Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оптический пинцет для изучения РНК-белковых взаимодействий в регуляции трансляции

5.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62589

⸱

12 февраля 2022 г.

 ,  , 
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty, Julius-Maximilians University Würzburg

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол представляет собой полный экспериментальный рабочий процесс для изучения РНК-белковых взаимодействий с использованием оптического пинцета. Описано несколько возможных экспериментальных установок, включая комбинацию оптического пинцета с конфокальной микроскопией.

Аннотация

РНК принимает различные структурные складки, которые необходимы для ее функций и, таким образом, могут влиять на различные процессы в клетке. Кроме того, структура и функция РНК могут модулироваться различными транс-действующими факторами, такими как белки, метаболиты или другие РНК. Например, молекулы РНК со сдвигом кадров представляют собой регуляторные РНК, расположенные в кодирующих областях, которые направляют трансляцию рибосом в альтернативную открытую рамку считывания и, таким образом, действуют как переключатели генов. Они также могут принимать различные складки после связывания с белками или другими транс-факторами. Чтобы проанализировать роль РНК-связывающих белков в трансляции и то, как они модулируют структуру и стабильность РНК, крайне важно одновременно изучить взаимодействие и механические особенности этих РНК-белковых комплексов. Эта работа иллюстрирует, как использовать одномолекулярные флуоресцентно-связанные оптические пинцеты для изучения конформационного и термодинамического ландшафта РНК-белковых комплексов с высоким разрешением. В качестве примера разработано взаимодействие запрограммированного рибосомного элемента сдвига рамки SARS-CoV-2 с короткой изоформой трансактивного фактора противовирусного белка цинк-пальцев. Кроме того, флуоресцентно-меченые рибосомы контролировали с использованием конфокальной единицы, что в конечном итоге позволило бы изучать удлинение трансляции. Флуоресцентный связанный анализ OT может быть широко применен для изучения различных РНК-белковых комплексов или транс-действующих факторов, регулирующих трансляцию, и может облегчить исследования регуляции генов на основе РНК.

Введение

Передача генетической информации от ДНК к белкам через мРНК – сложный биохимический процесс, который точно регулируется на всех уровнях посредством макромолекулярных взаимодействий внутри клеток. Для трансляционной регуляции РНК-белковые взаимодействия играют решающую роль в быстрой реакции на различные раздражители и сигналы1,2. Некоторые РНК-белковые взаимодействия влияют на стабильность мРНК и тем самым изменяют время, в течение которого РНК является трансляционно активной. Другие РНК-белковые взаимодействия связаны с механизмами перекодирования, такими как стоп-кодон, обход или запрограммированное рибосомное сдвиги кадра (PRF)3,4,5,6,7. Недавно было продемонстрировано, что ряд РНК-связывающих белков (RBP) взаимодействуют со стимулирующими элементами мРНК и механизмом трансляции, чтобы диктовать, когда и сколько перекодирования произойдет в клетке7,8,9,10,11. Таким образом, чтобы проанализировать роль РНК-связывающих белков в трансляции и то, как они модулируют структуру и стабильность РНК, важно детально изучить принципы взаимодействия и механические свойства этих РНК-белковых комплексов.

Десятилетия работы заложили основу для изучения многоступенчатого и многокомпонентного процесса трансляции, который опирается на сложную связь между РНК и белковыми компонентами механизма трансляции для достижения скорости и точности12,13,14. Следующим важным шагом в понимании сложных регуляторных событий является определение сил, временных шкал и структурных детерминант во время трансляции с высокой точностью12,15,16,17. Изучение конформационной динамики РНК и особенно того, как трансдействующие вспомогательные факторы действуют на структуру РНК во время трансляции, было дополнительно освещено появлением одномолекулярных инструментов, включая оптические пинцеты или волноводы нулевого режима16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.

Оптический пинцет (OT) представляет собой высокоточный одномолекулярный метод, который был применен для изучения многих видов РНК-зависимых динамических процессов, включая транскрипцию и трансляцию26,27,28,29,30,31,32. Использование оптического пинцета позволило детально исследовать молекулярные взаимодействия, структуры нуклеиновых кислот и термодинамические свойства, кинетику и энергетику этих процессов16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Оптический пинцет основан на захвате микроскопических объектов сфокусированным лазерным лучом. В типичном эксперименте с ОТ интересующая молекула привязана между двумя прозрачными (обычно полистирольными) шариками (рисунок 1А)27. Эти бусины затем захватываются оптическими ловушками, которые ведут себя как пружины. Таким образом, сила, приложенная к молекуле, может быть рассчитана на основе смещения шарика от центра сфокусированного лазерного луча (центра ловушки). В последнее время оптический пинцет был объединен с конфокальной микроскопией (рисунок 1B), что позволяет проводить флуоресценцию или измерения резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET)40,41,42. Это открывает совершенно новую область возможных экспериментов, позволяющих одновременно измерять и, следовательно, точно соотносить данные силовой спектроскопии и флуоресценции.

Здесь мы демонстрируем эксперименты с использованием оптического пинцета в сочетании с конфокальной микроскопией для изучения белково-РНК-взаимодействий, регулирующих трансляционное смещение кадра. Между объективом и конденсатором проточная ячейка с пятью каналами обеспечивает непрерывное применение пробы с ламинарной подачей. Через микрофлюидные каналы различные компоненты могут быть введены напрямую, что уменьшает практическое время, а также позволяет очень мало потреблять образец на протяжении всего эксперимента.

