Анализ многофакторных экспериментов с РНК-Seq с помощью DiCoExpress

Summary

DiCoExpress - это инструмент на основе скриптов, реализованный в R для выполнения анализа RNA-Seq от контроля качества до совместной экспрессии. DiCoExpress обрабатывает полный и несбалансированный дизайн до 2 биологических факторов. Этот видеоурок проведет пользователя через различные функции DiCoExpress.

Abstract

Правильное использование статистического моделирования в анализе данных NGS требует продвинутого уровня знаний. В последнее время растет консенсус в отношении использования обобщенных линейных моделей для дифференциального анализа данных RNA-Seq и преимущества смешанных моделей для выполнения анализа коэкспрессии. Чтобы предложить управляемую настройку для использования этих подходов к моделированию, мы разработали DiCoExpress, который предоставляет стандартизированный конвейер R для выполнения анализа RNA-Seq. Без каких-либо специальных знаний в области статистики или R-программирования новички могут выполнять полный анализ RNA-Seq от контроля качества до совместного выражения посредством дифференциального анализа на основе контрастов внутри обобщенной линейной модели. Предложен анализ обогащения как по спискам дифференциально экспрессированных генов, так и по коэкспрессированным кластерам генов. Этот видеоурок задуман как пошаговый протокол, чтобы помочь пользователям в полной мере воспользоваться преимуществами DiCoExpress и его потенциала в расширении возможностей биологической интерпретации эксперимента RNA-Seq.

Introduction

Технология секвенирования РНК следующего поколения (RNA-Seq) в настоящее время является золотым стандартом анализа транскриптома¹. С первых дней существования технологии совместные усилия биоинформатиков и биостатистиков привели к разработке многочисленных методов, охватывающих все основные этапы транскриптомного анализа, от картирования до количественной оценки транскриптов². Большинство инструментов, доступных сегодня биологу, разработаны в программной среде R для статистических вычислений и графиков³, а многие пакеты для анализа биологических данных доступны в репозитории Bioconductor⁴. Эти пакеты предлагают полный контроль и настройку анализа, но они приходят за счет широкого использования интерфейса командной строки. Поскольку многие биологи более комфортно относятся к подходу «укажи и^{щелкни» 5}, демократизация анализа РНК-Seq требует разработки более удобных интерфейсов или протоколов⁶. Например, можно создавать веб-интерфейсы пакетов R с помощью Shiny⁷, а анализ данных командной строки становится более интуитивно понятным с интерфейсом R-studio⁸ . Разработка специализированных, пошаговых учебников также может помочь новому пользователю. В частности, видеоурок дополняет классический текстовый, что приводит к более глубокому пониманию всех этапов процедуры.

Недавно мы разработали DiCoExpress⁹, инструмент для анализа многофакторных экспериментов RNA-Seq в R с использованием методов, которые считаются лучшими, основанными на нейтральных сравнительных исследованиях 10,11,12. Начиная с таблицы подсчета, DiCoExpress предлагает этап контроля качества данных, за которым следует дифференциальный анализ экспрессии генов (пакет^{edgeR 13}) с использованием обобщенной линейной модели (GLM) и генерация кластеров коэкспрессии с использованием моделей смеси Гаусса (пакет coseq¹²). DiCoExpress обрабатывает полную и несбалансированную конструкцию до 2 биологических факторов (т.е. генотип и лечение) и одного технического фактора (т.е. репликация). Оригинальность DiCoExpress заключается в архитектуре каталогов, хранящей и организующей данные, скрипты и результаты, а также в автоматизации записи контрастов, позволяющей пользователю исследовать многочисленные вопросы в рамках одной статистической модели. Была также предпринята попытка представить графические результаты, иллюстрирующие статистические результаты.

Рабочая область DiCoExpress доступна по адресу https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress. Он содержит четыре каталога, два PDF и два текстовых файла. Каталог Data/ содержит входные наборы данных; для этого протокола мы будем использовать набор данных "tutorial". Каталог Sources/ содержит семь функций R, необходимых для выполнения анализа, и не должен быть изменен пользователем. Анализ выполняется с использованием скриптов, хранящихся в каталоге Template_scripts/. Тот, который используется в этом протоколе, называется DiCoExpress_Tutorial_JoVE.R и может быть легко адаптирован к любому транскриптомному проекту. Все результаты записываются в каталог Results/ и хранятся в подкаталоге, названном в соответствии с проектом. Файл README.md содержит полезную информацию об установке, а любые конкретные сведения о методе и его использовании можно найти в файле DiCoExpress_Reference_Manual.pdf.

