Методическая статья

Иммунофлюоресцентная маркировка белков вирусов растений и насекомых-векторов в полужесткокрылых кишках

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62605

⸱

14 мая 2021 г.

 ,  , 
1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол иммунофлуоресцентной маркировки как белков растительных вирусов, так и белков-векторов насекомых в иссеченных кишках насекомых может быть использован для изучения взаимодействий между вирусными и насекомыми-переносчиками, функций белков насекомых и молекулярных механизмов, лежащих в основе передачи вируса.

Аннотация

Большинство вирусов растений в природе передаются от одного растения к другому полужесткокрылыми насекомыми. Высокая плотность популяции насекомых-переносчиков, которые очень эффективны при передаче вируса, играет ключевую роль в вирусных эпидемиях на полях. Изучение взаимодействия вирусов и насекомых-переносчиков может способствовать нашему пониманию передачи вирусов и эпидемий с целью разработки новых стратегий борьбы с вирусами растений и их насекомыми-переносчиками. Иммунофлуоресцентная маркировка широко используется для анализа взаимодействия между патогенами и хозяевами и используется здесь у белоспинного кузнечика (WBPH, Sogatella furcifera), который эффективно передает южный вирус черного карлика риса (SRBSDV, род Fijivirus, семейство Reoviridae), чтобы найти вирионы и белки насекомых в эпителиальных клетках средней кишки. С помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии изучены морфологические характеристики эпителиальных клеток средней кишки, клеточная локализация белков насекомых, колокализация вирионов и белка насекомого. Этот протокол может быть использован для изучения активности вирусов у насекомых, функций белков насекомых и взаимодействия между вирусом и насекомым-переносчиком.

Введение

Большинство описанных вирусов растений передаются насекомыми из отряда Hemiptera, который включает тлю, белокрылку, цикадку, кузнечиков и трипсов 1,2. Колюще-сосущий ротовой аппарат полужесткокрылых насекомых прокалывает растительную ткань для питания и выделения слюны, одновременно эффективно передавая вирус2. Описаны различные механизмы передачи вирусов растений насекомыми-переносчиками. К ним относятся нестойкие, полуперсистирующие и персистирующие. Персистирующий тип является либо неразмножающимся, либо размножающимся3,4, но для обоих этих типов передаваемый вирус должен перемещаться по всему телу насекомого. При персистирующе-размножении вирусы сначала заражают и размножаются в эпителиальных клетках кишечника насекомого, затем распространяются в различные ткани и, в конечном итоге, в слюнные железы, откуда затем могут быть введены в растение через слюну во время кормления насекомого 5,6. Персистирующие передаваемые вирусы перемещаются через разные органы и размножаются в своих насекомых-переносчиках, что требует специфических взаимодействий между компонентами вируса и вектора на разных стадиях 7,8.

Вирусные белки и белки насекомых должны взаимодействовать, чтобы облегчить критические процессы распознавания, заражения, репликации или распространения вирусов у насекомых-переносчиков 9,10. Хотя оптическая микроскопия может быть использована для наблюдения клеточных структур у насекомых, она не может показать распределение вирионов, клеточную локализацию или колокализацию вирусных белков и белка насекомых или ультраструктуру тканей и клеток насекомых. Иммунофлюоресцентное мечение было впервые выполнено Coons et al. в фагоцитарных клетках мыши посредством мечения специфических флуоресцеиновых антител, а теперь оно широко используется11. Метод иммунофлуоресценции, также известный как метод флуоресцентных антител, является одним из самых ранних разработанных методов иммунологической маркировки и основан на специфической реакции связывания между антигеном и антителом11,12. Известное антитело сначала мечают флуоресцеином, который используется в качестве зонда для обнаружения соответствующих антигенов в клетках или тканях13,14. После того, как меченное флуоресцеином антитело связывается с соответствующим антигеном в клетках или тканях, зонд будет излучать яркую флуоресценцию при облучении длинами волн возбуждения и просмотре с помощью флуоресцентного микроскопа для локализации антигена15.

Большинство насекомых-переносчиков вирусов растений являются полужесткокрылыми. Более высокая плотность популяции насекомых-переносчиков, обладающих высокой эффективностью передачи вируса растений, может привести к вирусным эпидемиям5. Южный вирус черного карликового риса (SRBSDV, род Fijivirus, семейство Reoviridae), один из самых серьезных патогенов риса, быстро распространился по районам выращивания риса в Восточной и Юго-Восточной Азии и вызвал серьезные потери урожая с 2010 года16,17. Взрослые особи и нимфы белоспинного кузнечика (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) передают SRBSDV рису стойким способом размножения с высокой эффективностью. Полевые исследования показали, что вспышки SRBSDV-индуцированной болезни карликов риса с черными полосами обычно совпадают с массовой миграцией WBPH на большие расстояния, что является решающим фактором эпидемий SRBSDV 7,8,18. Везикул-ассоциированный мембранный белок 7 (VAMP7) представляет собой растворимый рецептор белка прикрепления N-этилмалеимида, чувствительного к фактору присоединения (SNARE), который может опосредовать транспорт веществ посредством слияния везикул. VAMP7 взаимодействует с внешним основным капсидным белком SRBSDV in vitro, что указывает на то, что VAMP7 может быть тесно связан с передачей вируса16.

