Обнаружение агрегации белка с помощью спектроскопии корреляции флуоресценции

Summary

Здесь мы вводим процедуру измерения олигомеров белка и агрегации в лисате клеток и живых клетках с использованием флуоресцентной корреляционные спектроскопии.

Abstract

Агрегация белка является отличительной чертой нейродегенеративных расстройств, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Генттона (HD), и так далее. Для обнаружения и анализа растворимых или диффузных белковых олигомеров или агрегатов была использована флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS), которая может обнаруживать скорость диффузии и яркость одной частицы с одной чувствительностью молекулы. Тем не менее, надлежащая процедура и ноу-хау для обнаружения агрегации белка не получили широкого широкого общего широкогоства. Здесь мы показываем стандартную процедуру измерения FCS для диффузионных свойств склонных к агрегации белков в лизате клетки и живых клетках: ALS-ассоциированный 25 kDa карбоксил-терминальный фрагмент TAR DNA/RNA-связывающего белка 43 kDa (TDP25) и супероксиддисмутазы 1 (SOD1). Репрезентативные результаты показывают, что часть агрегатов зеленого флуоресцентного белка (GFP) с тегами TDP25 была слегка включена в растворимую долю лизата клеток murine neuroblastoma Neuro2a. Кроме того, GFP-тегами SOD1 проведения ALS связанных мутации показывает более медленное распространение в живых клетках. Соответственно, мы здесь вводим процедуру обнаружения агрегации белка с помощью его диффузионные свойства с помощью FCS.

Introduction

Белковые агрегации с участием нейродегенеративных расстройств, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, и^{так далее 1, как} известно, токсичны и будет нарушать белок гомеостаз (протеостаз) в клетках и органах, которые затем могут привести к^{старению 2}. Очистка агрегации белка ожидается в качестве терапевтической стратегии; однако химические вещества, предотвращая образование агрегации белка и ухудшая белковые агрегаты (например, небольшие молекулы или наркотики), еще не установлены. Более того, как агрегация белка оказывает токсичность остается неуловимым....

Protocol

1. Материалы и реагенты

1. Используйте пирогенные свободные растворы и средние для клеточной культуры(таблица 1).
2. Подготовка решений для биохимического эксперимента с использованием ультрачистой воды и использовать в качестве DNase / RNase бесплатно.
3. Выберите подходящий FBS для клеточной культуры с большим количеством процесса проверки. Поскольку выбранный лот FBS регулярно меняется, каталог и номер лота для FBS не могут быть представлены здесь.
4. Плазмидная ДНК
   1. Подготовка pmeGFP-N1^{5 для} выражения мономера eGFP; pmeGFP-C1-TDP25⁶ для выражения GFP-TDP25; pmeGFP-N....

Results

Мы провели измерение FCS GFP-TDP25 в лизаторе клеток и SOD1-G85R-GFP в живых клетках. В обоих случаях удалось приобрести положительную амплитуду и гладкие ACF. Мы показали, что часть GFP-TDP25, выраженная в клетках Neuro2a, была восстановлена в растворимой фракции при указанном состоянии^6. В растворимой фракции лизата клетки, чрезвычайно яркие молекулы флуоресценции были обнаружены в записи скорости подсчета фотона с помощью FCS(рисунок 2A, сверху, стрелка). Такие "ши.......

Discussion

Что касается калибровки системы до измерений, то следует использовать те же стеклянные изделия, что и для измерения образца (например, 8-колодцы покрывают стеклянную камеру для ликата клеток и 35-мм стеклянное базовое блюдо для живых клеток). Из-за adorption Rh6G на стекле, его эффективная концентрация иногда может уменьшиться. Если это так, то высококонцентрированный раствор Rh6G, такой как 1 МКМ, следует использовать только для регулировки скважины. Для защиты детектора необходимо избегать чрезвычайно высоких скоростей.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% (по мас./об.) Трипсин-1 ммоль/л ЭДТА&миддот; Раствор 4Na с феноловым красным (трипсин-ЭДТА)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
100-мм пластиковая тарелка	CORNING	430167
35-мм стеклянная тарелка	IWAKI	3910-035	Для измерения живых клеток
35-мм пластиковая тарелка	Thermo Fisher Scientific	150460
Алюминиевая тарелка	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Скребок для объективных	Zeiss
	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-93100
Фильтрующая мембрана из ацетата целлюлозы (0,22 мм)	Advantech Toyo	25CS020AS
Крышка стеклянной камеры 8 лунок	IWAKI	5232-008	Для измерения
раствора модифицированная орлиная среда Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	базальная среда
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	биосыворотка		Требуется проверка партии
Липофектамин 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		система FCS
Мышиная нейробластома Neuro2a клетки		ATCC CCL-131	Клеточная линия
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	Плазмидная ДНК для трансфекционного носителя
Раствор пенициллин-стрептомицина (× 100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			Плазмидная ДНК для TDP25 меченая мономерной eGFP
pmeGFP-N1			Плазмидная ДНК для экспрессии мономера eGFP
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			Плазмидная ДНК для ALS-связанного мутанта G85R SOD1, меченного мономерным
коктейлем ингибиторов протеазы	Sigma-Aldrich	P8304