Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Протокол желудочного шунтирования Roux-en-Y у крыс с использованием линейных степлеров

5.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62575

⸱

21 августа 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Alberta, 2Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta, 3Department of Medicine, University of Alberta

В этой статье

Краткое содержание

Желудочное шунтирование Roux-en-Y (RYGB) проводится для лечения ожирения и диабета. Однако механизмы, лежащие в основе эффективности RYGB, не полностью поняты, и исследования ограничены техническими трудностями, приводящими к высокой смертности на животных моделях. В этой статье приведены инструкции о том, как выполнять RYGB у крыс с высокими показателями успеха.

Аннотация

Желудочное шунтирование Roux-en-Y (RYGB) обычно выполняется для лечения тяжелого ожирения и диабета 2 типа. Однако механизм похудения и метаболических изменений не совсем понятен. Считается, что несколько факторов играют определенную роль, в том числе снижение потребления калорий, снижение поглощения питательных веществ, повышение сытости, высвобождение гормонов, способствующих сытости, сдвиги в метаболизме желчных кислот и изменения в микробиоте кишечника.

Крысиная модель RYGB представляет собой идеальную основу для изучения этих механизмов. Предыдущая работа на мышиных моделях имела высокие показатели смертности, варьирующиеся от 17 до 52%, что ограничивало их принятие. Модели крыс демонстрируют больше физиологического резерва для хирургического стимула и технически их легче принять, поскольку они позволяют использовать хирургические степлеры. Одна из проблем с хирургическими степлерами, однако, заключается в том, что они часто оставляют большой желудочный мешочек, который не является репрезентативным для RYGB у людей.

В этом протоколе мы представляем протокол RYGB у крыс, которые приводят к небольшому желудочному мешочку с использованием хирургических степлеров. Используя два степлерных пожара, которые удаляют лесомах крысы, мы получаем меньший желудочный мешочек, похожий на тот, который следует за типичным человеческим RYGB. Хирургическое сшивание также приводит к лучшему гемостазу, чем резкое деление. Кроме того, лесомах крысы не содержит желез и его удаление не должно изменять физиологию RYGB.

Потеря веса и метаболические изменения в когорте RYGB были значительными по сравнению с фиктивной когортой, со значительно более низкой толерантностью к глюкозе через 14 недель. Кроме того, этот протокол имеет отличную выживаемость 88,9% после RYGB. Навыки, описанные в этом протоколе, могут быть приобретены без предварительного микрохирургического опыта. После освоения эта процедура обеспечит воспроизводимый инструмент для изучения механизмов и эффектов RYGB.

Введение

Ожирение и сахарный диабет 2 типа стали всемирнойэпидемией1. Хотя медицинская потеря веса может улучшить диабет у пациентов, пациенты с тяжелым диабетом получают наибольшую пользу от бариатрической хирургии. Бариатрическая хирургия оказалась безопасной и эффективной при потере веса и улучшении или лечении диабета 2 типа2,3,даже у людей с давним заболеванием4. Метаболические бариатрические процедуры, такие как текущее желудочное шунтирование Roux-en-Y (RYGB) золотого стандарта, вызывают быстрое и устойчивое улучшение гомеостаза глюкозы, а также уменьшают потребность в диабетических лекарствах5,6,7.

После RYGB улучшение гомеостаза глюкозы происходит быстро и не зависит от потери веса8. Были предложены две основные теории для объяснения метаболических изменений, связанных с ремиссией диабета, которые происходят после метаболической хирургии. Во-первых, гипотеза задворок постулирует, что после шунтирования более высокие концентрации непереваренных питательных веществ достигают дистальной кишки, усиливая высвобождение гормонов, таких как GLP-1. С другой стороны, гипотеза оцевой кишке предполагает, что обход проксимального отдела кишечника снижает секрецию антиинкретиновых гормонов. Оба эти эффекта могут привести к раннему улучшению метаболизма глюкозы9.

