Методическая статья

Анализ многофакторных экспериментов с РНК-Seq с помощью DiCoExpress

3.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62566

⸱

29 июля 2022 г.

 ,  ,  ,  , 
1Université Paris-Saclay, CNRS, INRAE, Univ Evry, Institute of Plant Sciences Paris-Saclay (IPS2), Orsay, France, 2Université de Paris, CNRS, INRAE, Institute of Plant Sciences Paris Saclay (IPS2), Orsay, France, 3Université Paris-Saclay, INRAE, CNRS, AgroParisTech, GQE - Le Moulon, Gif-sur-Yvette, France, 4LSTM, Univ Montpellier, INRAE, IRD, CIRAD, Institut Agro, Montpellier, France, 5Universitté Paris-Saclay, AgroParisTech, INRAE, UMR MIA-Paris, Paris, France

В этой статье

Краткое содержание

DiCoExpress - это инструмент на основе скриптов, реализованный в R для выполнения анализа RNA-Seq от контроля качества до совместной экспрессии. DiCoExpress обрабатывает полный и несбалансированный дизайн до 2 биологических факторов. Этот видеоурок проведет пользователя через различные функции DiCoExpress.

Аннотация

Правильное использование статистического моделирования в анализе данных NGS требует продвинутого уровня знаний. В последнее время растет консенсус в отношении использования обобщенных линейных моделей для дифференциального анализа данных RNA-Seq и преимущества смешанных моделей для выполнения анализа коэкспрессии. Чтобы предложить управляемую настройку для использования этих подходов к моделированию, мы разработали DiCoExpress, который предоставляет стандартизированный конвейер R для выполнения анализа RNA-Seq. Без каких-либо специальных знаний в области статистики или R-программирования новички могут выполнять полный анализ RNA-Seq от контроля качества до совместного выражения посредством дифференциального анализа на основе контрастов внутри обобщенной линейной модели. Предложен анализ обогащения как по спискам дифференциально экспрессированных генов, так и по коэкспрессированным кластерам генов. Этот видеоурок задуман как пошаговый протокол, чтобы помочь пользователям в полной мере воспользоваться преимуществами DiCoExpress и его потенциала в расширении возможностей биологической интерпретации эксперимента RNA-Seq.

Введение

Технология секвенирования РНК следующего поколения (RNA-Seq) в настоящее время является золотым стандартом анализа транскриптома1. С первых дней существования технологии совместные усилия биоинформатиков и биостатистиков привели к разработке многочисленных методов, охватывающих все основные этапы транскриптомного анализа, от картирования до количественной оценки транскриптов2. Большинство инструментов, доступных сегодня биологу, разработаны в программной среде R для статистических вычислений и графиков3, а многие пакеты для анализа биологических данных доступны в репозитории Bioconductor4. Эти пакеты предлагают полный контроль и настройку анализа, но они приходят за счет широкого использования интерфейса командной строки. Поскольку многие биологи более комфортно относятся к подходу «укажи ищелкни» 5, демократизация анализа РНК-Seq требует разработки более удобных интерфейсов или протоколов6. Например, можно создавать веб-интерфейсы пакетов R с помощью Shiny7, а анализ данных командной строки становится более интуитивно понятным с интерфейсом R-studio8 . Разработка специализированных, пошаговых учебников также может помочь новому пользователю. В частности, видеоурок дополняет классический текстовый, что приводит к более глубокому пониманию всех этапов процедуры.

Недавно мы разработали DiCoExpress9, инструмент для анализа многофакторных экспериментов RNA-Seq в R с использованием методов, которые считаются лучшими, основанными на нейтральных сравнительных исследованиях 10,11,12. Начиная с таблицы подсчета, DiCoExpress предлагает этап контроля качества данных, за которым следует дифференциальный анализ экспрессии генов (пакетedgeR 13) с использованием обобщенной линейной модели (GLM) и генерация кластеров коэкспрессии с использованием моделей смеси Гаусса (пакет coseq12). DiCoExpress обрабатывает полную и несбалансированную конструкцию до 2 биологических факторов (т.е. генотип и лечение) и одного технического фактора (т.е. репликация). Оригинальность DiCoExpress заключается в архитектуре каталогов, хранящей и организующей данные, скрипты и результаты, а также в автоматизации записи контрастов, позволяющей пользователю исследовать многочисленные вопросы в рамках одной статистической модели. Была также предпринята попытка представить графические результаты, иллюстрирующие статистические результаты.

