Методическая статья

Иммунофенотипирование и сортировка клеток человеческих МК из первичных источников человека или дифференцированных in vitro от кроветворных прародителей

DOI:

10.3791/62569

⸱

7 августа 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Platelet Research Lab, Instituto de Investigación Sanitaria del Principado de Asturias (ISPA), 2Flow Cytometry and Cell Sorting Platform (ISPA), 3Clinical Diagnosis Laboratory - Dept. of Hematology, Hospital Universitario Central de Asturias (HUCA), 4Department of Hematology, Hospital Universitario Severo Ochoa (HUSO), 5Department of Hematology, Instituto de Investigación Sanitaria San Carlos (IdISSC), Hospital Clínico San Carlos (HCSC), 6Dept. of Medicine, University of Oviedo

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем стратегию иммунофенотипирования для характеристики дифференцировки мегакариоцитов и показываем, как эта стратегия позволяет сортировать мегакариоциты на разных стадиях с помощью флуоресцентно-активированного сортировщика клеток. Методика может быть применена к первичным тканям человека, а также к мегакариоцитам, образуемым в культуре in vitro.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дифференцировка мегакариоцитов (МК) охватывает ряд эндомитотических циклов, которые приводят к высокополиплоидной (достигающей еще >64N) и чрезвычайно большой клетке (40-60 мкм). В отличие от быстро растущих знаний о мегакариопоэсисе на клеточном биологии и молекулярном уровне, характеристика мегакариопоэтиса с помощью проточной цитометрии ограничивается идентификацией зрелых МК с использованием специфических для линии поверхностных маркеров, в то время как более ранние стадии дифференцировки МК остаются неисследованными. Здесь мы представляем стратегию иммунофенотипирования, которая позволяет идентифицировать последовательные стадии дифференцировки МК с возрастающим статусом плоидности в первичных источниках человека или культурах in vitro с панелью, объединяющей специфические и неспецифические поверхностные маркеры МК. Несмотря на свои размеры и хрупкость, МК могут быть иммунофенотипированы с использованием вышеупомянутой панели и обогащены флуоресцентно-активированной сортировкой клеток при определенных условиях давления и диаметра сопла. Этот подход облегчает мультиомические исследования с целью лучшего понимания сложности мегакариопоэтиса и производства тромбоцитов у людей. Лучшая характеристика мегакариопоэтиса может представлять собой фундаментальную в диагностике или прогнозе связанных с линией патологий и злокачественных новообразований.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мегакариоциты (МК) развиваются из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) после сложного процесса, называемого мегакариопоэзом, который управляется в основном гормоном тромбопоэтином (ТПО). Классический взгляд на мегакариопоэтизис описывает клеточное путешествие от ГСК через последовательность иерархических стадий преданных предшественников и клеток-предшественников, что в конечном итоге приводит к зрелому МК. Во время созревания МК испытывают множественные раунды эндомитоза, развивают сложную внутриклеточную демаркационную мембранную систему (ДМС), которая обеспечивает достаточную поверхность мембраны для производства тромбоцитов, и эффективно производят и упаковывают....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Образцы цельной крови и костного мозга были получены и обработаны в соответствии с Хельсинкской декларацией 1964 года. Образцы цельной крови были получены от здоровых доноров после предоставления информированного согласия (ISPA) в рамках исследования, одобренного нашим институциональным медицинским этическим комитетом (Hospital Universitario Central de Asturias -HUCA-). Образцы костного мозга были получены из материала отбрасывания аспирата костного мозга пациентов, управляемых в отделе гематологии больницы Clínico San Carlos (HCSC).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Костный мозг и плоидия