Этот видеоурок проводит пользователя через различные функции DiCoExpress с целью преодоления нежелания, испытываемого биологами с помощью инструментов на основе командной строки. Здесь мы представляем анализ искусственного набора данных RNA-Seq, описывающего экспрессию генов в трех биологических репликатах четырех генотипов, с лечением или без него. Теперь мы рассмотрим различные этапы рабочего процесса DiCoExpress, показанные на рисунке 1. Скрипт, описанный в разделе Протокол, и входные файлы доступны на сайте: https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress

Подготовка файлов данных
Четыре CSV-файла, хранящиеся в каталоге Data/, должны быть названы в соответствии с именем проекта. В нашем примере все имена, следовательно, начинаются с «Tutorial», и мы установим Project_Name = «Tutorial» на шаге 4 протокола. Разделитель, используемый в CSV-файлах, должен быть указан в переменной Sep на шаге 4. В нашем наборе данных "tutorial" разделителем является табуляция. Для опытных пользователей полный набор данных можно свести к подмножеству, предоставив список инструкций и новую Project_Name через переменную Filter. Этот параметр позволяет избежать избыточных копий входных файлов и проверяет принципы FAIR¹⁴.

Среди четырех CSV-файлов обязательными являются только файлы COUNTS и TARGET. Они содержат необработанные подсчеты для каждого гена (здесь Tutorial_COUNTS.csv) и описание экспериментального дизайна (здесь Tutorial_TARGET.csv). Файл TARGET.csv описывает каждый образец (один образец на строку) с модальностью для каждого биологического или технического фактора (в столбцах). Мы настоятельно рекомендуем, чтобы имена, выбранные для модальностей, начинались с буквы, а не с цифры. Имя последнего столбца ("Репликатировать") изменить нельзя. Наконец, имена образцов (первый столбец) должны совпадать с именами в заголовках файла COUNTS.csv (Genotype1_control_rep1 в нашем примере). Файл Enrichment.csv, в котором каждая строка содержит один Gene_ID и один термин аннотации, требуется только в том случае, если пользователь планирует выполнить анализ обогащения. Если один ген имеет несколько аннотаций, их придется писать разными строками. Файл Annotation.csv является необязательным и используется для добавления краткого описания каждого гена в выходные файлы. Лучший способ получить файл аннотации - получить информацию из выделенных баз данных (например, Thalemine: https://bar.utoronto.ca/thalemine/begin.do для Arabidopsis).

Установка ДиКоЭкспресс
Для DiCoExpress требуются специальные пакеты R. Используйте источник командной строки(".. /Sources/Install_Packages.R") в консоли R для проверки состояния установки требуемого пакета. Для пользователей Linux другим решением является установка контейнера, предназначенного для DiCoExpress и доступного по адресу https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress/container_registry. По определению, этот контейнер содержит DiCoExpress со всеми необходимыми частями, такими как библиотеки и другие зависимости.