Рабочая область DiCoExpress доступна по адресу https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress. Он содержит четыре каталога, два PDF и два текстовых файла. Каталог Data/ содержит входные наборы данных; для этого протокола мы будем использовать набор данных "tutorial". Каталог Sources/ содержит семь функций R, необходимых для выполнения анализа, и не должен быть изменен пользователем. Анализ выполняется с использованием скриптов, хранящихся в каталоге Template_scripts/. Тот, который используется в этом протоколе, называется DiCoExpress_Tutorial_JoVE.R и может быть легко адаптирован к любому транскриптомному проекту. Все результаты записываются в каталог Results/ и хранятся в подкаталоге, названном в соответствии с проектом. Файл README.md содержит полезную информацию об установке, а любые конкретные сведения о методе и его использовании можно найти в файле DiCoExpress_Reference_Manual.pdf.

Этот видеоурок проводит пользователя через различные функции DiCoExpress с целью преодоления нежелания, испытываемого биологами с помощью инструментов на основе командной строки. Здесь мы представляем анализ искусственного набора данных RNA-Seq, описывающего экспрессию генов в трех биологических репликатах четырех генотипов, с лечением или без него. Теперь мы рассмотрим различные этапы рабочего процесса DiCoExpress, показанные на рисунке 1. Скрипт, описанный в разделе Протокол, и входные файлы доступны на сайте: https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress

Подготовка файлов данных
Четыре CSV-файла, хранящиеся в каталоге Data/, должны быть названы в соответствии с именем проекта. В нашем примере все имена, следовательно, начинаются с «Tutorial», и мы установим Project_Name = «Tutorial» на шаге 4 протокола. Разделитель, используемый в CSV-файлах, должен быть указан в переменной Sep на шаге 4. В нашем наборе данных "tutorial" разделителем является табуляция. Для опытных пользователей полный набор данных можно свести к подмножеству, предоставив список инструкций и новую Project_Name через переменную Filter. Этот параметр позволяет избежать избыточных копий входных файлов и проверяет принципы FAIR14.

Среди четырех CSV-файлов обязательными являются только файлы COUNTS и TARGET. Они содержат необработанные подсчеты для каждого гена (здесь Tutorial_COUNTS.csv) и описание экспериментального дизайна (здесь Tutorial_TARGET.csv). Файл TARGET.csv описывает каждый образец (один образец на строку) с модальностью для каждого биологического или технического фактора (в столбцах). Мы настоятельно рекомендуем, чтобы имена, выбранные для модальностей, начинались с буквы, а не с цифры. Имя последнего столбца ("Репликатировать") изменить нельзя. Наконец, имена образцов (первый столбец) должны совпадать с именами в заголовках файла COUNTS.csv (Genotype1_control_rep1 в нашем примере). Файл Enrichment.csv, в котором каждая строка содержит один Gene_ID и один термин аннотации, требуется только в том случае, если пользователь планирует выполнить анализ обогащения. Если один ген имеет несколько аннотаций, их придется писать разными строками. Файл Annotation.csv является необязательным и используется для добавления краткого описания каждого гена в выходные файлы. Лучший способ получить файл аннотации - получить информацию из выделенных баз данных (например, Thalemine: https://bar.utoronto.ca/thalemine/begin.do для Arabidopsis).

