Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модель нейронального апоптоза, индуцированного компрессией спинного мозга у крыс

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62604

⸱

29 июня 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Research Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы представляем протокол для создания модели компрессии спинного мозга крысы, оценки ее поведенческой оценки и наблюдения за сжатой областью спинного мозга. Поведенческие оценки показали снижение двигательной инвалидности монитора. Окрашивание гематоксилином и эозином и иммуноокрашивание выявили значительный апоптоз нейронов в сжатой области спинного мозга.

Аннотация

Будучи тяжелым прогрессирующим дегенеративным заболеванием, шейная спондилотическая миелопатия (РШМ) имеет плохой прогноз и связана с физической болью, скованностью, двигательной или сенсорной дисфункцией, а также высоким риском травмы спинного мозга и акропарализа. Таким образом, срочно необходимы терапевтические стратегии, способствующие эффективной регенерации спинного мозга при этом хроническом и прогрессирующем заболевании. Для понимания сложного биологического механизма, лежащего в основе ХСМ, необходимы эффективные и воспроизводимые модели компрессии спинного мозга животных. Большинство моделей травмы спинного мозга отражают острые и структурные деструктивные состояния, в то время как животные модели ХСМ демонстрируют хроническую компрессию в спинном мозге. В данной статье представлен протокол для создания модели компрессии спинного мозга крысы, которая была дополнительно оценена путем оценки поведенческой оценки и наблюдения за сжатой областью спинного мозга. Поведенческие оценки показали снижение двигательной инвалидности, включая движения суставов, способность шагать, координацию, стабильность туловища и силу мышц конечностей. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и иммуноокрашивание выявили значительный апоптоз нейронов в сжатой области спинного мозга.

Введение

Являясь распространенным прогрессирующим дегенеративным заболеванием, на долю ХСМ приходится 5-10% всех шейных спондилелов1. Если пациенты, страдающие ХСМ, игнорируют свои симптомы и не лечат их своевременно и эффективно, это может привести к серьезным осложнениям, таким как повреждение спинного мозга и паралич конечностей, которые будут ухудшаться с возрастом, создавая значительную экономическую и психическую нагрузку для пациентов и их семей 2,3. Патогенез ХСМ сложен и включает в себя статические и динамические факторы, теорию гипоксии-ишемии, повреждение эндотелиальных клеток, теорию разрушения барьера кровеносного спинного мозга, а также теорию воспаления и апоптоза 4,5,6,7.

Статические и динамические механизмы компрессии спинного мозга вызывают клинические симптомы. Выступающие позвоночные диски, деформированные тела позвонков и кальцинированные связки могут вызвать длительную компрессию спинного мозга, которая будет постепенно влиять на гемато-спинной барьер и местную микроциркуляторную русло в спинном мозге 4,8. В свою очередь, ишемия, воспаление и апоптоз поражают нейроны, аксоны и глиальные клетки 6,9.

Экспериментальные модели травмы спинного мозга на животных включают контузионную травму, компрессионную травму, тракционную травму, фотохимическую травму и ишемическую реперфузионную травму. Большинство из этих моделей также отражают некоторые острые и структурные деструктивные условия (транссекция или химическая токсичность). Тем не менее, эти животные модели ХСМ не могут демонстрировать прогрессирующий апоптоз нейронов в спинном мозге.

В этой статье описан подробный протокол для создания модели компрессии спинного мозга крысы, которая была дополнительно оценена путем оценки поведенческой оценки и наблюдения за сжатой областью спинного мозга. Эта модель компрессии спинного мозга крысы является надежной моделью на животных для дальнейшего изучения механизмов, участвующих в ХСМ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Следующая процедура была выполнена с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Шанхайского университета традиционной китайской медицины. Все операции по выживанию проводились в стерильных условиях, как указано в рекомендациях NIH. Боль и риск инфекций контролировались с помощью соответствующих анальгетиков и антибиотиков, чтобы обеспечить успешный исход. Эта хирургическая процедура оптимизирована для аутбредных самцов крыс породы Спрэг-Доули (SD) в возрасте 12 недель и весом 400 г.

