Обнаружение агрегации белка с помощью спектроскопии корреляции флуоресценции

Summary

Здесь мы вводим процедуру измерения олигомеров белка и агрегации в лисате клеток и живых клетках с использованием флуоресцентной корреляционные спектроскопии.

Abstract

Агрегация белка является отличительной чертой нейродегенеративных расстройств, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Генттона (HD), и так далее. Для обнаружения и анализа растворимых или диффузных белковых олигомеров или агрегатов была использована флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS), которая может обнаруживать скорость диффузии и яркость одной частицы с одной чувствительностью молекулы. Тем не менее, надлежащая процедура и ноу-хау для обнаружения агрегации белка не получили широкого широкого общего широкогоства. Здесь мы показываем стандартную процедуру измерения FCS для диффузионных свойств склонных к агрегации белков в лизате клетки и живых клетках: ALS-ассоциированный 25 kDa карбоксил-терминальный фрагмент TAR DNA/RNA-связывающего белка 43 kDa (TDP25) и супероксиддисмутазы 1 (SOD1). Репрезентативные результаты показывают, что часть агрегатов зеленого флуоресцентного белка (GFP) с тегами TDP25 была слегка включена в растворимую долю лизата клеток murine neuroblastoma Neuro2a. Кроме того, GFP-тегами SOD1 проведения ALS связанных мутации показывает более медленное распространение в живых клетках. Соответственно, мы здесь вводим процедуру обнаружения агрегации белка с помощью его диффузионные свойства с помощью FCS.

Introduction

Белковые агрегации с участием нейродегенеративных расстройств, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, и^{так далее 1, как} известно, токсичны и будет нарушать белок гомеостаз (протеостаз) в клетках и органах, которые затем могут привести к^{старению 2}. Очистка агрегации белка ожидается в качестве терапевтической стратегии; однако химические вещества, предотвращая образование агрегации белка и ухудшая белковые агрегаты (например, небольшие молекулы или наркотики), еще не установлены. Более того, как агрегация белка оказывает токсичность остается неуловимым. Поэтому для продвижения исследовательских проектов, связанных с агрегацией белка, важно ввести процедуры высокой пропускной способности, чтобы просто обнаружить агрегацию белка. Обнаружение агрегации белка с использованием антител, распознающих конформацию агрегации белка и агрегации специфических флуоресцентных красителей широко используется³. Однако, трудно обнаружить агрегацию, особенно в живых клетках с помощью таких классических процедур.

Фюрстер резонансной передачи энергии (FRET) является процедура для обнаружения агрегации белка и структурных изменений. Тем не менее, FRET не в состоянии анализировать белковую динамику (например, диффузию и олигомеризацию белка в живых клетках)^3. Поэтому мы вводим здесь простой протокол для обнаружения агрегации белка в растворе (например, лисате клеток) и живых клетках с использованием флуоресцентной корреляционные спектроскопии (FCS), которая измеряет диффузионные свойства и яркость флуоресцентных молекул с одной^{чувствительностью молекулы 4}. FCS — это метод фотон-подсчета с помощью лазерного сканирования конфокального микроскопа (LSM). Используя высокочувствительный фотон-детектор и расчет функции автокорреляции (ACF) времени прибытия фотона, измеряется проход во времени и яркость флуоресцентных молекул в объеме обнаружения. Диффузия замедляется с увеличением молекулярного веса; таким образом, интермолекулярное взаимодействие можно оценить с помощью FCS. Еще мощнее, увеличение яркости флуоресцентной молекулы указывает на гомо-олигомеризацию молекул. Таким образом, FCS является мощным инструментом для обнаружения такой агрегации белка.