Во-первых, предлагается базовое руководство, помогающее в разработке экспериментов ОТ, и обсуждаются преимущества, а также подводные камни различных установок. Далее описывается подготовка образцов и экспериментальные рабочие процессы, а также предоставляется протокол анализа данных. Чтобы представить пример, мы излагаем результаты, полученные в результате экспериментов по растяжению РНК для изучения элементов РНК, изменяющих кадр SARS-CoV-2 (рисунок 2A) с трансдействующим фактором короткой изоформой противовирусного белка цинк-пальца (ZAP), который изменяет трансляцию вирусной РНК из альтернативного кадра считывания43. Кроме того, показано, что флуоресцентно-меченые рибосомы могут быть использованы в этом конфокальном анализе ОТ, который был бы полезен для мониторинга процессивности и скорости машины перевода. Метод, представленный здесь, может быть использован для быстрого тестирования эффекта различных буферов, лигандов или других клеточных компонентов для изучения различных аспектов трансляции. Наконец, обсуждаются распространенные экспериментальные подводные камни и способы их устранения. Ниже изложены некоторые важные моменты в экспериментальном проектировании.

Проектирование конструкций
В принципе, существует два общих подхода к созданию OT-совместимой конструкции РНК. Первый подход использует длинную молекулу РНК, которая гибридизуется с комплементарными ручками ДНК, что дает конструкцию, состоящую из двух гибридных областей РНК/ДНК, фланкирующих одноцепочечную последовательность РНК посередине (рисунок 2B). Этот подход используется в большинстве экспериментов с ОТ РНК33,44,45.

Второй подход использует преимущества дескрипторов dsDNA с короткими (около 20 нт) свесами15,17. Эти выступы затем гибридизуются с молекулой РНК. Несмотря на более сложную конструкцию, использование дескрипторов dsDNA преодолевает некоторые ограничения гибридной системы ДНК/РНК. В принципе, могут быть реализованы даже очень длинные ручки (>10кб), что более удобно для конфокальных измерений. Кроме того, молекула РНК может быть лигирована на ручки ДНК для повышения стабильности троса.

Стратегия конечной маркировки
Конструкция должна быть привязана к бусинам посредством сильного молекулярного взаимодействия. Хотя существуют подходы к ковалентному связыванию ручек с бусинами46, сильные, но нековалентные взаимодействия, такие как стрептавидин-биотин и дигоксигенин-антитело, обычно используются в экспериментах OT15,33,35,45. В описанном протоколе конструкция маркирована биотином или дигоксигенином, а шарики покрыты стрептавидином или антителами против дигоксигенина соответственно (фиг.1А). Этот подход был бы пригоден для приложения сил примерно до 60 пН (на трос)47. Кроме того, использование различных стратегий маркировки 5' и 3' позволяет определить ориентацию троса, образованного между бусинами17.

Маркировка белка для измерения флуоресценции
Для конфокальной визуализации существует несколько широко используемых подходов к флуоресцентной маркировке. Например, флуорофоры могут быть ковалентно присоединены к аминокислотным остаткам, которые находятся в белках или вводятся сайт-направленным мутагенезом через реакционноспособную органическую группу. Тиоловые или амино-реактивные красители могут быть использованы для маркировки остатков цистеина и лизина соответственно. Существует несколько обратимых методов защиты для повышения специфичности маркировки48,49, однако нативные белки обычно маркируются несколькими остатками. Хотя небольшой размер флуорофора может дать преимущество, неспецифическая маркировка может влиять на активность белка и, таким образом, интенсивность сигнала может варьироваться49. Также в зависимости от эффективности маркировки интенсивность сигнала может отличаться в разных экспериментах. Поэтому перед экспериментом следует выполнить проверку активности.

В случае, если интересующий белок содержит N- или C-концевую метку, такую как His-tag или strep-tag, специфическая маркировка этих меток представляет собой другой популярный подход. Кроме того, маркировка, нацеленная на метки, снижает вероятность вмешательства флуорофора в активность белка и может повысить растворимость49. Тем не менее, маркировка, специфичная для метки, обычно дает монофлуорофорные меченые белки, которые может быть трудно обнаружить. Другой способ специфической маркировки может быть достигнут путем использования антител.

Настройка микрофлюидики
Сочетание ОТ с системой микрофлюидики позволяет быстро переходить между различными экспериментальными условиями. Кроме того, современные системы используют преимущества поддержания ламинарного потока внутри проточной ячейки, что исключает смешивание жидкостей из других каналов в перпендикулярном направлении относительно направления потока. Поэтому ламинарный поток особенно выгоден для экспериментального проектирования. В настоящее время обычно используются проточные ячейки с 5 каналами (рисунок 3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Пробоподготовка