Protocol

1. ДиКоЭкспресс

1. Откройте сеанс R studio и задайте для каталога значение Template_scripts.
2. Откройте сценарий DiCoExpress_Tutorial.R в R studio.
3. Загрузите функции DiCoExpress в сеансЕ R с помощью следующих команд:
   > источник(".. /Источники/Load_Functions.R")
   > Load_Functions()
   > Data_Directory = ".. /Данные"
   > Results_Directory = ".. /Результаты/"
4. Загрузите файлы данных в сеансе R с помощью следующих команд:
   > Project_Name = "Учебник"
   > фильтр = NULL
   > Sep="\t"
   > Data_Files = Load_Data_Files(Data_Directory, Project_Name, Фильтр, Сент)
5. Разделите объект Data_Files на несколько объектов, чтобы легко ими манипулировать:
   > Project_Name = Data_Files$Project_Name
   > Цель = Data_Files$Цель
   > Raw_Counts = Data_Files$Raw_Counts
   > Аннотация = Data_Files$Аннотация
   > Reference_Enrichment = Data_Files$Reference_Enrichment
6. Выберите стратегию среди «NbConditions», «NbReplicates» или «filterByExpr» и порог для фильтрации низко экспрессированных генов. Здесь мы выбираем
   > Filter_Strategy = "NbReplicates"
   > CPM_Cutoff = 1
7. Указание цветов группы с помощью команды
   > Color_Group = NULL
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если задано значение NULL, R автоматически присваивает цвета биологическим условиям. В противном случае введите вектор, указывающий цвет для каждой биологической группы.
8. Выберите метод нормализации среди методов, принимаемых функцией calcNormFactors edgeR. Как, например,
   > Normalization_Method = "ТММ"
9. Выполните контроль качества, выполнив следующую функцию
   > Quality_Control(Data_Directory, Results_Directory, Project_Name, цель, Raw_Counts, Filter_Strategy, Color_Group, CPM_Cutoff, Normalization_Method)
10. Состояние Репликация = ИСТИНА, если данные сопряжены в соответствии с коэффициентом репликации, в противном случае — значение FALSE.
11. Присвойте значение «Взаимодействие» = TRUE для рассмотрения взаимодействия между двумя биологическими факторами, в противном случае — FALSE.
12. Укажите статистическую модель с помощью следующих команд
    модель > = GLM_Contrasts (Results_Directory, Project_Name, цель, репликация, взаимодействие)
    > GLM_Model = модель$GLM_Model
    > Контрасты = Модель$Контрасты
13. Определите пороговое значение коэффициента ложного обнаружения, здесь 0,05
    > Alpha_DiffAnalysis =0.05
14. Выполните дифференциальный анализ с помощью следующих команд
    > Index_Contrast=1:nrow(Контрасты)
    > NbGenes_Profiles = 20
    > NbGenes_Clustering = 50
    > DiffAnalysis.edgeR (Data_Directory, Results_Directory, Project_Name, Мишень, Raw_Counts, GLM_Model, Контрасты, Index_Contrast, Filter_Strategy, Alpha_DiffAnalysis, NbGenes_Profiles, NbGenes_Clustering, CPM_Cutoff, Normalization_Method)
15. Зафиксируйте порог для анализа обогащения, здесь 0.01
    > Alpha_Enrichment = 0.01
16. Проведение анализа обогащения списков дифференциально экспрессированных генов (DEG)
    > Заголовок = NULL
    > Обогащение(Results_Directory, Project_Name, Название, Reference_Enrichment, Alpha_Enrichment)
17. Выберите списки DEG для сравнения. Как, например,
    > группы = Контрасты$Контрасты[24:28]
18. Укажите имя для сравнения списка. Это имя используется для каталога, в котором будут сохранены выходные файлы
    > Название = "Interaction_with_Genotypes_1_and_2"
19. Укажите действие, которое необходимо выполнить в списках DEG, установив для параметра Operation значение объединение или пересечение. Мы выбираем
    > операция = "Союз"
20. Сравнение списков DEG
    > Venn_IntersectUnion (Data_Directory, Results_Directory, Project_Name, название, группы, операция)
21. Выполнение анализа со-выражений с помощью функции
    > Coexpression_coseq(Data_Directory, Results_Directory, Project_Name, название, цель, Raw_Counts, Color_Group)
22. Выполнение анализа обогащения кластеров коэкспрессии
    > Обогащение(Results_Directory, Project_Name, Название, Reference_Enrichment, Alpha_Enrichment)
23. Сгенерируйте два файла журнала, содержащих всю необходимую информацию для воспроизведения анализа
    > Save_Parameters( )
    ПРИМЕЧАНИЕ: Командные строки, используемые в этом протоколе, показаны на рисунке 2. Выделяются строки, которые необходимо изменить для анализа другого набора данных.

Results

Все выходные данные DiCoExpress сохраняются в каталоге Tutorial/, который сам помещается в каталог Results/. Здесь мы приводим некоторые рекомендации по оценке общего качества анализа.

Контроль качества
Выходные данные контроля качества, расположенные в каталоге Quality_Control/, необходимы для проверки надежности результатов анализа RNA-Seq. Файл Data_Quality_Control.pdf содержит несколько графиков, полученных с необработанными и нормализованными данными, которые можно исп...

Discussion

Поскольку RNA-Seq стал повсеместным методом в биологических исследованиях, существует постоянная необходимость в разработке универсальных и удобных для пользователя аналитических инструментов. Критическим шагом в большинстве аналитических рабочих процессов часто является достоверная идентификация генов, дифференциально экспрессируемых между биологическими состояниями и/или методами лечения¹⁵. Получение достоверных результатов требует надлежащего статистического моделирования, которое послужило мот...