Животные модели могут стать мощным инструментом для изучения этих механизмов. Однако основным препятствием при использовании моделей мышей или крыс является техническая сложность выполнения этих процедур. Большинство исследований опирались на мышиные или крысиные модели10,11,12. Мышиные модели были трудными, так как желудок мыши слишком мал для использования степлерных устройств11,а показатели смертности неприемлемо высоки, варьируясь от 17 до 52%13. У крыс некоторые протоколы остаются технически сложными для выполнения из-за сложного перевязки желудочных сосудов до деления желудка12,14. Другие модели делят желудок с помощью степлера, но оставляют большой мешочек, не соответствующий анатомии человека после RYGB11. В этой модели мы предоставляем подробные инструкции о том, как выполнять RYGB с использованием линейных степлеров в модели крысы, в результате чего желудочный мешочек больше соответствует анатомии человека. В целом, эта процедура была связана с отличными показателями выживаемости и метаболическими результатами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протоколы использования животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных в Университете Альберты (AUP00003000). Диаграмму, демонстрирующую анатомию RYGB, см. на рисунке 1.

1. Желудочное шунтирование Roux-en-Y

  1. Подготовка животных и оперативная установка
    1. За неделю до операции обеспечьте крыс пероральной регидратационной терапией и жидкой диетой в дополнение к их твердой диете и воде, чтобы акклиматизировать их к этой новой диете.
    2. Быстрые крысы с доступом только к воде за 12-18 ч до операции.
      1. Убедитесь, что крысы голодают на приподнятой проволочной платформе, чтобы они не могли потреблять материал подстилки.
    3. Вводят крысам подкожный бупренорфин длительного высвобождения (SR) в дозе 1 мг/кг непосредственно перед операцией.
    4. Автоклав все хирургические инструменты, полотенца и шторы.
    5. Очистите рабочую поверхность, грелку и анестезирующий носовой конус 70% этанолом.
    6. Настройте операционную поверхность с помощью операционного микроскопа, анестезирующего аппарата и расходных материалов таким образом, чтобы это было эргономично для операющего хирурга.
    7. Используйте нагревательную подушку с регулируемой температурой и установите ее на 37 °C.
    8. Положите стерильную драпировку или полотенце на грелку.
    9. Наполните стерильную коническую трубку 50 мл 0,9% физиологическим раствором.
  2. Индукция и подготовка анестетика
    1. Индуцировать анестезию с использованием 4% изофлурана в соответствии с ранее установленными протоколами15.
    2. Надавите на заднюю ногу всех четырех конечностей, чтобы убедиться, что нет болевой реакции.
    3. Проверяйте адекватную анестезию и частоту дыхания через каждые 5 минут.
    4. Нанесите смазку на оба глаза, чтобы предотвратить пересыхание.
    5. Сбрить волосы с живота.
    6. Очистить живот раствором повидона-йода. Дайте раствору высохнуть и превратите в стерильные перчатки.
    7. Задрапировать крысу отверстием в драпировке, чтобы обнажить брюшко.
    8. Поместите инструменты, швы, ватные тампоны и шприц 10 мл в место, которое обеспечивает легкий доступ во время процедуры.
  3. Срединная лапаротомия
    1. Сделайте разрез 3 см в верхней средней линии живота с помощью скальпеля, чуть ниже клифового отвара в качестве ориентира.
    2. Используя ножницы, разделите фасцию и брюшину, с осторожностью удерживают среднюю линию на linea alba, чтобы уменьшить кровотечение из прямой брюшной кишки. Если есть кровотечение, контролируйте его с помощью тепловой или электрокоагуляции.