Protocol

1. Материалы и реагенты

1. Используйте пирогенные свободные растворы и средние для клеточной культуры(таблица 1).
2. Подготовка решений для биохимического эксперимента с использованием ультрачистой воды и использовать в качестве DNase / RNase бесплатно.
3. Выберите подходящий FBS для клеточной культуры с большим количеством процесса проверки. Поскольку выбранный лот FBS регулярно меняется, каталог и номер лота для FBS не могут быть представлены здесь.
4. Плазмидная ДНК
   1. Подготовка pmeGFP-N1^{5 для} выражения мономера eGFP; pmeGFP-C1-TDP25⁶ для выражения GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R⁷ для выражения SOD1-G85R-GFP; и pCAGGS⁸ в качестве перевозчика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: MEGFP является мономерным вариантом, несущим мутацию A206K расширенного GFP (eGFP). TDP25 — связанный с ALS фрагмент C-терминала TDP-43. SOD1-G85R — связанный с ALS мутант SOD1.
5. Напряжение клеток
   1. Используйте клетки муриной нейробластомы Neuro2a.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки Neuro2a имеют высокую эффективность трансфекции и высоко экспресс-экзогенные белки. Для выражения TDP25 необходимы клеточные штаммы с высокой эффективностью выражения, такие как клетки Neuro2a или HEK293. В ячейках HeLa TDP25 не могли быть эффективно выражены.

2. Культура клеток и трансфекция

1. Приготовьте 100-мм пластиковую тарелку, растущую клетками Neuro2a в условиях нормального роста.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение примерно 48-72 часов после предыдущего посева, пока полу-слияние не будет достигнуто.
2. Удалите носитель.
3. Добавьте 0,5 мл раствора трипсина-ЭДТА в блюдо клеточной культуры и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в течение 1 мин.
4. Добавьте в блюдо 9,5 мл нормальной среды роста и приостановит отдельные клетки.
5. Используя trypan синий, чтобы испачкать мертвые клетки, подсчитайте количество ячеек с помощью счетчика ячейки или вручную. Затем разбавить клетки в среде культуры (1,0 × 10⁵/мл).
6. Добавьте 2 мл клеточной суспензии в пластиковую тарелку диаметром 35 мм для клеточного лиза или стеклянное базовое блюдо для измерения живых клеток.
7. Инкубировать блюдо при 37 градусов по Цельсию в течение 1 дня.
8. Начните следующие приготовления за 15 минут до дня трансфекции.
9. Подготовь две трубки по 1,5 мл и добавьте по 100 мкл Opti-MEM I к каждой трубке.
10. В первой трубке смешайте 1,0 мкг плазмидной ДНК (решение А). Во второй трубке смешайте 2,5 МКЛ липофектамина 2000 (раствор В).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания эффективности трансфекции, сохранить общее количество ДНК то же самое. Чтобы снизить уровень экспрессии для измерения FCS в живых клетках, доля количества плазмидной ДНК для экспрессии белка должна уменьшиться (например, 0,2 мкг смеси pmeGFP-N1-SOD1-G85R и 0,8 мкг смеси pCAGGS). Кроме того, сохранить то же соотношение между объемом липофектамина 2000 года и количество плазмидной ДНК.
11. Аккуратно смешайте раствор A и B, добавив один в обе трубки, а затем инкубировать его в течение 1 мин при комнатной температуре (Solution C).
12. Добавьте решение C в культурную среду; и инкубировать клетки в течение 24 ч при 37 градусов по Цельсию.

3. Сотовыйлиз и средний обмен

1. Проверьте выражение GFP с помощью обычного микроскопа.
2. Удалите среду в блюдо.
3. Добавьте 2 мл PBS при 25 градусов по Цельсию, чтобы вымыть среду. Удалите PBS.
4. Поместите блюдо на алюминиевую тарелку поверх дробленого льда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем алюминиевую пластину толщиной 1 мм, вырезанную в воскресном магазине инструментов или коммерчески доступную в качестве лабораторного оборудования.
5. Добавьте 200 МКЛ буфера лиза при 4 градусах Цельсия. Встряхните блюдо мягко так, что буфер равномерно распределены в нижней части блюда.
6. Очисти блюдо с помощью клеточного скребка и восстановить лизолировать с неразрешеной ячейки мусора в новой трубке 1,5 мл.
7. Центрифуга раствор при 20 400 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
8. Восстановите супернатант в новой трубке 1,5 мл и держите его при 4 градусах Цельсия или на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не замораживайте лизат.
9. Для измерения живых клеток замените носитель перед измерением. Проверьте вложение клеток с помощью фазово-контрастного микроскопа. Подтвердите экспрессию с помощью флуоресцентной микроскопа.