  1. Клонируйте интересующую последовательность в вектор, содержащий фрагменты лямбда-ДНК, которые служат дескрипторными последовательностями (рисунок 2)43,50.
  2. Сначала сгенерируют шаблон ДНК для последующей транскрипции in vitro с помощью ПЦР (рисунок 2B; реакция 1). На этом этапе ПЦР промотор Т7 добавляется в 5' конец молекулы ДНК 32,33,43,50. Устанавливают реакцию ПЦР согласно таблице 1. Запустите ПЦР в 50 мкл аликвот с соответствующими циклами в термоциклере.
  3. Подготавливают ручки двумя отдельными реакциями ПЦР (табл. 1, рис. 2В; реакции 2 и 3). Во-первых, сгенерируйте 5-футовую ручку с помощью ПЦР. Затем сгенерируйте ручку 3' и одновременно пометьте ее дигоксигенином с помощью 5'-дигоксигениновой грунтовки32,33,43,50.
  4. После ПЦР очистите ДНК с помощью спиновых колонн кремнезема.
  5. Проводят реакцию транскрипции in vitro с использованием Т7 РНК-полимеразы (табл. 2)32,33,43,50. Инкубируют реакцию при 37 °С в течение 2-4 ч в зависимости от длины РНК. Затем добавляют ДНКазу I в реакцию и инкубируют при 37 °C в течение 30 мин для переваривания шаблона ДНК. Очистите РНК с помощью спиновых столбиков кремнезема.
  6. Во время реакции маркировки 5' ручки (таблица 3) добавляют биотин-16-dUTP на 3' конце ручки ДНК-полимеразой T438,50. Проводят реакцию при комнатной температуре в течение 1-2 ч. После этого очистите ДНК с помощью спиновых колонн кремнезема.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку ручка 5' должна быть маркирована на ее 3' конце (рисунок 2B), маркировка не может быть выполнена во время ПЦР.
  7. Смешайте упомянутые выше компоненты - ручку 5' (3' помеченную биотином), 3' ручку (5' помеченную дигоксигенином) и РНК - в молярном соотношении 1:1:1 в буфере отжига (80% формамид, 400 мМ NaCl, 40 мМ HEPES, рН 7,5, 0,5 мМ ЭДТА, рН 8), чтобы получить желаемый гибрид РНК/ДНК (таблица 4). Нагрейте смесь для отжига до 85 °C в течение 10 мин, а затем медленно охладите до 4 °C.
  8. Смешайте отожженный образец с 1/10 объема 3 М ацетата натрия (рН 5), 3 объемами ледяного этанола и инкубируйте при -80 °C в течение не менее 1 ч или при -20 °C в течение ночи.
  9. Центрифугируйте образцы при 15 000 × г в течение 30 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант и высушите гранулу (обычно не видимую) под вакуумом.
  10. Наконец, повторно суспендируют гранулы в 50 мкл воды без РНКазы и делают аликвоты. Храните аликвоты при -80 °C до использования. Для краткосрочного хранения образцы могут также храниться при -20 °C.

2. Настройка приборов

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол оптимизирован для коммерческого оптического пинцета прибора C-Trap от компании LUMICKS. Поэтому при использовании других оптических пинцетов может потребоваться корректировка представленных этапов. Если не используется, система микрофлюидики машины хранится в отбеливателе (раствор гипохлорита натрия) и должна быть вымыта перед использованием.

  1. Отбеливатель и наполните шприцы 1 мл воды без РНКазы.
  2. Добавьте 50 мкл 0,5 М тиосульфата натрия по меньшей мере к 1 мл воды без РНКазы и тщательно промыть систему (1 бар, по меньшей мере 0,5 мл) для устранения оставшегося отбеливателя в системе.
  3. Выбросьте раствор тиосульфата натрия из шприцев. Замените шприцы на свежие и промойте систему не менее чем 0,5 мл воды без РНКазы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы система микрофлюидики никогда не пересыхала, чтобы избежать пузырьков воздуха в системе.
  4. Нанесите 2 капли погружного масла (показатель преломления 1,33) или примерно 70 мкл воды поверх объектива.
  5. Поместите проточную ячейку внутрь удерживающей рамы в ее положении.
  6. Нанесите 2 капли погружного масла (показатель преломления 1,51) поверх проточной ячейки.
  7. Включите лазерное устройство в пинцете. Как только он запустится, включите улавливающий лазер в программном интерфейсе на 100%.
  8. Используя диагностические камеры (Z-finder), отрегулируйте ось Z к середине камеры между вторым и третьим отражениями (интерфейсами), где кольца преломления являются самыми большими, повернув микровинт.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз, когда объектив перемещается ближе к измерительной камере и фокальная плоскость объектива пересекает границу раздела между двумя фазами, отражение может быть распознано в режиме Z-finder. Возможны 4 интерфейса: (i) вода/иммерсионное масло и нижнее стекло (ii) нижнее стекло и буфер внутри камеры (iii) буфер внутри камеры и верхнее стекло (iv) верхнее стекло и погружное масло для конденсатора.
  9. Отрегулируйте положение конденсатора (установите улавливающий лазер примерно на 50%) таким образом, чтобы конденсатор касался погружного масла поверх измерительной камеры.
  10. Отрегулируйте фокусировку, медленно двигаясь вниз / вверх с конденсатором, поэтому около 10 световых полос отображаются в режиме Луны (диагностические камеры).