1. ПВА-полиакриламидный гидрогелевый препарат

ПРИМЕЧАНИЕ: Как показано на рисунках 1G, 1H, гидрогель ПВА-полиакриламид представляет собой водопоглощающий полимерный лист. В естественном состоянии гель крайне сложно разрезать на мелкие кусочки. Приготовление описывается следующим образом.

  1. Поместите гидрогель ПВА-полиакриламид в воду на 24 часа, чтобы его было легче резать после увлажнения.
  2. С помощью самодельного режущего инструмента (рисунок 1H) разделите весь гидрогель на кусочки размером 2 мм х 2 мм х 2 мм.
  3. Перенесите эти кусочки гидрогеля в печь при температуре 60 °C на 12 часов для дегидратации на мелкие кусочки размером 1 мм x 1 мм x 1 мм в качестве материала для имплантации.

2. Анестезия и подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно надевайте хирургическую шапочку, одноразовые медицинские маски и стерильные хирургические перчатки на протяжении всего стерильного хирургического процесса.

  1. Поместите крысу на грелку и убедитесь, что ректальная температура поддерживается на уровне 37±1 °C во время анестезии.
  2. Поместите крысу в анестезиологическую камеру, заполненную 3% изофлураном, на 3 минуты.
  3. Осторожно ущипните конечности и пальцы ног крысы пинцетом, чтобы проверить потерю абсорбционной реакции, что указывает на успешную анестезию.
  4. Зафиксируйте крысу на операционном столе в положении лежа, следя за тем, чтобы конечности и голова крысы были надежно зафиксированы.
  5. Закрепите маску для анестезии на морде крысы. Введите 2% изофлуран в кислородно-воздушной смеси через стандартную маску для носа крысы для обезболивания на протяжении всей операции по компрессии позвоночника.
  6. Поместите цилиндрическую марлевую салфетку (размером около 30 мм x 20 мм x 60 мм) между крысой и операционным столом (рис. 1A), чтобы обеспечить беспрепятственное проходимость дыхательных путей и полностью открытое хирургическое место на протяжении всей операции.
  7. Сбрейте шерсть вокруг хирургической области шеи крысы с помощью электробритвы.
  8. Нанесите крем для депиляции, чтобы удалить оставшиеся волосы и обнажить кожу.
  9. Продезинфицируйте операционную область йодофором.
  10. Накройте продезинфицированный участок стерильным полотенцем с отверстием, обнажающим только операционный участок на тыльной стороне шеи крысы.

3. Хирургический подход

  1. Сделайте продольный разрез по дорсальной средней линии скальпелем от второго шейного остистого отростка до второго грудного остистого отростка, предварительно чрескожно расположив второй шейный остистый отросток и второй грудной остистый отросток.
  2. Тупым путем разделите мышцы обеих сторон с помощью кровоостанавливающих щипцов, чтобы обнажить пластинку С2-Т2 после разрезания подкожной клетчатки и фасции слой за слоем.
  3. Просверлите отверстие (1 мм х 1 мм) на шейной пластинке (рисунок 1В).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать чрезмерной травмы спинного мозга, убедитесь, что шея крысы находится в состоянии дорсальной дуги, обеспечивая достаточное пространство между шейными пластинками.
  4. С помощью микрохирургических щипцов захватите кусочек гидрогеля ПВА-полиакриламида размером 1 мм х 1 мм х 1 мм и введите его в ранее просверленное отверстие (рисунок 1С, 1Д).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Преходящее подергивание указывает на то, что модель компрессии спинного мозга была успешно создана.
  5. Сшивайте мышцы, фасции, подкожные и кожные ткани, слой за слоем, используя треугольные иглы и шов 5-0.
  6. После дезинфекции переведите животных обратно в клетку и держите их в тепле.
  7. Подкожно вводить анальгезию бупренорфина гидрохлорида (0,03 мг/кг) каждые 6 ч в течение 3 дней после операции и по мере необходимости после нее.