4. Калибровка корреляции флуоресценции (FCS)

1. Запустите систему и запустите программное обеспечение для работы. Включите аргон и^лазер (458/477/488/514 нм). Стабилизировать систему по крайней мере в течение 30 минут.
2. Настройка оптического пути: главный сплиттер пучка: HFT488; Дихроическое зеркало: NFT600; Фильтр барьера флуоресценции: фильтр пластыря 505-540 (BP505-540); Детектор: лавинный фотодиод (APD)).
3. Установите размер пинхол, введя значение напрямую (66 мкм; 1 воздушный блок).
4. Добавьте раствор родамин 6G (Rh6G) в колодец стеклянной камеры крышки на сцене.
5. Добавьте сверхчистую воду для погружения в цель. Не используйте масло для погружения.
6. Установите камеру на сцене микроскопа. Перемести сцену в соответствующее положение.
7. Сосредоточьтесь на верхней поверхности стекла, измеряя рассеянный свет от поверхности стекла. После снижения объектива цели на дно, поверните ручку фокусировки по часовой стрелке, чтобы настроить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте направление поворота ручки фокусировки, потому что она противоположна тем, которые сделаны в Японии и Германии.
8. Поднимите координационный центр на 200 мкм над верхней стеклянной поверхностью, чтобы наблюдать внутри раствора.
9. Нажмите на скорость подсчета и отслеживайте скорость подсчета фотона.
10. Постепенно увеличивайте значение акустооптических настраиваемых фильтров (AOTF) (например, возбуждающей лазерной передачи), так что значение скорости подсчета составляет более 10 кГц.
11. Нажмите на корректировку Pinhole и откройте мастер регулировки пинхол. Найдите положение пинхол с самым высоким (пиковым) числом фотонов как в х-, так и в оси.
12. Поверните кольцо коррекции объектива цели так, чтобы количество на молекулу (CPM) значение является самым высоким.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку толщина крышки стекла камеры, указанной здесь, составляет 0,12-0,17 мм, коррекционный кольцо находится на минимальном уровне или всего в нескольких поворотах от него, где CPM находится на максимуме.
13. Постепенно уменьшаем значение AOTF, так что значение CPM становится 2-3 кГц.
14. Приобрети функцию автокорреляции (ACF) Rh6G на 90 с.
15. Как только измерение завершено, нажмите Fit для выполнения анализа установки кривой.
16. Выберите модель для однокомпонентного трехмерного (3D) диффузии с тройным состоянием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Rh6G является монодисперсным и однокомпонентным диффузным с тройным состоянием.
17. Установите подходящее время начала, перемещая красную линию. Нажмите Fit All и проверьте пригонку отклонения. После выполнения установки кривой убедитесь, что время диффузии (DT) и параметр структуры (SP) находятся примерно в диапазоне 20-30 и 4-8, соответственно.
18. Помните значение структурных параметров. Используйте значение SP для анализа кривой установки всех ACFs измеряется в тот же день, в тех же оптических условиях, и с использованием того же типа стеклянной основы блюдо или камерной крышкой стекла, установленного на стадии микроскопа.

5. Измерение FCS в ликате клетки

1. Подготовь ячейку лисаты (см. выше).
2. Поместите лисат на крышку стеклянной камеры. Поместите крышку, чтобы избежать высыхания и крышку сцены для светлого затенения.
3. Установите условие приобретения, мощность лазера, время измерения и повторения.
4. Нажмите Скорость подсчета и отрегулируйте значение AOTF лазера так, чтобы значение CPM стало больше 1 кГц.
5. Выполните пробный замер в течение 1 мин. Проверьте, показывает ли рассчитанный ACF положительную амплитуду и плавный распад.
6. Выполните основное измерение в течение 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время измерения постепенно увеличивается до тех пор, пока форма ACF не изменится, даже если время измерения увеличено.
7. Нажмите Fit для выполнения анализа установки кривой.
8. Выберите модель для двухкомпонентной 3D диффузии с тройным состоянием. Не забудьте ввести значение SP и изменить его настройки на "Fixed" не "Бесплатно", прежде чем нажать Fit все.
9. Экспорт оборудованной таблицы в качестве файла текста с делимитацией вкладок.
10. При необходимости экспорт записи скорости ACF и Count в качестве текстового файла, делимитированного вкладкой.