Установка ДиКоЭкспресс
Для DiCoExpress требуются специальные пакеты R. Используйте источник командной строки(".. /Sources/Install_Packages.R") в консоли R для проверки состояния установки требуемого пакета. Для пользователей Linux другим решением является установка контейнера, предназначенного для DiCoExpress и доступного по адресу https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress/container_registry. По определению, этот контейнер содержит DiCoExpress со всеми необходимыми частями, такими как библиотеки и другие зависимости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. ДиКоЭкспресс

  1. Откройте сеанс R studio и задайте для каталога значение Template_scripts.
  2. Откройте сценарий DiCoExpress_Tutorial.R в R studio.
  3. Загрузите функции DiCoExpress в сеансЕ R с помощью следующих команд:
    > источник(".. /Источники/Load_Functions.R")
    > Load_Functions()
    > Data_Directory = ".. /Данные"
    > Results_Directory = ".. /Результаты/"
  4. Загрузите файлы данных в сеансе R с помощью следующих команд:
    > Project_Name = "Учебник"
    > фильтр = NULL
    > Sep="\t"
    > Data_Files = Load_Data_Files(Data_Directory, Project_Name, Фильтр, Сент)
  5. Разделите объект Data_Files на несколько объектов, чтобы легко ими манипулировать:
    > Project_Name = Data_Files$Project_Name
    > Цель = Data_Files$Цель
    > Raw_Counts = Data_Files$Raw_Counts
    > Аннотация = Data_Files$Аннотация
    > Reference_Enrichment = Data_Files$Reference_Enrichment
  6. Выберите стратегию среди «NbConditions», «NbReplicates» или «filterByExpr» и порог для фильтрации низко экспрессированных генов. Здесь мы выбираем
    > Filter_Strategy = "NbReplicates"
    > CPM_Cutoff = 1
  7. Указание цветов группы с помощью команды
    > Color_Group = NULL
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если задано значение NULL, R автоматически присваивает цвета биологическим условиям. В противном случае введите вектор, указывающий цвет для каждой биологической группы.
  8. Выберите метод нормализации среди методов, принимаемых функцией calcNormFactors edgeR. Как, например,
    > Normalization_Method = "ТММ"
  9. Выполните контроль качества, выполнив следующую функцию
    > Quality_Control(Data_Directory, Results_Directory, Project_Name, цель, Raw_Counts, Filter_Strategy, Color_Group, CPM_Cutoff, Normalization_Method)
  10. Состояние Репликация = ИСТИНА, если данные сопряжены в соответствии с коэффициентом репликации, в противном случае — значение FALSE.
  11. Присвойте значение «Взаимодействие» = TRUE для рассмотрения взаимодействия между двумя биологическими факторами, в противном случае — FALSE.
  12. Укажите статистическую модель с помощью следующих команд
    модель > = GLM_Contrasts (Results_Directory, Project_Name, цель, репликация, взаимодействие)
    > GLM_Model = модель$GLM_Model
    > Контрасты = Модель$Контрасты
  13. Определите пороговое значение коэффициента ложного обнаружения, здесь 0,05
    > Alpha_DiffAnalysis =0.05
  14. Выполните дифференциальный анализ с помощью следующих команд
    > Index_Contrast=1:nrow(Контрасты)
    > NbGenes_Profiles = 20
    > NbGenes_Clustering = 50
    > DiffAnalysis.edgeR (Data_Directory, Results_Directory, Project_Name, Мишень, Raw_Counts, GLM_Model, Контрасты, Index_Contrast, Filter_Strategy, Alpha_DiffAnalysis, NbGenes_Profiles, NbGenes_Clustering, CPM_Cutoff, Normalization_Method)
  15. Зафиксируйте порог для анализа обогащения, здесь 0.01
    > Alpha_Enrichment = 0.01
  16. Проведение анализа обогащения списков дифференциально экспрессированных генов (DEG)
    > Заголовок = NULL
    > Обогащение(Results_Directory, Project_Name, Название, Reference_Enrichment, Alpha_Enrichment)
  17. Выберите списки DEG для сравнения. Как, например,
    > группы = Контрасты$Контрасты[24:28]
  18. Укажите имя для сравнения списка. Это имя используется для каталога, в котором будут сохранены выходные файлы
    > Название = "Interaction_with_Genotypes_1_and_2"
  19. Укажите действие, которое необходимо выполнить в списках DEG, установив для параметра Operation значение объединение или пересечение. Мы выбираем
    > операция = "Союз"
  20. Сравнение списков DEG
    > Venn_IntersectUnion (Data_Directory, Results_Directory, Project_Name, название, группы, операция)
  21. Выполнение анализа со-выражений с помощью функции
    > Coexpression_coseq(Data_Directory, Results_Directory, Project_Name, название, цель, Raw_Counts, Color_Group)
  22. Выполнение анализа обогащения кластеров коэкспрессии
    > Обогащение(Results_Directory, Project_Name, Название, Reference_Enrichment, Alpha_Enrichment)
  23. Сгенерируйте два файла журнала, содержащих всю необходимую информацию для воспроизведения анализа
    > Save_Parameters( )
    ПРИМЕЧАНИЕ: Командные строки, используемые в этом протоколе, показаны на рисунке 2. Выделяются строки, которые необходимо изменить для анализа другого набора данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Все выходные данные DiCoExpress сохраняются в каталоге Tutorial/, который сам помещается в каталог Results/. Здесь мы приводим некоторые рекомендации по оценке общего качества анализа.