3. Измерение образца

  1. Инкубировать шарики с антидигоксигениновым покрытием (AD) с конструкциями образца (3 мкл 0,1% (мас./об.) суспензии бусин AD + 4 мкл образца) и с 1 мкл ингибиторов РНКАЗЫ и 8 мкл буфера анализа (300 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 20 мМ HEPES, рН 7,6, 0,05% Tween 20, 5 мМ DTT) при РТ в течение 10-20 мин. После инкубации разбавляют образец в 500 мкл буфера анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется добавлять поглотители кислорода, особенно во время флуоресцентных измерений, в буфер, чтобы предотвратить окислительное повреждение. Здесь использовалась кислородная система поглотителей, содержащая глюкозу (8,3 мг/мл), глюкозооксидазу (40 Ед/мл) и каталазу (185 Ед/мл).
  2. Смешайте 0,8 мкл 1% (мас./об.) шариков, покрытых стрептавидином (SA), с 1 мл буфера анализа.
  3. Выбросьте воду из шприцев и наполните шприцы соответствующими суспензиями/растворами. Мойте не менее 2 минут примерно при 1 баре, а затем начинайте ловить бусины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от экспериментальной установки могут использоваться различные схемы каналов (рисунок 3). Как правило, один проточный канал заполнен анти-дигоксигениновыми шариками, несущими молекулу РНК. Второй канал заполнен бусинами, покрытыми стрептавидином. Буферный канал используется для формирования тросов. Четвертый канал может быть использован для загрузки РНК-связывающего белка (рисунок 3C), или, альтернативно, RBP может быть добавлен непосредственно в буферный канал (фиг.3B).
  4. Чтобы захватить бусины, отодвиньте оптические ловушки друг от друга. Сначала перейдите на канал AD и поймайте AD-бусину в ловушку 1. Далее переместите сцену в SA-канал и поймайте одну бусину SA ловушкой 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь оставаться на границе буферных и бисежных каналов, чтобы избежать потери уже пойманной бусины или предотвратить ловлю нескольких бусин одной и той же ловушкой.
  5. Как только бусины нужного размера будут захвачены, переместитесь в буферный канал и остановите ламинарный поток. Затем выполните калибровку силы, чтобы проверить жесткость ловушки. Соответствующие значения жесткости не должны отличаться по оси x/y более чем на 10-15%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте мощность лазера или лазерное разделение между ловушками в соответствии с размером шарика. Силовая калибровка не должна выполняться для каждой пары бусин, если шаблоны бусин совпадают (показатель сходства > 0,9). Тем не менее, он должен выполняться регулярно или, по крайней мере, каждый раз, когда изменяются условия анализа.
  6. Начните ловлю на трос, переместив бусины близко друг к другу, подождав несколько секунд, а затем раздвинув их обратно, повторяйте до тех пор, пока не сформируется трос. Образование троса приводит к увеличению измеренной силы при оттягивании двух бусин друг от друга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать образования нескольких привязок, бусины не следует перемещать слишком близко. Поймав трос между двумя бусинами, качество троса можно проверить, найдя растянутое плато. Плато должно составлять от 50 до 60 пН для одного троса.
  7. Получив страховочный трос, приступайте к измерению. В зависимости от изучаемого явления следует выбирать различные измерительные установки (рис. 1В-Д).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно в начале эксперимента проводится эксперимент с силовой рампой, чтобы проверить качество троса и исследовать поведение. После этого можно также начать эксперименты с постоянной силой или постоянным положением для дальнейшего изучения переходов состояний. После того, как на образце РНК было выполнено достаточное количество измерений для определения его поведения, помеченные факторы могут быть добавлены в систему для выполнения конфокальных измерений.
  8. Для выполнения флуоресцентных измерений включите конфокальные лазеры и блок счетчика фотонов в приборе оптического пинцета.
  9. Включите лазер возбуждения нужной длины волны в программном интерфейсе и установите мощность лазера на 5% или выше, в зависимости от флуорофора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При неизмерении понизьте настройку мощности лазера возбуждения до 0%, чтобы избежать чрезмерных фотоповреждений образца.
  10. Запустите создание образа образца с помощью функций изображения программного обеспечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить хорошо сфокусированные изображения, фокальная плоскость конфокального микроскопа и оптические ловушки должны быть выровнены. Для этого может быть использована автофлуоресценция полистирольных шариков в синем лазерном канале. Фокальная плоскость оптических ловушек перемещается вверх или вниз по оси Z до тех пор, пока изображение бусин не достигнет своего наибольшего диаметра. В этом положении можно измерить флуоресцентный сигнал от молекулы, привязанной между шариками.
  11. Чтобы использовать функцию кимографа, укажите положение x-y оси кимографа, чтобы оно позволяло обнаруживать трос между бусинами.
  12. На протяжении всего измерения состав буфера может быть легко изменен путем перемещения шариков в различные каналы или путем изменения буфера, подаваемого в систему микрофлюидики.

