Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Получение макрофагов из моноцитов человека для оценки скорости инфицирования Leishmania braziliensis и врожденного иммунного ответа хозяина

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62555

⸱

7 августа 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Oswaldo Cruz Foundation, Gonçalo Moniz Institute, 2Federal University of Bahia, 3National Institute of Science and Technology (INCT), Research Institute in Immunology, 4Senai Institute for Innovation in Advanced Health Systems, National Service for Industrial Learning, Integrated Manufacturing and Technology Campus, SENAI - CIMATEC Salvador

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает процесс получения макрофагов человека из моноцитов для инфицирования Leishmania braziliensis. Это также позволяет исследователям оценивать частоту инфекции и жизнеспособность паразитов, продукцию АФК с помощью флуоресцентной микроскопии и выработку медиаторов воспаления в надосадочной жидкости культуры для изучения реакции макрофагов на инфекцию.

Аннотация

Макрофаги являются многофункциональными клетками, необходимыми для функционирования иммунной системы, и основной клеткой-хозяином при инфекции Leishmania braziliensis (Lb). Эти клетки специализируются на распознавании микроорганизмов и фагоцитозе, но также активируют другие иммунные клетки и присутствующие антигены, а также способствуют воспалению и восстановлению тканей. В этой статье мы описываем протокол получения мононуклеарных клеток из периферической крови (PBMC) здоровых доноров для разделения моноцитов, которые затем дифференцируются в макрофаги. Затем эти клетки могут быть инфицированы in vitro в различных концентрациях Lb для оценки способности контролировать инфекцию, а также для оценки иммунного ответа клетки-хозяина, который может быть измерен несколькими методами. PBMC сначала выделяли центрифугированием с градиентом Фиколла-Гипака, а затем покрывали пластинами, чтобы моноциты могли прилипать к культуральным планшетам; Неадгезивные клетки удаляли путем промывки. Затем адгезивные клетки культивировали макрофагально-колониестимулирующим фактором (M-CSF) в течение 7 дней для индуцирования дифференцировки макрофагов. Мы предлагаем наносить 2 x 106 клеток на лунку на 24-луночные планшеты с целью получения 2 x 105 макрофагов. Полностью дифференцированные макрофаги могут быть инфицированы Lb в течение 4 или 24 часов. Этот протокол приводит к значительному проценту инфицированных клеток, который можно оценить с помощью оптической или флуоресцентной микроскопии. Помимо индекса заражения, паразитарную нагрузку можно измерить, подсчитав количество паразитов внутри каждой клетки. Дальнейшие молекулярные и функциональные анализы также могут быть выполнены в культуральных надосадочных зонтах или внутри самих макрофагов, что позволяет применять этот протокол в различных контекстах, а также адаптировать к другим внутриклеточным видам паразитов.

Введение

Внутриклеточный простейший паразит рода Leishmania является возбудителем забытого комплекса заболеваний, известного как лейшманиоз1. Эти тропические болезни имеют широкий спектр клинических проявлений, которые могут варьироваться от поражений кожи до осложнений, возникающих в результате висцеральной формы заболевания, которые при отсутствии лечения могут привести к летальному исходу. Кожный лейшманиоз (КЛ) является наиболее частой формой лейшманиоза и характеризуется одним или несколькими изъязвленными поражениями кожи с обострением хронического воспаления2. Развитие заболевания зависит от вида Leishmania, в дополнение к комбинации факторов, связанных с иммунным ответом хозяина, которые определяют клинические исходы 3,4. Leishmania braziliensis является основным видом, вызывающим CL в Бразилии, при этом случаи зарегистрированы во всех штатах страны5. Иммунный ответ против L. braziliensis считается защитным, поскольку он ограничивает паразита до места инокуляции, и включает несколько типов иммунных клеток, таких как макрофаги, нейтрофилы и лимфоциты 4,6,7.

Макрофаги являются многофункциональными клетками, необходимыми для иммунной системы, поскольку они специализируются на обнаружении и фагоцитозе микроорганизмов, а также могут представлять антигены и активировать другие типы клеток. Макрофаги способны регулировать процессы от воспаления до восстановления тканей и поддержания гомеостаза 8,9. Эти клетки играют важную роль в раннем иммунном ответе против внутриклеточных паразитов, таких как Leishmania, что важно для их уничтожения 10,11,12.