  4. Мобилизация желудка
    1. Используя два влажных ватных тампона, тупо рассеките желудочные насадки.
    2. При столкновении с плотными спайками используйте термоприжигание, чтобы с осторожностью разделить желудочные насадки, чтобы избежать прижигания желудка. Резко разделите связку между желудком и дополнительной мочкой печени, чтобы снизить риск разрыва печени с мобилизацией желудка.
    3. Для более крупных кровеносных сосудов, особенно на коротких желудочных артериях, лигатировать с помощью 6-0 полипропиленового шва.
    4. Создайте окно на правой дистальной стороне пищевода, но проксимально к левой желудочной артерии. Убедитесь, что ватный тампон может попасть в эту область с задней тона. Желудок адекватно мобилизуется, когда он может быть экстериоризирован за пределами брюшной полости.
  5. Определите и разделите тогумию
    1. Определите связку Трейца, следуя за тощей кишки проксимально, пока не будет наблюдаться ее прикрепление к поперечному мезоколону.
    2. Измерьте 7 см дистально, определите расположение между брыжеечные сосуды и разделите кишечник микроножными ножницами. Избегайте пятен Пейера при разделении кишечника. Позаботьтесь о том, чтобы разделить только кишечник, а не жен.
    3. Поместите чистую, пропитанную физиологическим раствором губку перед разделением кишечника, чтобы свести к минимуму загрязнение.
    4. Проверьте наличие небольшого пересекающегося сосуда в жентерии на границе тонкой кишки и разделите его с помощью прижигания, чтобы избежать кровотечения.
    5. Продолжайте делить брыжимное по направлению на 1 см к основанию брыжи.
    6. Выявляют проксимальную и дистальную топозницу. Поместите проксимальную тозку под мокрую марлю справа от крысы и дистальную току слева от крысы.
  6. Сшивание желудка
    1. Вставьте степлер линейной резки 45 мм с высотой скобы 3,5 мм по белой линии лесомаха, чтобы создать меньший мешочек. Подождите 10 с, прежде чем запускать степлер.
    2. Поместите давление марлей на линии штапель в течение 1 мин, чтобы обеспечить гемостаз. Если гемостаз не достигается только давлением, кровотечение по линии штапель перекрывается с использованием 6-0 полипропиленовой фигуры из восьми швов.
    3. Выполните второй штапельный огонь через желудок в окно, созданное ранее. Подождите 10 с, прежде чем запускать степлер. Давление удерживается вдоль линии скрепления, чтобы обеспечить гемостаз, и может потребоваться перенаступление.
  7. Гастроеюностомия
    1. Делают гастротомию сразу после сшивания желудка. Задержки в этом могут вызвать растяжение желудка и аспирацию, поскольку желудок прерывистый после второго желудочного штапельного продукта.
    2. Используя скальпель из 11 лезвий, создайте гастротомию в дистальном мешочке. Экспресс желудочного содержимого через гастротомию. Это важно для предотвращения растяжения желудка и аспирации. Удлинить эту гастротомию с помощью микроножниц примерно до 5 мм. Гастротомия сделана достаточно большой, чтобы кончик ватного тампона просто пролег.
    3. Мобилизуйте дистальный конец токи, прилегающий к гастротомии, и поместите так, чтобы брыжейка не скручивалась.
    4. Во время наложения швов на анастомоз убедитесь, что кишечник остается влажным, покрыв его пропитанной физиологическим раствором марлей и регулярно повторно применяя физиологический раствор.