4. Послеоперационное ведение

  1. Вводите эквивалент 100 000 единиц пенициллина внутрибрюшинно крысам один раз в день, чтобы предотвратить послеоперационную инфекцию и облегчить боль.
  2. Переведите крыс в новые клетки, которые постоянно нагревались инфракрасной лампой, чтобы обеспечить адекватное сохранение тепла после операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите нагревательную лампу после того, как сознание крысы восстановится.
  3. Поддерживайте гигиену и вентиляцию клетки для кормления крыс.
  4. Помогайте крысам есть и пить два раза в день. При необходимости проведите массаж мочевого пузыря для облегчения мочеиспускания до тех пор, пока функция мочеиспускания не восстановится.

5. Поведенческая оценка

  1. Используйте шкалу оценки Бассо, Битти и Бреснахана (BBB) для оценки послеоперационного поведения.
    Шкала оценки BBB является золотым стандартом (Таблица 1), используемым для оценки функции, связанной со спинным мозгом, у крыс. Он оценивает движения крыс в соответствии с баллами от 0 (движение задних конечностей не наблюдалось) до 21 (координация походки, равномерность пространства между пальцами ног, параллельность основного когтя во всей осанке, постоянная стабильность туловища и постоянное поднятие хвоста).

6. Тест на прочность хвата

  1. Используйте электронный измеритель прочности хвата для измерения прочности хвата.
  2. Возьмитесь за нижнюю половину крысы, чтобы подвешивать крысу, и позвольте ей схватиться за металлический стержень измерителя передней рукоятки.
  3. Когда крыса возьмет металлический стержень, оттяните его и запишите силу хвата.
  4. Измерьте силу хвата три раза для каждой крысы и запишите наибольшее количество очков.

7. Испытание наклонной плиты

  1. Поместите крысу на резиновую пластину с регулируемым углом наклона.
  2. Каждый раз постепенно увеличивайте угол наклона пластины на 5°, пока крыса не сможет уравновеситься и твердо стоять в течение 5 секунд.
  3. Запишите максимальный угол, под которым крыса может балансировать на наклонной пластине.
  4. Измерьте максимальный угол три раза для каждой крысы и запишите наибольшее количество очков.

8. Эвтаназия, отделение спинного мозга и замораживание

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что на вас надеты соответствующие очки для глаз и лицевой щиток/маска для защиты глаз, лица и дыхательных путей от параформальдегида и газа формальдегида.

  1. Введите эквивалент 10% хлораллгидрата внутрибрюшинно, чтобы обезболить крыс, прежде чем открыть грудину, чтобы обнажить сердце.
  2. Введите перфузионную иглу в верхушку сердца, зафиксируйте ее гемостатическими щипцами и медленно влите обычный физиологический раствор.
  3. Просверлите отверстие в правом придатке предсердия до тех пор, пока из правого предсердия не вытечет чистый нормальный физиологический раствор, свидетельствующий об успешной инфузии.
  4. Прекратите нормальную перфузию физиологическим раствором после того, как печень побелеет.
  5. Вводите эквивалент 10% параформальдегида до тех пор, пока тело крысы не станет жестким.
  6. После перфузии параформальдегида удалить кожу, мышцы и мягкие ткани вокруг позвоночника; отделить сегмент С2-С7 шейного отдела позвоночника; и погрузите его в 10% параформальдегид для фиксации на ночь.
  7. Отделите шейный отдел спинного мозга от позвоночника и поместите его в градиент концентрации 10%, 20% и 30% растворов сахарозы для постепенного обезвоживания.
  8. Перенесите сжатый спинной мозг высотой 2 мм вместе с агентом для встраивания ОКТ в морозильную камеру при температуре -80 °C.
  9. После срезов на срезы толщиной 7 мкм и окрашивания (окрашивание H&E и мечение dUTP nick end labeling (TUNEL)/ядра нейронов (NeuN), см. раздел 9) наблюдайте за гистопатологией спинного мозга и апоптоза нейронов соответственно.