4. Анализ данных

  1. Предварительная обработка необработанных данных
    1. Используя простой сценарий, уменьшите выборку необработанных данных достаточно, чтобы (i) обеспечить более быструю последующую обработку данных, но (ii) по-прежнему содержать всю критическую информацию (рисунок 4A). Обычно для этой цели подходит 100-5000 Гц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Частота сбора данных в экспериментах с оптическим пинцетом часто выше, чем это необходимо для анализа - в представленных экспериментах частота сбора данных по умолчанию установлена на уровне 78 125 Гц. Поскольку пространство для хранения ограничено, это удобно и экономит время, чтобы уменьшить частоту дискретизации данных. Здесь необработанные данные были понижены в 30 раз.
    2. Затем используйте фильтр сигнала для уменьшения шума высокочастотного измерения от сигнала (рисунок 4A). Отрегулируйте степень фильтра и параметры частоты среза соответственно, чтобы оптимизировать вывод данных различных экспериментов (рисунок 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среди сигнальных фильтров фильтр Баттерворта51 является одним из наиболее широко используемых. В дополнительных данных предусмотрен специально написанный скрипт python, позволяющий предварительно обрабатывать необработанные данные. Параметры понижения дискретизации и фильтрации сигналов (частота среза, степень фильтра) должны быть оптимизированы для различных экспериментов.
  2. Для анализа данных force-ramp выполните следующие действия.
    1. Пометьте шаги либо вручную, найдя соответствующие точки на графике траектории силы, либо с помощью специально написанных сценариев. Разворачивающиеся шаги характеризуются внезапным падением силы в сочетании с увеличением расстояния по кривой сила-расстояние (FD).
    2. После того, как разворачивающиеся события отмечены, подойдите к различным областям кривой FD с помощью соответствующих моделей (рисунок 4D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для региона, предшествующего первому этапу разворачивания, трос можно считать "двухцепочечным" и обычно подходит с использованием расширяемой червеобразной модели цепи (WLC)47,52,53. Частями после первого разворачивающегося события считается комбинация двухцепочечных нуклеотидов (ручек) и одноцепочечных нуклеотидов (развернутая молекула РНК). Таким образом, подгонка данных является более сложной - обычно используется комбинация из 2 моделей WLC или моделей WLC и свободно сращенной цепи (FJC)36,39,52. Расширяемая модель WLC имеет два основных параметра подгонки: длина контура (LC) и длина сохраняемости (LP). Длина контура соответствует длине полностью растянутой молекулы, а длина стойкости определяет изгибающие свойства интересующей молекулы. Модель может быть описана с помощью следующего уравнения (1). WLC может использоваться для моделирования поведения как сложенных, так и развернутых областей, хотя для каждой из них должна использоваться отдельная модель с различными параметрами.
      (1) figure-protocol-1
      где x — разгибание, LC — длина контура, F — сила, LP — длина стойкости, kB — постоянная Больцмана, T — термодинамическая температура, а S — модуль растяжения.
      Вторая модель, называемая свободно-сочлененной цепью (FJC), обычно используется для описания поведения развернутых одноцепочечных областей. Он использует аналогичные параметры полимеров, но рассматривает каждую единицу «цепи» как жесткий стержень, здесь соответствующий нуклеотидам развернутой одноцепочечной области. Следующее уравнение (2) описывает эту модель:
      (2) figure-protocol-2
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наша лаборатория недавно разработала алгоритм, который позволяет пакетную обработку необработанных данных о силовой рампе под названием «Практический анализ оптического пинцета TOol (POTATO)54». Алгоритм понижает и фильтрует данные, затем определяет возможные этапы развертывания и, наконец, выполняет подгонку данных. POTATO встроен в удобный графический интерфейс пользователя (GUI) (https://github.com/REMI-HIRI/POTATO).
  3. Обрабатывайте данные с постоянной силой следующим образом:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие инструкции могут быть аналогичным образом применены к данным с постоянным положением.
    1. Для данных о постоянной силе постройте график расстояния с течением времени (рисунок 5). Гистограмма, показывающая частоту (количество) различных конформаций над относительным изменением положения, является полезным способом характеристики различных доминирующих и второстепенных состояний (рисунок 7).
    2. Подойдите к гистограмме, используя (множественные) функции Гаусса для оценки общего процента отдельных конформеров при заданной силе (рисунок 7C). Гауссовское соответствие, среднее положение и стандартное отклонение описывают связанные с силой отношения между различными популяциями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнительных данных приведен специально написанный скрипт python, позволяющий проводить предварительную обработку и базовую бимодальную гауссовскую подгонку данных с постоянной силой. Параметры (частота среза, степень фильтра, ожидаемые средние значения, значения стандартного отклонения и амплитуды) необходимо оптимизировать для различных экспериментов.
    3. Затем используйте модель Скрытого Маркова для дальнейшего анализа состояний, которые могут обнаружить дополнительные складчатые промежуточные продукты (конформеры)55. Для получения дополнительной информации о модели постоянной силы и Скрытого Маркова можно обратиться к 55,56,57,58.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом разделе основное внимание уделяется измерениям взаимодействий РНК-белок/лиганд флуоресцентным оптическим пинцетом. Описание общих экспериментов с оптическим пинцетом РНК и соответствующих репрезентативных результатов см. в разделе32. Для более подробного обсуждения взаимодействий РНК/ДНК-белок см. также 1,2,26,59,60.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы демонстрируем использование флуоресцентно-связанных оптических пинцетов для изучения взаимодействий и динамического поведения молекул РНК с различными лигандами. Ниже обсуждаются критические шаги и ограничения данной методики.