В протоколе, представленном здесь, мы исключили кишечник из вирулиферного WBPH в качестве примера для маркировки вирионов SRBSDV и VAMP7 в эпителиальных клетках средней кишки16. Эпителий средней кишки, как начальное место инвазии вируса, играет жизненно важную роль в заражении, репликации и передаче вируса. Во-первых, мы подробно описали шаги по удалению кишечника у нимф и взрослых особей WBPH. Во-вторых, мы использовали специфические антитела, меченные флуоресцеином, для маркировки вирионов SRBSDV и VAMP7 в эпителиальных клетках кишечника. Затем мы наблюдали эпителиальные клетки и клеточное расположение вирионов и VAMP7 с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Результаты показали, что вирионы SRBSDV и VAMP7 могут колокализоваться в цитоплазме эпителиальных клеток средней кишки, предполагая, что специфическая функция VAMP7 может быть связана с распространением вирионов из эпителиальных клеток средней кишки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Выращивание невирулиферных насекомых

  1. Соберите WBPH с рисовых полей и вырастите вместе с рассадой риса в стеклянных стаканах объемом 1 л, покрытых сеткой от насекомых, в инкубаторе при температуре 28 ° C при 16 ч света и 8 ч темноты. Поскольку SRBSDV не передается через яйца, только что вылупившиеся нимфы не являются вирулентными.
  2. С помощью ручки-кисти аккуратно смахивайте насекомых из стакана, выращивающего насекомых, в новый стакан со свежими проростками риса каждую неделю, пока нимфы WBPH не вылупятся. Продолжайте выращивать этих вылупившихся невирулиферных нимф до 2- или 3-летнего возраста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно чистите зубы, чтобы не вылететь из стакана и не повредить его.

2. Заражение вирусом и сбор вируленосных насекомых

  1. Перенесите невирусных насекомых из стеклянных стаканов на свежие рисовые растения, зараженные SRBSDV, покрытые сеткой, защищенной от насекомых, в течение 2-дневного периода доступа к приобретению вируса (AAP), питаясь растениями. Затем соберите насекомых в стеклянные стаканы со свежими проростками риса.
  2. Через 2 дня соберите насекомых из стеклянных стаканов с помощью ручного аспиратора для вскрытия и иссечения кишечника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный AAP SRBSDV составляет 5 минут как для нимф WBPH, так и для взрослых особей, но насекомым следует позволить питаться свежими растениями риса, зараженными SRBSDV, в течение 2 дней для достижения эффективности захвата до 80%.

3. Приготовление реагентов

  1. Растворяют 8,5 г NaCl, 3,5 г Na2 HPO4·12H2 O и 0,25 г 2PO4 в 1 мл ddH2O для приготовления0,01 М раствора фосфатно-солевого буфера (PBS).
  2. Добавьте 4 г параформальдегида к 100 мл PBS, чтобы получить 4% (м/об) параформальдегида в PBS.
  3. Добавьте 2 мл Triton X-100 в 98 мл PBS, чтобы получить 2% (об. / об.) Triton X-100.

4. Вскрытие взрослых особей и иссечение кишок

  1. С помощью пипетки поместите 100 мкл PBS на предметное стекло. Поместите предметное стекло на столик оптического микроскопа.
  2. Соберите взрослых особей, инфицированных SRBSDV, из стеклянных стаканов с помощью ручного аспиратора и поместите их в пробирки объемом 1,5 мл. Поместите пробирки на лед, чтобы парализовать насекомых, а затем перенесите парализованную взрослую особь в 100 мкл PBS на предметном стекле животом вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Насекомые будут полностью парализованы через 5 минут на льду.
  3. Используйте пинцет в одной руке, чтобы зажать тело, а затем удалите головку другим набором пинцетов в другой руке.
  4. Зажмите бока брюшка одним набором пинцета и зажмите яйцеклад или копулятивный орган хвоста другим набором. Затем осторожно оттяните межсегментарную оболочку одного брюшного сегмента и медленно обнажите кишку в брюшной полости.
  5. Продолжайте отрывать оболочку и постепенно вытаскивайте всю кишку из брюшной полости. Осторожно оттяните хвост, который соединен с концом кишки, чтобы удалить всю кишку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тяните очень осторожно, иначе кишечник будет поврежден.
  6. Поместите иссеченные кишки в центрифужную пробирку объемом 200 мкл, добавьте в пробирку 200 мкл PBS и осторожно отсосите и выпустите раствор пипеткой, чтобы тщательно промыть кишки.