Нарисунке 4показан репрезентативный иммунофенотипический анализ мегакариопоэтиса в БМ-образцах (аспирация) пациентов. При построении клеточной фракции против CD71 и CD31 мы определили шесть основных популяций: CD31- CD71- (красный), CD31- CD71+ (синий), CD31+ CD71- (оранжевый), CD31+ CD71mid (светло-зеленый), CD31+ CD71+ (те.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большинство исследований, сосредоточенных на изучении мегакариопоэзиса с помощью проточной цитометрии, на сегодняшний день ограничены идентификацией подмножеств МК с использованием только специфических для линии поверхностных маркеров(т.е.CD42A / CD42B, CD41 / CD61), в то время как более ранние этапы дифференциации МК были плохо изучены. В настоящей статье показана стратегия иммунофенотипирования для решения комплексной характеристики проточной цитометрии мегакариопоэтиса человека. В целом, мы хотели бы подчеркн.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Производство аудиовизуальных материалов поддерживалось BD Biosciences.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Маркоса Переса Бастерречеа, Лорену Родригес Лоренцо и Бегонью Гарсию Мендес (HUCA) и Палому Сересо, Альмудену Пайеро и Марию де ла Поведа-Коломо (HCSC) за техническую поддержку. Эта работа была частично поддержана медицинскими грантами (Roche SP200221001) для A.B., стипендии RYC (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, Испания) и грант I+D 2017 (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Испания и Fondos FEDER) Л.Г., грант Северо Очоа (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, Spain) до P.M.-B. и очный постдокторский грант 2018 года (Fundación para la Investi....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
130 микрон СоплоBD643943требуется для сортировки MK
5810R ЦентрифугаEppendorfCell изоляция и промывка
A-4-62 Swing Bucket RotorEppendorfCell изоляция и промывка
Aerospray Pro Гематологический Slid Stainer / ЦитоцентрифугаELITech GroupАвтоматизированное цитологическое устройство, где предметные стекла окрашиваются Mat-Gr& uuml; Инкубатор Giemsa
CO2 Инкубатор Galaxy 170 SEppendorfCell Incubation
Cytospin 4 CytocentrifugeThermo ScientificДля приготовления цитоспинов
сортировщик FACSAria IIuBDLasers 488 нм и 633 нм
FACSКанто II проточный цитометрBDLasers 488 нм, 633 нм и 405 нм
Olympus Микроскоп BX 41OlympusMicrophotos
Olympus Microscope BX 61OlympusMicrophotos
Zoe Fluorescent Cell ImagerBioRadMicrophotos
Для получения PBMCs
Липиды Холестерин Rich из сыворотки взрослого крупного рогатого скотаSigma-AldrichL4646или аналогичной
LymphoprepStem Cell Технологии#07801или аналогичный
Пенициллин-стрептомицинSigma-AldrichP4333или аналогичный
Рекомбинантный человеческий эритропоэтин (ЭПО)  НИР D Systems287-TC-500или аналогичный
рекомбинантный фактор стволовых клеток человека (SCF)Thermo Fisher Scientific, Gibco™PHC2115или аналогичный
рекомбинантный человеческий тромбопоэтин (ТПО)Thermo Fisher Scientific, Gibco™PHC9514или агонисты рецепторов ТПО
StemSpan SFEMStem Cell Technologies#09650
Анализ
Альбумин сыворотки крупного рогатого скотаMerckA7906-100Gили аналогичный
BD CompBead Anti-mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles SetBD552843Антитела к клеткам человека обычно получают от мыши.
BD Cytofix/CytopermBD554714или аналогичный
BD FACS Accudrop БусиныBD345249
CD31 AF-647BD561654Мышиный против человека
CD31 FITCImmunostep31F-100T
CD34 FITCBD555821Мышь против человека
CD41 PEBD555467Мышь против человека
CD41 PerCP-Cy5.5BD333148мышиный античеловеческий
CD42A APCImmunostep42AA-100TМы наблюдали неспецифическое связывание... которые необходимо оценить
CD42A PEBDМышь античеловеческая
CD42B PerCPBiolegend303910Мышь античеловеческая
CD49B PE BDМышь античеловеческая
CD61 FITCBD555753Мышь античеловеческая
CD71 APC-Cy7Biolegend334109Мышь античеловеческая
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
Human BD Fc BlockBD564219Fc блокирование - контроль
КИТ PE-Cy7Biolegend313212Мышиный
античеловеческий Lineage Cocktail 2 FITCBD643397Мышиная античеловеческая
РНКазаMerckR6513или аналогичная
Triton X-500Merck93443-500MLили аналогичные
Клеточные фильтры для сортировки
CellTrics Фильтры 100 мкмSysmex04-004-2328Клеточные фильтры
Примечание: мы не указываем общие реактивы/химикаты (PBS, ЭДТА и т.д.) или расходные материалы (пробирки и т.д.), или реагенты, указанные в ранее опубликованных и стандартных протоколах  - если не указано иное.
проточной цитометрии 558819 555669

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Italiano, J. E. Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production. Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).
  2. Machlus, K. R., Italiano, J. E. The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation. Journal ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Megakaryocyte DifferentiationImmunophenotyping StrategyCell SortingFlow CytometryHuman Primary SourcesIn Vitro DifferentiationHematopoietic ProgenitorsSurface MarkersFluorescence Activated Cell SortingPlatelet Production

Похожие статьи