Критические шаги в протоколе
Что касается многих других методов, качество выборки имеет решающее значение для получения достоверных данных. Поэтому для получения образцов максимально возможного качества стоит потратить время на оптимизацию пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Ануджу Кибе и профессора Редмонда Смита за критическое рецензирование рукописи. Благодарим Татьяну Кох за экспертную техническую помощь. Благодарим Кристину Пекаркову за помощь в записи экспериментальных видео. Работа в нашей лаборатории поддерживается Ассоциацией Гельмгольца и финансированием гранта Европейского исследовательского совета (ERC) Nr. 948636 (NC).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>штаммы бактерий
кишечная палочка HB101лабораторная коллекцияН/Аклонирование векторов
<сильно>химикаты и ферменты
хлорид натрияSigma-Aldrich31424Буферы
Биотин-16-dUTPRoche11093070910биотинилирование
BSASigma-AldrichA4737Буферы
CatalaseLumicksN/AКислородная система для удаления
Dithiothreitol (DTT)Melford LabsD11000Буферы
ДНК I из поджелудочной железы крупного рогатого скотаSigma-AldrichD4527in vitro транскрипция
dNTPsTh.Geyer11786181ПЦР
ЭДТАСигма-ОлдричE9884Буферы
формамидСигма-Олдрич11814320001Буферы
глюкозыСигма-ОлдричG8270-1KGКислородная система
Глюкозо-оксидазаЛюмиксН/ДКислородная система
ГепесКарл РотHN78.3Буферы
Хлорид магнияКарл Рот2189.1Буферы
Phusion DNA полимеразаNEBM0530LGibson сборка, клонирование
хлорида калияMerck529552-1KGБуферы
PrimeSTAR GXL ДНК ПолимеразаTakara Bio ClontechR050AПЦР
Пирофосфотаза, термостабилизация, неорганическийNEBM0296Lin vitro Ингибитор транскрипции
РНКазыMolox1000379515Буферы
rNTPSlife technologiesR0481транскрипция in vitro
Тиосулофат натрияSigma-AldrichS6672-500GДезактивация отбеливателя
Sytox GreenLumicksН/Дконфокальные измерения
T4 ДНК-полимеразаNEBM0203SБиотинилирование
Т5 экзонуклеазаNEBM0363SGibson сборка, клонирование
T7 РНК-полимеразаПроизведено на собственном производствеN/Ain vitro транскрипция
Taq ДНК-полимеразаNEBM0267SПЦР
Taq лигазаBiozymL6060LGibson сборка, клонирование
TWEEN 20 BioXtraSigma-AldrichP7949Buffers
Kits
Набор для мечения монолитных белков RED-NHS 2-го поколения (аминоактивный)NanotemperMO-L011Используется для мечения рибосомами
Purefrex 2.0GeneFrontierPF201-0.25-EXРибосомы используются для мечения
<сильные>Олигонуклеотиды
5' ручка T7 прямоймикросинтезпользовательский заказ5' - CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC - 3', используется для генерации шаблона транскрипции OT in vitro в PCR
1 3' обрабатывает обратныймикросинтезпользовательский заказ5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', используется для генерации шаблона транскрипции OT in vitro в ПЦР 1
5' ручка впередMicrosynthпользовательский заказ5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , используется для генерации ручки 5' в PCR
5' ручка обратногоMicrosynthпользовательский заказ5' - CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3', используется для генерации ручки 5' в PCR 2
3' ручка впередMicrosynthпользовательский заказ5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG - 3', используется для генерации 3' ручки в PCR 3
' 3' ручка обратная 5' помечен дигоксигениномMicrosynthпо индивидуальному заказу5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', использован для генерации 3'-ручки в векторах ПЦР 3
ДНК
pMZ_OTпроизведен на собственном производствеN/Aдальнейшее описание в "Структурные исследования белка Cardiovirus 2A раскрывают молекулярную основу для распознавания РНК и трансляционного контроля"
Крис Х. Хилл, Савсан Наптин, Лукас Пекарек, Ануджа Кибе, Эндрю Э. Ферт, Стивен К. Грэм, Нева Калискан, Ян Брайерли
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atomhttps://atom.io/packages/ide-pythonN/A
BluelakeLumicksN/A
Graphpadhttps://www.graphpad.com//A
InkScape 0.92.3https://inkscape.org/N/A
Матлабhttps://www.mathworks.com/products/matlab.htmlН/Д
Структура РНК https://github.com/lpekarek/POTATO.git КАРТОФЕЛЯ/А
https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.htmlН/Д
Спайдерhttps://www.spyder-ide.org/Н/А
<стронг>Другой
Частицы полистирола со стрептавидиновым покрытием, 1,5-1,9 &; m, 5 мл, 1.0% в/вСферотекСВП-15-5
Антидигоксигенин Частицы полистирола с покрытием, 2.0-2.4 и микро; m, 2 мл, 0,1% в/вSpherotechDIGP-20-2
ШприцыVWRTERUMO SS+03L1
Devices
C-trapLumicksN/A  оптический пинцет в сочетании с конфокальной микроскопией
отходов N Н