    5. Используя 6-0 полидиоксанонового или полипропиленового шва, поместите стойкий шов на нижний край анастомоза и аккуратно втягивайте с помощью защелки. Завяжите тремя узлами.
    6. Наложите стойкий шов на верхний край анастомоза и аккуратно втягивайте с помощью защелки. Завяжите шестью узлами.
    7. Швы передней стороны анастомоза непрерывно, принимая укусы шириной 1 мм и 1 мм друг от друга с осторожностью, чтобы избежать захвата задней стороны.
    8. Как только шов достигнет нижнего шова, свяжите их вместе с дополнительными шестью узлами.
    9. Как только передняя сторона будет завершена, переверните кишечник и желудок и пропустите нижний шов через дефект брыжетника. Повторно нарядить защелку и втянуть ее в меньшую сторону.
    10. Для задней стороны анастомоза поместите на всю толщину прерванные 6-0 швов шириной 1 мм и расположенные на 1 мм друг от друга, с осторожностью, чтобы избежать захвата задней стороны. Они завязаны по шесть узлов каждый.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Передняя сторона анастомоза зашивается непрерывно, в то время как задняя сторона делается прерванным образом. Это предотвращает потенциальную стриктуру или стеноз, связанный с непрерывным закрытием окружности.
    11. Проверьте утечку, осторожно протолкнув просветное содержимое через анастомоз. Если есть участки с протечкой, осторожно укрепите их прерванными швами. Позаботьтесь о том, чтобы избежать задней стенки при усилении дополнительными швами.
  8. Jejunojejunostomy
    1. От гастроеюностомии измерьте 20 см дистально.
    2. Создайте еюнотомию на антисентерической стороне с помощью скальпеля из 11 лезвий. Избегайте делать джеюнотомию над пятнами Пейера.
    3. Вытяните эту тоджеюнотомию с помощью микроножниц, чтобы она была такого же размера, как билиопанкреатическая конечность. Убедитесь, что ватный тампон просто помещается внутри.
    4. Поместите билиопанкреатическую конечность так, чтобы не было скручивания мезентерии.
    5. Выполняют анастомоз аналогично гастроеюностомии с 6-0 стойкими швами на верхней и нижней сторонах. Передняя сторона выполняется непрерывными швами, в то время как задняя сторона выполняется прерванными швами.
    6. Убедитесь, что кишечник остается влажным с физиологическим раствором во время этого анастомоза.
    7. Проверьте утечку, осторожно протолкнув просветное содержимое через анастомоз. Если есть участки с протечкой, укрепите их прерванными швами.
  9. Репозиция кишечника и желудка
    1. Убедитесь, что нет скручивания мешочка, остатков желудка или печени. Убедитесь, что левая доля печени находится перед желудком и не находится за мешочком, так как это может вызвать компресивную ишемию печени.
    2. Расположите кишечник в брюшной полости в его естественном положении так, чтобы не было скручивания.
  10. Закрытие брюшной полости
    1. Закройте фасцию 3-0 полиглактином непрерывно. Также может быть использован полидиоксанон 3-0.
    2. Непрерывно закрывайте кожу 2-0 шелком.
  11. Появление анестетика
    1. Уменьшите изофлуран до нуля, но продолжайте принимать дополнительный кислород.
    2. Ввести местный анестетик в виде брызговика в разрез.
    3. Вводят 10 мл подкожной 5% декстрозы в нормальном физиологическом растворе (D5NS) в подкожной клетчатке за шеей.
    4. Поместите елизаветинский крысиный ошейник до того, как крыса полностью проснется. Позаботьтесь о том, чтобы он плотно прилегал, но не слишком плотно, чтобы вызвать дискомфорт.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ошейник сохраняется до 5-го дня, чтобы предотвратить дегисценцию раны.