Во время инфекции L. braziliensis макрофаги могут реагировать с помощью различных механизмов элиминации паразита, таких как производство активных форм кислорода (АФК) и медиаторов воспаления13,14. Иммунные реакции могут определяться выработкой провоспалительных или противовоспалительных цитокинов, которые способствуют обострению воспалительного состояния или процессам восстановления тканей 6,15,16. Пластичность макрофагов имеет основополагающее значение для иммунопатогенеза КЛ, а также для взаимодействия паразита и хозяина, и эти клетки считаются критически важными для выяснения механизмов заболевания и разработки новых терапевтических подходов.

Поскольку ХЛ является сложным заболеванием, исследования требуют от исследователей изучения типов клеток, которые имитируют те, которые обнаружены у человека. Иммунные реакции, наблюдаемые в различных экспериментальных моделях, могут варьироваться и давать результаты, которые не отражают иммунный ответ, наблюдаемый у естественно инфицированных людей. Таким образом, представленный здесь протокол был разработан для изучения макрофагов человека и их иммунных реакций во время КЛ, вызванных L. braziliensis.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Институциональный наблюдательный совет по этике в исследованиях человека при Институте Гонсалу Мониша (Oswaldo Cruz Foundation-IGM-FIOCRUZ, Сальвадор, Баия-Бразилия) одобрил это исследование (номер протокола: CAAE 95996618.8.0000.0040).

1. Изоляция МПМП человека

  1. Убедитесь, что образцы крови, градиент плотности 1,077 г/мл (например, Ficoll-Histopaque) и солевой раствор имеют комнатную температуру.
  2. Образцы крови разбавляют физиологическим раствором в соотношении 1:1.
  3. Перенесите 10-12 мл градиента плотности в пробирки объемом 50 мл.
  4. Осторожно наложите до 40 мл разбавленной крови на градиент плотности. Отделите слои градиента крови и плотности.
  5. Первое центрифугирование: центрифужные пробирки, содержащие слои крови и градиента плотности при 400 x g в течение 30 мин при 24 ºC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выключите тормоз перед запуском центрифуги.
  6. Удалите плазму над кольцом PBMC с помощью пипетки (охристый слой оболочки расположен между плазмой и слоями градиента плотности; ниже него находятся эритроциты/гранулы гранул гранул эритроцитов).
  7. Перенесите облачный слой PBMC (слой охристого покрытия) с помощью пипетки в пробирку объемом 15 мл и заполните холодным физиологическим раствором (храните на льду или при температуре 4 °C).
  8. Второе центрифугирование: центрифужные пробирки при давлении 300 x g в течение 10 мин при 4 °C с включенным тормозом.
  9. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу, заполнив трубку холодным физиологическим раствором.
  10. Третье центрифугирование: центрифужные пробирки при давлении 250 x g в течение 10 мин при 4 °C с включенным тормозом.
  11. Выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте гранулу, заполнив трубку холодным физиологическим раствором.
  12. Четвертое центрифугирование: центрифугирование пробирки при давлении 200 x g в течение 10 мин при 4 °C с включенным тормозом.
  13. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу с 1 мл холодной среды RPMI.
  14. Подсчитайте ячейки, чтобы определить количество полученных ячеек.

2. Дифференцировка в макрофаги человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Для 24-луночного планшета рассчитайте общее количество клеток, необходимое для планшета 2 x 106 клеток на лунку, что даст 2 x 105 макрофагов. Этот выход основан на среднем 10% моноцитов в крови человека. В качестве альтернативы, моноциты также могут быть высвобождены неферментативными методами, а затем подсчитаны для осаждения.

  1. На 24-луночную пластину поместите на дно каждой лунки круглые стеклянные покровные стекла диаметром 13 мм. Наложите эквивалент 2×106 клеток в 1 мл РПМИ неполного состава на лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте количество клеток в каждой лунке, так как завышенное количество может препятствовать адгезии клеток и поставить под угрозу культивирование. Кроме того, все покровные стекла должны быть чистыми и стерильными.
  2. Инкубируйте планшеты в течение 30 минут при 37 ºC при 5%CO2 для адгезии клеток.
  3. Удалите надосадочную жидкость и промойте один раз 0,9% физиологическим раствором при комнатной температуре, чтобы удалить любые неадгезивные клетки.
  4. После промывания удалите физиологический раствор и добавьте в каждую лунку 250 μл дополненной среды RPMI комнатной температуры (10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина, 100 μг/мл стрептомицина и 50 нг/мл M-CSF).
  5. Инкубируйте клетки в течение 7 дней при 37 ºC при 5%CO2.
    1. Добавляйте 125 мкл добавленной среды RPMI в каждую лунку каждые два дня. В конце дифференцировки клеток конечный объем составит 500 мкл на лунку.
    2. Чтобы проанализировать жизнеспособность клеток, параллельно проведите еще одну культуру на 96-луночном планшете (2 x 105 на лунку).
    3. После дифференцировки в макрофаги (7 дней) добавьте 20 мкл реагента AlamarBlue.
    4. Через 7 часов инкубации считывают показания планшетов на спектрофотометре на длинах волн 570 нм и 600 нм.