9. Иммуноокрашивание TUNEL/NeuN

  1. Погрузите участки спинного мозга в фосфатно-солевой буфер (PBS) на 10 мин при комнатной температуре, затем заблокируйте раствором PBS, содержащим 0,3% Triton X-100 и 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) на 1 ч.
  2. Инкубируйте отделы спинного мозга с кроличьим поликлональным антителом против NeuN (разбавленным 1:200;) в течение ночи при 4 °C.
  3. Трижды промыть участки спинного мозга в PBS. Затем инкубировать с конъюгированными с Alexa Fluor 594-конъюгированными вторичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре.
  4. Выполните одноэтапный набор для анализа апоптоза TUNEL (зеленая флуоресценция) для окрашивания апоптотических ядер отделов спинного мозга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Компрессионная травма спинного мозга может привести к нервно-мышечной инвалидности конечностей
По мере того, как гидрогелевая деталь постепенно расширяется, она настойчиво сжимает область спинного мозга в течение длительного периода времени, что имитирует инвалидность передних конечностей, вызванную заболеваниями шейного отдела спинного мозга 8,10. В текущей модели значительная ипсилатеральная контрактура передней лапы наблюдалась у большинств...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Целью этой хирургической процедуры было создание воспроизводимого, пролонгированного нейронного апоптоза в спинном мозге крысы. Ключевым преимуществом данной модели является то, что расширяемые гидрогелевые имплантаты обеспечивают длительную компрессию спинного мозга, тем самым приводя к прогрессирующему нейронному апоптотическому ответу (рис. 2С), что согласуется с патологическим процессом ХСМ. В данном исследовании смертность от травм спинного мозга была к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов для раскрытия и заявляют, что нет никаких ограничений на полный доступ ко всем материалам, использованным в данном исследовании.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2018YFC1704300), Национальным фондом естественных наук Китая (81930116, 81804115, 81873317 и 81704096), Шанхайской парусной программой (18YF1423800), Фондом естественных наук Шанхая (20ZR1473400). Этот проект также был поддержан Шанхайским университетом традиционной китайской медицины (2019LK057).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Мазь с антибиотикомПрофилактика раневой инфекции
Бупренорфин-SRОбезболивающее
ИзофлуранVeteasyАнестезия
Ингалянтное оборудование дляАнестезия
Микроофтальмические щипцыMingren медицинское оборудованиеДлина: 11 см, Диаметр головы: 0,3 ммЗажим для мышц
Офтальмологические щипцыShanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Фабрика хирургических инструментовJD1050Clip the skin
Офтальмологические ножницы (10 см)Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Фабрика хирургических инструментовY00030Разрез кожи
SD самцы крысShanghai SLAC Laboratory Animal Co., LtdSCXK2018-0004Животная модель
Стерильные хирургические лезвия (22#)Шанхай Пудун Цзиньхуань Медикал Продактс Ко., Лтд.35T0707Разрез мышц
ТриммерЭпиляция
Крем для эпиляции Veet RECKITTBENCKISER (India) LtdЭпиляция
Ножницы VenusМедицинское оборудованиеMingren Длина: 12,5 смРазрез мышц
анестезии для мелких животных