Ссылки

  1. Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096(2019).
  2. Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118(2021).
  3. Firth, A. E., Brierley, I. Non-canonical translation in RNA viruses. Journal of General Virology. 93, Pt 7 1385-1409 (2012).
  4. Caliskan, N., Peske, F., Rodnina, M. V. Changed in translation: mRNA recoding by −1 programmed ribosomal frameshifting. Trends in Biochemical Sciences. 40 (5), 265-274 (2015).
  5. Jaafar, Z. A., Kieft, J. S. Viral RNA structure-based strategies to manipulate translation. Nature Reviews Microbiology. 17 (2), 110-123 (2019).
  6. Eswarappa, S. M., et al. Programmed translational readthrough generates antiangiogenic VEGF-Ax. Cell. 157 (7), 1605-1618 (2014).
  7. Rodnina, M. V., et al. Translational recoding: canonical translation mechanisms reinterpreted. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1056-1067 (2020).
  8. Li, Y., et al. Transactivation of programmed ribosomal frameshifting by a viral protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 2172(2014).
  9. Napthine, S., et al. Protein-directed ribosomal frameshifting temporally regulates gene expression. Nature Communications. 8 (1), 15582(2017).
  10. Patel, A., et al. Molecular characterization of the RNA-protein complex directing -2/-1 programmed ribosomal frameshifting during arterivirus replicase expression. Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 17904-17921 (2020).
  11. Napthine, S., Bell, S., Hill, C. H., Brierley, I., Firth, A. E. Characterization of the stimulators of protein-directed ribosomal frameshifting in Theiler's murine encephalomyelitis virus. Nucleic Acids Research. 47 (15), 8207-8223 (2019).
  12. Marshall, R. A., Aitken, C. E., Dorywalska, M., Puglisi, J. D. Translation at the Single-Molecule Level. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 177-203 (2008).
  13. Rodnina, M. V. The ribosome in action: Tuning of translational efficiency and protein folding. Protein science : A publication of the Protein Society. 25 (8), 1390-1406 (2016).
  14. Rodnina, M. V., Fischer, N., Maracci, C., Stark, H. Ribosome dynamics during decoding. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 372 (1716), (2017).
  15. Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160 (5), 870-881 (2015).
  16. Liu, T., et al. Direct measurement of the mechanical work during translocation by the ribosome. eLife. 3, 03406(2014).
  17. Desai, V. P., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
  18. Choi, J., O'Loughlin, S., Atkins, J. F., Puglisi, J. D. The energy landscape of -1 ribosomal frameshifting. Science Advances. 6 (1), (2020).
  19. Prabhakar, A., Puglisi, E. V., Puglisi, J. D. Single-molecule fluorescence applied to translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032714(2019).
  20. Bao, C., et al. mRNA stem-loops can pause the ribosome by hindering A-site tRNA binding. Elife. 9, 55799(2020).
  21. Chen, J., Tsai, A., O'Leary, S. E., Petrov, A., Puglisi, J. D. Unraveling the dynamics of ribosome translocation. Current Opinion in Structural Biology. 22 (6), 804-814 (2012).
  22. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475 (7354), 118-121 (2011).
  23. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1044-1056 (2014).
  24. Blanchard, S. C. Single-molecule observations of ribosome function. Current Opinion in Structural Biology. 19 (1), 103-109 (2009).
  25. Juette, M. F., et al. The bright future of single-molecule fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 103-111 (2014).
  26. McCauley, M. J., Williams, M. C. Mechanisms of DNA binding determined in optical tweezers experiments. Biopolymers. 85 (2), 154-168 (2007).
  27. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics Letters. 11 (5), 288-290 (1986).
  28. Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current Opinion in Structural Biology. 10 (3), 279-285 (2000).
  29. Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23(2019).
  30. Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. Recent advances in optical tweezers. Annual Reviews of Biochemistry. 77, 205-228 (2008).
  31. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA Unfolds and Refolds. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 77-100 (2008).
  32. Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of single RNA molecules by optical tweezers. Journal of Visualized Experiments. (90), e51542(2014).
  33. Halma, M. T. J., Ritchie, D. B., Cappellano, T. R., Neupane, K., Woodside, M. T. Complex dynamics under tension in a high-efficiency frameshift stimulatory structure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (39), 19500(2019).
  34. Hansen, T. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B., Sørensen, M. A. Correlation between mechanical strength of messenger RNA pseudoknots and ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5830-5835 (2007).
  35. Zhong, Z., et al. Mechanical unfolding kinetics of the SRV-1 gag-pro mRNA pseudoknot: possible implications for -1 ribosomal frameshifting stimulation. Science Reports. 6, 39549(2016).
  36. McCauley, M. J., Rouzina, I., Li, J., Núñez, M. E., Williams, M. C. Significant differences in RNA structure destabilization by HIV-1 GagDp6 and NCp7 proteins. Viruses. 12 (5), 484(2020).
  37. de Messieres, M., et al. Single-molecule measurements of the CCR5 mRNA unfolding pathways. Biophysics Journal. 106 (1), 244-252 (2014).
  38. Yang, L., et al. Single-molecule mechanical folding and unfolding of RNA hairpins: Effects of single A-U to A·C pair substitutions and single proton binding and implications for mRNA structure-induced -1 ribosomal frameshifting. Journal of American Chemical Society. 140 (26), 8172-8184 (2018).
  39. McCauley, M. J., et al. Targeted binding of nucleocapsid protein transforms the folding landscape of HIV-1 TAR RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13555-13560 (2015).