3. Бактериологическое исследование и инфекция лейшмании

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе использовались промастиготы L. braziliensis из двух разных штаммов (MHOM/BR/01/BA788 и MHOM/BR88/BA-3456).

  1. Подсчитайте Lb паразитов и рассчитайте объем, чтобы получить 5 x 105/мл паразитов.
  2. Приготовьте с добавок среду Schneider's Insect (10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина).
  3. Инкубировать паразитов в общем объеме 5 мл в инкубаторе с температурой 24 ºC до достижения стационарной фазы (от 4 до 6 дней).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитывайте паразитов каждый день, чтобы оценить рост.
  4. После достижения стационарной фазы центрифугируйте культуры Leishmania при 100 x g в течение 10 минут при 4 ºC, чтобы удалить всех мертвых паразитов (осажденных на дне пробирки).
  5. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и центрифугуйте при давлении 1 800 x g в течение 10 минут при 4 ºC для извлечения жизнеспособных паразитов. Выбросьте надосадочную жидкость.
  6. Повторно суспендируйте гранулу с 1 мл добавленной среды RPMI для подсчета паразитов.
  7. Рассчитайте количество паразитов, чтобы получить соотношение паразит:клетка 10:1. Перенесите паразитов в культуральные планшеты, содержащие макрофаги, предварительно культивированные в дополненной среде RPMI (~300 мкл/лунка) при комнатной температуре.
  8. Удалите надосадочную жидкость из каждой лунки, содержащей дифференцированные макрофаги.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как можно скорее замените среду в каждой лунке, чтобы клетки не проводили длительные периоды без среды. Мы предлагаем удалять и заменять среду в трех лунках за один раз.
  9. Перенесите рассчитанное количество Lb в каждую лунку, содержащую дифференцированные макрофаги.
  10. Заражайте клетки в течение 4 или 24 часов при температуре 37 ºC при 5%CO2.
    1. Через 4 часа промойте макрофаги 3 раза физиологическим раствором комнатной температуры, чтобы удалить любых неинтернализованных паразитов.
    2. В течение 24-часового периода заражения добавьте по 300 мкл добавленной среды RPMI в каждую лунку после промывки, а затем повторно инкубируйте еще 20 часов при 37 °C при 5%CO2.
  11. Удалите надосадочную жидкость для измерения медиаторов воспаления с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), следуя инструкциям производителя.
    1. Собранную надосадочную жидкость центрифугировать при 1800 x g в течение 10 мин при комнатной температуре. Переложите надосадочную жидкость в новую трубку. Эта процедура проводится для удаления любых неинтернализованных паразитов. Надосадочная жидкость может быть заморожена и храниться при температуре -80°C до момента проведения будущего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть использованы для оценки уровня инфекции, жизнеспособности паразитов или продукции АФК.

4. Оценка инфекции

  1. Количественная оценка уровня инфицирования
    1. Добавьте по 300 мкл метанола в каждую лунку после удаления надосадочной жидкости. Дайте 15 минут закрепить ячейки, прилипшие к покровным стеклам.
    2. Снимите покровные стекла с лунок и положите на подставку, чтобы замочить в растворе для окрашивания клеток (например, Quick Panoptic 2) на 1 минуту.
    3. Дважды погрузите покровные стекла в раствор для окрашивания клеток (например, Quick Panoptic 3) и подождите, пока они высохнут.
    4. Поместите 15 μL монтажного носителя (например, Entellan) на предметные стекла, а затем наденьте на носитель покровные стекла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все макрофаги, прикрепленные к покровным стеклам, должны находиться в контакте с монтажной средой.
    5. Подсчитайте 100 клеток случайным образом под оптическим микроскопом с помощью 100-кратного объектива, чтобы количественно оценить скорость инфицирования и количество интернализованных амастиготов.
  2. Жизнеспособность паразитов
    1. Через 4 часа заражения промойте клетки физиологическим раствором комнатной температуры 3 раза.
    2. Добавьте 300 мкл добавленной среды Schneider's Insect.
    3. Инкубируйте в инкубаторе с температурой 24 ºC.
    4. Количественно оценивайте рост паразитов через 48, 72, 96 и 120 часов.