6. Измерение FCS в живых клетках

1. Замените носитель на свежий перед измерением.
2. Используйте инкубатор тепловой ступени. Установите клеточно-культурное блюдо на сцене микроскопа.
3. Подтвердите фокус и положение с помощью конфокального микропа. Выберите измерительную ячейку. Увеличьте и отрегулируйте положение ячейки. Приобретайте флуоресцентные изображения ячейки, выражаюющей GFP, используя режим медленного сканирования.
4. Выберите измерительное положение FCS с помощью позиции в разделе "FCS".
5. Выберите по крайней мере одну точку измерения FCS с помощью перекрестия(рисунок 1).
6. Измерьте ACF в течение 1 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Потому что флуоресцентные белки, как правило, photobleached в живых клетках из-за медленного движения по сравнению с раствором, время измерения должно быть минимальным. Как правило, трудно получить ACF в клетке так гладко, как раствор измерений, поскольку длительное измерение приведет к фотоотбеливания флуоресцентных белков.
7. Нажмите Fit для выполнения анализа установки кривой с помощью модели для двухкомпонентного 3D диффузии с тройным состоянием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения живых клеток, модель для двухкомпонентной 3D диффузии с тройным состоянием было бы лучше, потому что эмпирически трудно уменьшить чи-квадратное значение с однокомпонентной 3D диффузионные модели из-за существования различных мобильных компонентов в живой клетке. Но даже с помощью модели для трехкомпонентной 3D диффузии, компоненты диффузии, как правило, не разделены по сравнению с использованием модели для двухкомпонентов.

Results

Мы провели измерение FCS GFP-TDP25 в лизаторе клеток и SOD1-G85R-GFP в живых клетках. В обоих случаях удалось приобрести положительную амплитуду и гладкие ACF. Мы показали, что часть GFP-TDP25, выраженная в клетках Neuro2a, была восстановлена в растворимой фракции при указанном состоянии^6. В растворимой фракции лизата клетки, чрезвычайно яркие молекулы флуоресценции были обнаружены в записи скорости подсчета фотона с помощью FCS(рисунок 2A, сверху, стрелка). Такие "ши...

Discussion

Что касается калибровки системы до измерений, то следует использовать те же стеклянные изделия, что и для измерения образца (например, 8-колодцы покрывают стеклянную камеру для ликата клеток и 35-мм стеклянное базовое блюдо для живых клеток). Из-за adorption Rh6G на стекле, его эффективная концентрация иногда может уменьшиться. Если это так, то высококонцентрированный раствор Rh6G, такой как 1 МКМ, следует использовать только для регулировки скважины. Для защиты детектора необходимо избегать чрезвычайно высоких скоростей...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% (по мас./об.) Трипсин-1 ммоль/л ЭДТА&миддот; Раствор 4Na с феноловым красным (трипсин-ЭДТА)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
100-мм пластиковая тарелка	CORNING	430167
35-мм стеклянная тарелка	IWAKI	3910-035	Для измерения живых клеток
35-мм пластиковая тарелка	Thermo Fisher Scientific	150460
Алюминиевая тарелка	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Скребок для объективных	Zeiss
	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-93100
Фильтрующая мембрана из ацетата целлюлозы (0,22 мм)	Advantech Toyo	25CS020AS
Крышка стеклянной камеры 8 лунок	IWAKI	5232-008	Для измерения
раствора модифицированная орлиная среда Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	базальная среда
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	биосыворотка		Требуется проверка партии
Липофектамин 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		система FCS
Мышиная нейробластома Neuro2a клетки		ATCC CCL-131	Клеточная линия
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	Плазмидная ДНК для трансфекционного носителя
Раствор пенициллин-стрептомицина (× 100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			Плазмидная ДНК для TDP25 меченая мономерной eGFP
pmeGFP-N1			Плазмидная ДНК для экспрессии мономера eGFP
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			Плазмидная ДНК для ALS-связанного мутанта G85R SOD1, меченного мономерным
коктейлем ингибиторов протеазы	Sigma-Aldrich	P8304