  40. Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. High-resolution "Fleezers": Dual-trap optical tweezers combined with single-molecule fluorescence detection. Methods in Molecular Biology. 1486, Clifton, N.J. 183-256 (2017).
  41. Yerramilli, V. S., Kim, K. H. Labeling RNAs in live cells using malachite green aptamer scaffolds as fluorescent probes. ACS Synthetic Biology. 7 (3), 758-766 (2018).
  42. Gross, P., Farge, G., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Combining optical tweezers, single-molecule fluorescence microscopy, and microfluidics for studies of DNA-protein interactions. Methods in Enzymology. 475, 427-453 (2010).
  43. Zimmer, M. M., et al. The short isoform of the host antiviral protein ZAP acts as an inhibitor of SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting. Nature Communications. 12 (1), 7193(2021).
  44. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A. N., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39 (17), 7677-7687 (2011).
  45. Ritchie, D. B., Soong, J., Sikkema, W. K., Woodside, M. T. Anti-frameshifting ligand reduces the conformational plasticity of the SARS virus pseudoknot. Journal of the American Chemical Society. 136 (6), 2196-2199 (2014).
  46. Janissen, R., et al. Invincible DNA tethers: covalent DNA anchoring for enhanced temporal and force stability in magnetic tweezers experiments. Nucleic Acids Research. 42 (18), 137(2014).
  47. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. Science. 271 (5250), 795(1996).
  48. Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Labeling of specific cysteines in proteins using reversible metal protection. Biophysical Journal. 100 (10), 2513-2521 (2011).
  49. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  50. Hill, C. H., et al. Structural and molecular basis for Cardiovirus 2A protein as a viral gene expression switch. Nature Communications. 12 (1), 7166(2021).
  51. Butterworth, S. On the theory of filter amplifiers. Experimental Wireless and the Wireless Engineer. 7, 536-541 (1930).
  52. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophysics Journal. 72 (3), 1335-1346 (1997).
  53. Mukhortava, A., et al. Structural heterogeneity of attC integron recombination sites revealed by optical tweezers. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1861-1870 (2019).
  54. Buck, S., Pekarek, L., Caliskan, N. POTATO: An automated pipeline for batch analysis of optical tweezers data. bioRxiv. , (2021).
  55. Zhang, Y., Jiao, J., Rebane, A. A. Hidden Markov modeling with detailed balance and its application to single protein folding. Biophysical Journal. 111 (10), 2110-2124 (2016).
  56. Sgouralis, I., Pressé, S. An introduction to infinite HMMs for single-molecule data analysis. Biophysics Journal. 112 (10), 2021-2029 (2017).
  57. Müllner, F. E., Syed, S., Selvin, P. R., Sigworth, F. J. Improved hidden Markov models for molecular motors, part 1: basic theory. Biophysical Journal. 99 (11), 3684-3695 (2010).
  58. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical Journal. 103 (7), 1490-1499 (2012).
  59. Re, A., Joshi, T., Kulberkyte, E., Morris, Q., Workman, C. T. RNA-protein interactions: an overview. Methods Molecular Biology. 1097, 491-521 (2014).
  60. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  61. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  62. Sunbul, M., Jäschke, A. SRB-2: a promiscuous rainbow aptamer for live-cell RNA imaging. Nucleic Acids Research. 46 (18), 110(2018).
  63. Sanchez de Groot, N., et al. RNA structure drives interaction with proteins. Nature Communications. 10 (1), 3246(2019).
  64. Zeffman, A., Hassard, S., Varani, G., Lever, A. The major HIV-1 packaging signal is an extended bulged stem loop whose structure is altered on interaction with the Gag polyprotein. Journal of Molecular Biology. 297 (4), 877-893 (2000).
  65. Mangeol, P., et al. Probing ribosomal protein-RNA interactions with an external force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18272(2011).
  66. Luo, X., et al. Molecular mechanism of RNA recognition by Zinc-Finger antiviral protein. Cell Reports. 30 (1), 46-52 (2020).
  67. Qu, X., Lancaster, L., Noller, H. F., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosomal protein S1 unwinds double-stranded RNA in multiple steps. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (36), 14458-14463 (2012).
  68. Chandra, V., Hannan, Z., Xu, H., Mandal, M. Single-molecule analysis reveals multi-state folding of a guanine riboswitch. Nature Chemical Biology. 13 (2), 194-201 (2017).
  69. Savinov, A., Perez, C. F., Block, S. M. Single-molecule studies of riboswitch folding. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (10), 1030-1045 (2014).
  70. Kelly, J. A., et al. Structural and functional conservation of the programmed ribosomal frameshift signal of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Journal of Biological Chemistry. 295 (31), 10741-10748 (2020).
  71. Neupane, K., et al. Structural dynamics of single SARS-CoV-2 pseudoknot molecules reveal topologically distinct conformers. Nature Communications. 12 (1), 4749(2021).
  72. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  73. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  74. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  75. Rill, N., Mukhortava, A., Lorenz, S., Tessmer, I. Alkyltransferase-like protein clusters scan DNA rapidly over long distances and recruit NER to alkyl-DNA lesions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 117 (17), 9318-9328 (2020).
  76. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  77. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  78. Wen, J. -D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophysical journal. 92 (9), 2996-3009 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Оптический пинцет для изучения РНК-белковых взаимодействий в регуляции трансляции
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.