2. Фиктивная хирургия

ПРИМЕЧАНИЕ: Фиктивная хирургия выполняется аналогично RYGB, однако анастомозы не проводятся.

  1. Создается гастротомия, а затем закрывается 6-0 полидиоксаноновыми или полипропиленовыми швами.
  2. Джеюнотомия создается на 7 см дистальнее связки Трейца, а затем закрывается 6-0 полидиоксаноновыми или полипропиленовыми швами.

3. Послеоперационный уход

  1. Послеоперационный уход
    1. Размещайте крыс по отдельности и держите их на приподнятых проволочных платформах до тех пор, пока не будет вновь введена твердая пища, чтобы предотвратить потребление подстилки и обструкцию просвета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Послеоперационная диета возобновляется постепенно, так как отеки при гастроеюностомии могут вызвать обструкцию при раннем возобновлении твердой диеты.
    2. Ежедневно осматривайте ноги, пока крысы находятся на приподнятых проволочных платформах на предмет любых изменений кожи.
    3. Держите крыс на воде и пероральной регидратационной терапии в течение первых 72 ч.
    4. Вводят 10 мл D5NS каждые 12 ч в течение первых 72 ч.
    5. Вводят подкожный бупренорфин короткого действия по 0,01 мг/кг, если крысы болят. Шкала крысиной гримасы используется для оценки боли16.
    6. На 3-й послеоперационный день добавьте грызунам жидкую диету. Продолжают оказывать воду и пероральную регидратационную терапию.
    7. На 5-й послеоперационный день возобновить диету с высоким содержанием жиров. Продолжайте обеспечивать водой и жидкой диетой. Снимите елизаветинский воротник.
    8. На 7-й послеоперационный день прекратить жидкую диету.
    9. Снимают кожные швы на послеоперационный день 10-14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Животные и жилище
36 самцов крыс Wistar были размещены парами и получали 60% стерильной диеты грызунов с высоким содержанием жиров, начиная с шестинедельного возраста(рисунок 2). В возрасте 16 недель они перенесли RYGB или фиктивную операцию. После первой послеоперационной недели крысы были возобновлены на диете с высоким содержанием жиров. Половина крыс была усыплена через 2 недели после операции, а другая половина была усыплена через 14 недель после операции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

RYGB включает в себя создание небольшого желудочного мешочка (менее 30 мл), а также создание билиопанкреатической конечности и конечности Ру(рисунок 1). У людей билиопанкреатическая конечность обычно составляет от 30 до 50 см и транспортирует секрецию из желудочного остатка, печени и поджелудочной железы. Конечность Ру обычно составляет от 75 до 150 см в длину и является основным каналом для проглатываемой пищи. Общим каналом является оставшаяся точная кишки дисталь к тому, где соединяются д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Ethicon поставила два 45-мм степлера линейной резки, несколько 3,5-мм степлерных перезарядок и 6-0 полипропиленовых швов. Авторы не имеют других конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

Это исследование финансировалось Американским обществом метаболической и бариатрической хирургии Research Award. Ethicon любезно поставляла швы, степлеры и клипсы. Докторское исследование ведущего автора финансировалось Программой исследователей-клиницистов Университета Альберты и стипендией клинициана Альберты Innovates. Мы также хотели бы поблагодарить Мишель Тран за ее медицинскую иллюстрацию анатомии RYGB.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-0 Шелковые шовные материалыEthiconK533
3-0 Викрил Шовные материалыEthiconJ219H
4% изофлуранН/АН/Д
5% декстроза и 0,9% раствор хлорида натрия - 1000 млBaxter2B1064
50 мл конические центрифужные пробиркиFisher Scientific14-432-22
6-0 Проленовые шовные материалыEthicon8805H
Обезболивающий аппаратН/Д/Д
Бритва Для Шерсти ЖивотныхН/Д/Д
Раствор БетадинаН/Д
Иглодержатель Castrojievo с замком 14 см (гладкий изогнутый)World Precision Instruments503258
ECHELON FLEX Артикуляционный эндоскопический линейный резакEthiconEC45A
Экономичный пинцет #4World Precision Instruments501978
ENDOPATH ETS Шарнирный линейный резак 45 мм перезаряжаетEthicon6R45B
Дальний инфракрасный контроллер нагревательной прокладки с согревающей прокладкой (15,2 см Ш x 20,3 см Д), прокладкой температурного щупа и 10 одноразовыми, нестерильными протекторами рукаваKent ScientificRT-0515
Большая крыса елизаветинская ошейницаKent ScientificEC404VL-10
Жидкий диетический питательный зонд (150 мл)Bio-Serv9007
(коротко регулируемый)Bio-Serv9015
Микромоскитные щипцыWorld Precision Instruments500452
микроножницыWorld Precision Instruments503365
Мышиный рацион, с высоким содержанием жира и калорий (60%), мягкие гранулыBio-ServS3282
No. 11 Лезвие и рукоятка скальпеляН/ДН/Д
OPMI Хирургический микроскопVario ZEISSS88
Сетка для фальшполаTecniplastGM500150 Сетка
Жидкая диета для грызунов, Lieber-DeCarli '82, контроль, 4 литра/мешокBio-ServF1259
Хлорид натрия Ирригация 0,9% раствор - 500 млBaxterJF7633
Стерильные ватные тампоныН/ДН/Д
Стерильная простынян/д Н/д
/д
Термоприжигание УстановкаWorld Precision Instruments501293
Н НДержатель жидкого диетического питательного зонда для фальшпола Стерильное полотенце н/д н/д Н