5. Оценка продукции АФК методом флуоресцентной микроскопии

  1. После периода заражения удалите надосадочную жидкость и промойте клетки 500 мкл физиологического раствора.
  2. Добавьте в каждую лунку по 300 мкл реагента флуорогенного зонда (например, зеленого реагента CellROX в концентрации 5 мкМ).
  3. Инкубируйте клетки в течение 30 минут при 37 ºC и 5%CO2.
  4. Промойте ячейки 3 раза 500 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS).
  5. Зафиксируйте клетки 300 мкл 3,7% формальдегида и оставьте на 15 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте сигнал цветения в течение 24 часов.
  6. Добавьте 5 μЛ окрашивающего агента DAPI (например, DAPI ProLong Gold antifade) для окрашивания клеток. Поместите покровное стекло с поверхностью, содержащей макрофаги, в непосредственный контакт с красителем DAPI.
  7. Анализ сигнала флуоресценции с помощью флуоресцентной микроскопии на длине волны возбуждения 485/520 нм.
  8. Рассчитайте скорректированную общую флуоресценцию клеток (CTCF) по 30 ячейкам для каждого покровного стекла с помощью ImageJ.
    CTCF = Интегрированная плотность (Площадь выбранной ячейки x Средняя флуоресценция фоновых показаний)

6. Статистический анализ

  1. Используйте тест Манна-Уитни для сравнения двух групп с непарными выборками. Выполняйте статистический анализ с помощью GraphPad Prism 7.0. Учитывайте статистически значимые различия при p < 0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Понимание взаимодействия паразитов и клеток хозяина имеет решающее значение для выяснения механизмов, участвующих в патогенезе некоторых заболеваний. Несмотря на то, что культивируемые клетки человека используются реже из-за ограничений клеточной культуры по сравнению с клеточными линиями, представленный здесь протокол демонстрирует надежную и воспроизводимую дифференцировку макрофагов человека. Этот протокол позволяет анализировать несколько аспектов иммунного ответа и клеточной биологии, от выработки медиаторов воспале...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Представленный в данной работе протокол дифференцировки моноцитов человека в макрофаги с последующим заражением двумя штаммами L. braziliensis позволяет оценить несколько аспектов взаимодействия паразита с клеткой. Эти инструменты могут иметь решающее значение для прояснения оставшихся без ответа вопросов о CL. С созданием этого протокола наша группа смогла раскрыть некоторые аспекты иммунного ответа макрофагов, полученных от людей с диабетом и CL14.

...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) в рамках гранта No PET0009/2016 и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazil (CAPES) в соответствии с Финансовым кодексом 001.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АламарBlue Реагент жизнеспособности клетокИнвитрогенDAL1100
колба для клеточных культур 25 см²SPL70125
CellROX Зеленый реагентInvitrogenC10444
Покровные круги 13 ммPerfecta10210013CE
DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол)ThermoFisherD1306
Одноразовая подставка для сбора кровиBD Vacutainer364815
игла для сбора крови Eclipse 21 г x 1,25 дюймаBD Vacutainer368607
EntellanSigma Aldrich107961
Falcon Conical Tubes, 15 млSigma AldrichCLS430791-500EA
Falcon Conical Tubes, 50 млStemCell Technologies100-0090
Фетальная бычья сывороткаGibcoA4766801
формальдегидом 3,7%Merck252549
Предметное стекло 25,4x76,2ммPerfecta0200
HistopaqueSigma Aldrich10771
Человек IL-6 Набор ИФАRDDY206
Человек M-CSF Рекомбинантный белокPeproTech300-25
Человек TNF-a Набор ИФАRDDY210
Лейкотриен B4 Набор ИФА Кайман
МетанолMerckMX0482
Пенилицин-Стрептомицин-Глутамин (100x)ThermoFisher10378-016
Фосфатный буферный физиологический раствор pH 7,2 (10x)Gibco70013032
Плазменная трубка, 158 единиц USP гепарина натрия (покрытый аэрозолем)BD Vacutainer367874
Quick H& Набор для окрашивания (гематоксилин и эозин)abcamab245880
RPMI 1640 MediumGibco11875093
Schneider's Insect MediumSigma AldrichS0146
Культура тканей 24-лунки ПланшетTPPZ707791-126EA
Trypan BlueGibco15250061
520111