Контроль качества
Выходные данные контроля качества, расположенные в каталоге Quality_Control/, необходимы для проверки надежности результатов анализа RNA-Seq. Файл Data_Quality_Control.pdf содержит несколько графиков, полученных с необработанными и нормализованными данными, которые можно исп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Поскольку RNA-Seq стал повсеместным методом в биологических исследованиях, существует постоянная необходимость в разработке универсальных и удобных для пользователя аналитических инструментов. Критическим шагом в большинстве аналитических рабочих процессов часто является достоверная идентификация генов, дифференциально экспрессируемых между биологическими состояниями и/или методами лечения15. Получение достоверных результатов требует надлежащего статистического моделирования, которое послужило мот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать

Благодарности

Эта работа была в основном поддержана ANR PSYCHE (ANR-16-CE20-0009). Авторы благодарят Ф. Депре за постройку контейнера DiCoExpress. Работа КБ поддерживается программой «Инвестиции в будущее» ANR-10-BTBR-01-01 Amaizing. Лаборатории GQE и IPS2 пользуются поддержкой Saclay Plant Sciences-SPS (ANR-17-EUR-0007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Ссылки

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  2. Yang, I. S., Kim, S. Analysis of Whole Transcriptome Sequencing Data: Workflow and Software. Genomics & Informatics. 13 (4), 119-125 (2015).
  3. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. https://www.R-project.org/ (2020).
  4. Huber, W., et al. Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor. Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).
  5. Smith, D. R. The battle for user-friendly bioinformatics. Frontiers in Genetics. 4, 187(2013).
  6. Pavelin, K., Cham, J. A., de Matos, P., Brooksbank, C., Cameron, G., Steinbeck, C. Bioinformatics Meets User-Centred Design: A Perspective. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002554(2012).
  7. Shiny: web application framework. , Available from: https://rdrr.io/cran/shiny/ (2021).
  8. RStudio Team. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, PBC. , Boston, MA. at (n.d (2020).
  9. Lambert, I., Roux, C. P. -L., Colella, S., Martin-Magniette, M. -L. DiCoExpress: a tool to process multifactorial RNAseq experiments from quality controls to co-expression analysis through differential analysis based on contrasts inside GLM models. Plant methods. 16 (1), 68(2020).
  10. Dillies, M. -A., et al. A comprehensive evaluation of normalization methods for Illumina high-throughput RNA sequencing data analysis. Briefings in bioinformatics. 14 (6), 671-683 (2012).
  11. Rigaill, G. Synthetic data sets for the identification of key ingredients for RNA-seq differential analysis. Briefings in Bioinformatics. 19 (1), (2016).
  12. Rau, A., Maugis-Rabusseau, C. Transformation and model choice for RNA-seq co-expression analysis. Briefings in Bioinformatics. 19 (3), (2017).
  13. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).
  14. Wilkinson, M. D., et al. The FAIR Guiding Principles for scientific data management and stewardship. Scientific Data. 3 (1), 160018(2016).
  15. Stark, R., Grzelak, M., Hadfield, J. RNA sequencing: the teenage years. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 631-656 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

RNA SeqDiCoExpress

Похожие статьи