Ссылки

  1. World Health Organization. Obesity and Overweight. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/obesity-and-overweight (2018).
  2. Courcoulas, A. P., et al. Three-year outcomes of bariatric surgery vs lifestyle intervention for type 2 diabetes mellitus treatment. JAMA Surgery. 15213 (10), 1-9 (2015).
  3. Ardestani, A., Rhoads, D., Tavakkoli, A. Insulin cessation and diabetes remission after bariatric surgery in adults with insulin-treated type 2 diabetes. Diabetes Care. 38 (4), 659-664 (2015).
  4. Casella, G., et al. Ten-year duration of type 2 diabetes as prognostic factor for remission after sleeve gastrectomy. Surgery for Obesity and Related Diseases. 7 (6), 697-702 (2011).
  5. Panunzi, S., De Gaetano, A., Carnicelli, A., Mingrone, G. Predictors of remission of diabetes mellitus in severely obese individuals undergoing bariatric surgery. Annals of Surgery. 261 (3), 459-467 (2015).
  6. Edelman, S., et al. Control of type 2 diabetes after 1 year of laparoscopic adjustable gastric banding in the helping evaluate reduction in obesity (HERO) study. Diabetes, Obesity and Metabolism. 16 (10), 1009-1015 (2014).
  7. Mingrone, G., et al. Metabolic surgery versus conventional medical therapy in patients with type 2 diabetes: 10-year follow-up of an open-label, single-centre, randomised controlled trial. The Lancet. 397 (10271), 293-304 (2021).
  8. Thaler, J. P., Cummings, D. E. Minireview: Hormonal and metabolic mechanisms of diabetes remission after gastrointestinal surgery. Endocrinology. 150 (6), 2518-2525 (2009).
  9. Mingrone, G., Castagneto-Gissey, L. Mechanisms of early improvement / resolution of type 2 diabetes after bariatric surgery. Diabetes and Metabolism. 35 (6), 518-523 (2009).
  10. Arapis, K., et al. Remodeling of the residual gastric mucosa after Roux-en-Y gastric bypass or vertical sleeve gastrectomy in diet-induced obese rats. PloS One. 10 (3), 012414(2015).
  11. Bruinsma, B. G., Uygun, K., Yarmush, M. L., Saeidi, N. Surgical models of Roux-en-Y gastric bypass surgery and sleeve gastrectomy in rats and mice. Nature Protocols. 10 (3), 495-507 (2015).
  12. Bueter, M., et al. Roux-en-Y gastric bypass operation in rats protocol. Journal of visualized experiments : JoVE. (64), (2012).
  13. Stevenson, M., Lee, J., Lau, R. G., Brathwaite, C. E. M., Ragolia, L. Surgical mouse models of vertical sleeve gastrectomy and Roux-en Y gastric bypass: a Review. Obesity Surgery. , (2019).
  14. Hao, Z., et al. Reprogramming of defended body weight after Roux-En-Y gastric bypass surgery in diet-induced obese mice. Obesity. 24 (3), 654-660 (2016).
  15. McErlane, S. Adult rodent anesthesia SOP. UBC Animal Care Guidelines. , Available from: https://animalcare.ubc.ca/sites/default/files/documents/ACC-01-2017_Anesthesia.pdf (2017).
  16. Sotocinal, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: a partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Molecular pain. , 1-10 (2011).
  17. Elder, K. A., Wolfe, B. M. Bariatric surgery: A review of procedures and outcomes. Gastroenterology. 132 (6), 2253-2271 (2007).
  18. Lim, R. B. Bariatric procedures for the management of severe obesity: Descriptions. UpToDate. , Available from: https://www.uptodate.com/ (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Протокол желудочного шунтирования Roux-en-Y у крыс с использованием линейных степлеров
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.