Ссылки

  1. Desjeux, P. Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 27 (5), 305-318 (2004).
  2. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. The Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  3. Arenas, R., Torres-Guerrero, E., Quintanilla-Cedillo, M. R., Ruiz-Esmenjaud, J. Leishmaniasis: A review. F1000Research. 6, 1-15 (2017).
  4. Scott, P., Novais, F. O. Cutaneous leishmaniasis: Immune responses in protection and pathogenesis. Nature Reviews Immunology. 16 (9), 581-592 (2016).
  5. Bittencourt, A. L., Barral, A. Evaluation of the histopathological classifications of American cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 86 (1), 51-56 (1991).
  6. Scorza, B. M., Carvalho, E. M., Wilson, M. E. Cutaneous manifestations of human and murine leishmaniasis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
  7. Carvalho, L. P., Passos, S., Schriefer, A., Carvalho, E. M. Protective and pathologic immune responses in human tegumentary leishmaniasis. Frontiers in Immunology. 3, 1-9 (2012).
  8. Wood, W., Martin, P. Macrophage Functions in Tissue Patterning and Disease: New Insights from the Fly. Developmental Cell. 40 (3), 221-233 (2017).
  9. Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
  10. Ribeiro-Gomes, F. L., et al. Macrophage Interactions with Neutrophils Regulate Leishmania major Infection. The Journal of Immunology. 172 (7), 4454-4462 (2004).
  11. Liu, D., Uzonna, J. E. The early interaction of Leishmania with macrophages and dendritic cells and its influence on the host immune response. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 1-8 (2012).
  12. Giudice, A., et al. Macrophages participate in host protection and the disease pathology associated with Leishmania braziliensis infection. BMC Infectious Diseases. 12, (2012).
  13. Morato, C. I., et al. Essential role of leukotriene B4 on Leishmania (Viannia) braziliensis killing by human macrophages. Microbes and Infection. , (2014).
  14. Bonyek-Silva, I., et al. Unbalanced Production of LTB 4/PGE 2 Driven by Diabetes Increases Susceptibility to Cutaneous Leishmaniasis. Emerging Microbes & Infections. , (2020).
  15. Tomiotto-Pellissier, F., et al. Macrophage Polarization in Leishmaniasis: Broadening Horizons. Frontiers in Immunology. 9, 2529(2018).
  16. Anderson, C. F., Mosser, D. M. A novel phenotype for an activated macrophage: the type 2 activated macrophage. Journal of Leukocyte Biology. 72 (1), 101-106 (2002).
  17. Jin, X., Kruth, H. S. Culture of macrophage colony-stimulating factor differentiated human monocyte-derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. 2016 (112), 6-11 (2016).
  18. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  19. Hamilton, T. A., Zhao, C., Pavicic, P. G., Datta, S. Myeloid colony-stimulating factors as regulators of macrophage polarization. Frontiers in Immunology. 5, 1-6 (2014).
  20. Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
  21. Wozencraft, A. O., Blackwell, J. M. Increased infectivity of stationary-phase promastigotes of Leishmania donovani: Correlation with enhanced C3 binding capacity and CR3-mediated attachment to host macrophages. Immunology. 60 (4), 559-563 (1987).
  22. Sinha, R., et al. Genome plasticity in cultured Leishmania donovani: Comparison of early and late passages. Frontiers in Microbiology. 9, 1-20 (2018).
  23. Rebello, K. M., et al. Leishmania (Viannia) braziliensis: Influence of successive in vitro cultivation on the expression of promastigote proteinases. Experimental Parasitology. 126 (4), 570-576 (2010).
  24. Maspi, N., Abdoli, A., Ghaffarifar, F. P. ro- Pro- and anti-inflammatory cytokines in cutaneous leishmaniasis: a review. Pathogens and Global Health. 110 (6), 247-260 (2016).
  25. Nunes, S., et al. Integrated analysis reveals that miR-193b, miR-671, and TREM-1 correlate with a good response to treatment of human Localized cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania braziliensis. Frontiers in Immunology. 9, 1-13 (2018).
  26. De Moura, T. R., et al. Toward a Novel Experimental Model of Infection To Study American Cutaneous Leishmaniasis Caused by Leishmania braziliensis. Infection and Immunity. 73 (9), 5827-5834 (2005).
  27. Lima, F. R., Ferreira, L. D. M., Bonyek-silva, I., Santos, R. L., Tavares, N. M. Metformin promotes susceptibility to experimental Leishmania braziliensis infection. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 115, 1-8 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Дифференцировка макрофаговврожденный иммунный ответвыделение PBMCградиент Фиколлаинфицирование макрофаговпаразитарная нагрузкафлуоресцентная микроскопияответ клеток хозяина

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.