Ссылки

  1. Lebl, D. R., Bono, C. M. Update on the diagnosis and management of cervical spondylotic myelopathy. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 23 (11), 648-660 (2015).
  2. Haddas, R., et al. Spine and lower extremity kinematics during gait in patients with cervical spondylotic myelopathy. The Spine Journal. 18 (9), 1645-1652 (2018).
  3. Song, D. W., Wu, Y. D., Tian, D. D. Association of Vdr-Foki and Vdbp-Thr420 Lys polymorphisms with cervical spondylotic myelopathy: A case-control study in the population of China. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (2), 22669(2019).
  4. Kurokawa, R., Murata, H., Ogino, M., Ueki, K., Kim, P. Altered blood flow distribution in the rat spinal cord under chronic compression. Spine. 36 (13), 1006-1009 (2011).
  5. Wen, C. Y., et al. Is Diffusion anisotropy a biomarker for disease severity and surgical prognosis of cervical spondylotic myelopathy. Radiology. 270 (1), 197-204 (2014).
  6. Long, H. Q., Li, G. S., Hu, Y., Wen, C. Y., Xie, W. H. Hif-1A/Vegf signaling pathway may play a dual role in secondary pathogenesis of cervical myelopathy. Medical Hypotheses. 79 (1), 82-84 (2012).
  7. Karadimas, S. K., Erwin, W. M., Ely, C. G., Dettori, J. R., Fehlings, M. G. Pathophysiology and natural history of cervical spondylotic myelopathy. Spine. 38, 21-36 (2013).
  8. Wilson, J. R., et al. State of the art in degenerative cervical myelopathy: an update on current clinical evidence. Neurosurgery. 80, 33-45 (2017).
  9. Baptiste, D. C., Fehlings, M. G. Pathophysiology of cervical myelopathy. The spine Journal. 6, 190-197 (2006).
  10. Wilcox, J. T., et al. Generating level-dependent models of cervical and thoracic spinal cord injury: exploring the interplay of neuroanatomy, physiology, and function. Neurobiology of Disease. 105, 194-212 (2017).
  11. Takano, M., et al. Inflammatory cascades mediate synapse elimination in spinal cord compression. Journal of Neuroinflammation. 11, 40(2014).
  12. Hu, Y., et al. Somatosensory-evoked potentials as an indicator for the extent of ultrastructural damage of the spinal cord after chronic compressive injuries in a rat model. Clinical Neurophysiology. 122 (7), 1440-1447 (2011).
  13. Yang, T., et al. Inflammation level after decompression surgery for a rat model of chronic severe spinal cord compression and effects on ischemia-reperfusion injury. Neurologia Medico-Chirurgica. 55 (7), 578-586 (2015).
  14. Ijima, Y., et al. Experimental rat model for cervical compressive myelopathy. Neuroreport. 28 (18), 1239-1245 (2017).
  15. Yamamoto, S., Kurokawa, R., Kim, P. Cilostazol, a selective type iii phosphodiesterase inhibitor: prevention of cervical myelopathy in a rat chronic compression model. Journal of Neurosurgery. Spine. 20 (1), 93-101 (2014).
  16. Holly, L. T., et al. Dietary therapy to promote neuroprotection in chronic spinal cord injury. Journal of Neurosurgery. Spine. 17 (2), 134-140 (2012).
  17. Zhao, P., et al. In vivo diffusion tensor imaging of chronic spinal cord compression: a rat model with special attention to the conus medullaris. Acta Radiologica. 57 (12), 1531-1539 (2016).
  18. Kurokawa, R., Nagayama, E., Murata, H., Kim, P. Limaprost alfadex, a prostaglandin E1 derivative, prevents deterioration of forced exercise capability in rats with chronic compression of the spinal cord. Spine. 36 (11), 865-869 (2011).
  19. Lee, J., Satkunendrarajah, K., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel rat model of cervical spondylotic myelopathy: the impact of chronic cord compression on clinical, neuroanatomical, and neurophysiological outcomes. Journal of Neurotrauma. 29 (5), 1012-1027 (2012).
  20. Chen, B., et al. Reactivation of dormant relay pathways in injured spinal cord by Kcc2 manipulations. Cell. 174 (3), 521-535 (2018).
  21. Yu, W. R., Liu, T., Kiehl, T. R., Fehlings, M. G. Human neuropathological and animal model evidence supporting a role for Fas-mediated apoptosis and inflammation in cervical spondylotic myelopathy. Brain. 134, 1277-1292 (2011).
  22. Yu, W. R., et al. Molecular mechanisms of spinal cord dysfunction and cell death in the spinal hyperostotic mouse: implications for the pathophysiology of human cervical spondylotic myelopathy. Neurobiology of Disease. 33 (2), 149-163 (2009).
  23. Iyer, A., Azad, T. D., Tharin, S. Cervical spondylotic myelopathy. Clinical Spine Surgery. 29 (10), 408-414 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.