленмейераVWR89091-116Используется для взвешивания пробирок и тканей
AB Sciex Analyst 1.6.2SciexNAПрограммное обеспечение для анализа и интеграции данных MS
формиата аммонияFisher ScientificA11550Для подвижных фаз LC
Аналитические весыNANAВесы с точностью до 0,1 мг
Диспенсер для бутылокSartoriusLH-723071Используется для дозирования растворителей
C12-Керамид (d18:1/C12:0); N-(додеканоил)-сфинг-4-енинAvanti Polar LipidsLM2212Внутренний стандарт
C12-глюкозилцерамид (d18:1/12:0); N-(додеканоил)-1-&бета;-глюкозил-сфинг-4-эйнAvanti Polar LipidsLM2511Внутренний стандарт
C12-лактозилцерамид (d18:1/12:0); N-(додеканоил)-1-ß-лактозил-сфинг-4-енAvanti Polar LipidsLM2512Внутренний стандарт
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(додеканоил)-сфинг-4-енин-1-фосфохолинAvanti Polar LipidsLM2312Внутренний стандарт
ХЛОРОФОРМ OMNISOLV 4LVWREM-CX1054-1
ClickSeal Крышки для биоизоляцииThermo Scientific75007309Для предотвращения биологически опасных аэрзолей во время центрифугирования
ConfliktDecon Labs4101Обеззараживающее средство
Колонная печь CTO-20A/20ACShimadzuNAдля LC
d17:1-сфингозин;   (2S,3R,4E)-2-аминогептадек-4-ен-1,3-диолAvanti Polar LipidsLM2000Внутренний стандарт
d17:1-Сфингозин-1-фосфат; гептадекасфинг-4-енин-1-фосфатAvanti Polar LipidsLM2144Внутренний стандарт
DGU20A5R дегазаторShimadzuNA
Одноразовые пробирки для культивирования 13x100 ммVWR53283-80013x100 мм Пробирки с завинчивающейся крышкой
Водяная баня с подогревомNANAДля ночной экстракции липидов
Гомогенизатор 150Fisher Scientific15-340-167тритуратные салфетки
Гомогенизатор Пластиковый одноразовый генератор ЗондFisherScientific 15-340-177для гомогенизации
Kimwipes Kimtech34120Салфетка лабораторного класса, используемая для изготовления фитилей
Метанол LC-MS Grade 4LVWREM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD бинарная насосная системаShimadzuNAДля LC-MS
Перманентный маркерVWR52877-310
Фенольная винтовая резьба Застежка, Kimble Chase (колпачки для одноразовых культуральных пробирок)VWR89001-50213x100 мм крышки трубок с завинчивающейся вершиной
Фосфат полированный физиологический ThermoScientific10010023Для извлечения образцов из пробирок после промывки
Пипетка-репетирEppendorf4987000118Для дозирования внутренних стандартов LC-MS
Винтовые крышки, синие, красные ПТФЭ/Белый СиликонVWR89239-020Крышки флаконов автоинъектора Стеклянные
флаконы с винтовой резьбой Стеклянные флаконы с ID ПатчVWR46610-724Флаконы автоинъектора
SIL-30AC АвтоинъекторShimadzuNA
SpeedVacThermo ScientificSPD2030P1220Для сушки растворителей
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 мм Ascentis Express C18 колонкаSigma Aldrich581300-UДля LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS SYSTEMSciexNAДля LC-ESI-MS/MS
Ультразвуковая водяная баняBransonModel 2800для гомогенизации и ресуспендирования экстрагированных и высушенных липидов
VortexerNANA Для sOCTrP и ресуспендирования высушенных липидов
VWR Культуральные пробирки Одноразовое боросиликатное стеклоVWR4772957213x100 стеклянные пробирки для культуры
Water Hipersolve Chromanorm LC-MSVWRBDH83645.400

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maceyka, M., Spiegel, S. Sphingolipid metabolites in inflammatory disease. Nature. 510, 58-67 (2014).
  2. Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
  3. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
  4. Hla, T., Dannenberg, A. J. Sphingolipid signaling in metabolic disorders. Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).
  5. Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
  6. Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
  7. Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
  8. Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
  9. Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
  10. Morad, S. A. F., Cabot, M. C. Advances in Cancer Research. Chalfant, C. E., Fisher, P. B. 140, Academic Press. 235-263 (2018).
  11. Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
  12. Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
  13. Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
  14. Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
  15. Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Sphingolipid AnalysisMass SpectrometryOCT RemovalLipid ExtractionHuman Tissue PreparationCryopreserved TissuesLiquid ChromatographyTandem Mass SpectrometryTissue BiorepositoryCeramide Quantification

Похожие статьи