5. Вскрытие нимф и иссечение кишок

ПРИМЕЧАНИЕ: Тела нимф более хрупкие, чем тела взрослых, и кишечник легко повреждается, когда его вытаскивают из хвоста. Поэтому самый надежный способ иссечь кишку нимфы — вытащить из головы.

  1. С помощью пипетки поместите 100 мкл PBS на предметное стекло. Поместите предметное стекло на столик оптического микроскопа.
  2. Соберите нимф, инфицированных SRBSDV, из стеклянных стаканов с помощью ручного аспиратора и поместите их в пробирки объемом 1,5 мл. Поместите трубки на лед, чтобы парализовать насекомых. Затем перенесите парализованную нимфу в буфер объемом 100 мкл на предметном стекле животом вверх.
  3. Используйте пинцет, чтобы отсоединить хвост нимфы. Затем зажмите тело насекомого, чтобы аккуратно зафиксировать, и используйте другой набор, чтобы зажать голову. Осторожно оттяните голову от тела, сохраняя при этом ее прикрепление к кишечнику, чтобы голова была отделена от тела, но кишка все еще была прикреплена к грудной клетке и животу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После отрыва головки жировое тело нимфы будет вытекать, делая PBS мутным. Удалите мутный раствор PBS и замените его 100 мкл свежего PBS.
  4. Пока пинцет все еще зажимает тело, используйте другой набор, чтобы осторожно двигать головкой и постепенно вытаскивать кишку.
  5. Аккуратно отделите кишку от головы пинцетом и в конечном итоге получите неповрежденную кишку, не повреждая тело кузнечика.
  6. Поместите иссеченные кишки в центрифужную пробирку объемом 200 мкл, добавьте в пробирку 200 мкл PBS и осторожно отсосите и выпустите раствор пипеткой, чтобы тщательно промыть кишки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иссеченные кишки должны быть хорошо очищены с помощью PBS, чтобы удалить любые загрязняющие жировые тела из брюшной полости; Они могут мешать протоколу окрашивания.

6. Протоколы маркировки вирионов SRBSDV и белка насекомых

  1. Подготовьте антитела и монтажную среду, используемые в этом анализе. Антитела представляют собой антитела против SRBSDV, меченные Dylight 549 (красный) против вирионов SRBSDV 18, антитела против VAMP7, меченные Dylight 488 (зеленый) против белка насекомых VAMP716,19, фаллоидин Dylight 633 (синий) и монтажную среду, содержащую 4,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI, синий).
  2. Немедленно поместите свежеиссеченные и промытые PBS кишки WBPH в 100 мкл 4% (м/об) параформальдегида в центрифужную пробирку объемом 200 мкл и держите в течение 2 часов при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свежеиссеченные кишки WBPH не следует замачивать в PBS в течение более длительного времени, иначе эпителиальные клетки будут повреждены.
  3. Удалите 4% (м/об) параформальдегида с помощью пипеттора, а затем добавьте 200 мкл PBS в центрифужную пробирку объемом 200 мкл. Через 10 минут удалите PBS с помощью пипетки, чтобы удалить параформальдегид.
  4. Повторите этот шаг стирки PBS дважды.
  5. Удалите PBS и добавьте 200 мкл неионогенного моющего средства Triton X-100 (2%, об. / об.). Погрузите образцы в неионогенное моющее средство в течение 30 минут при комнатной температуре.
  6. Удалите 2% (об./об.) Triton X-100 с помощью пипеттора, а затем смойте остатки моющего средства тремя 10-минутными стирками с 200 мкл PBS (см. шаги 6.3 и 6.4).
  7. Разбавленные антитела против SRBSDV, меченные Dylight 549 (красный), и антитела против VAMP7, меченные Dylight 488 (зеленый) 1:50 50 мкл альбумина бычьей сыворотки (3%, м/об.).
  8. Добавьте разбавленные антитела в пробирку и инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 4 ° C.
  9. Удалите разбавитель антител пипеттором, а затем смойте оставшийся разбавитель антител тремя 10-минутными промывками 200 мкл PBS.
  10. Разбавьте 1 мкл фаллоидина Dylight 633 50 мкл PBS.
  11. Добавьте 50 мкл разбавленного фаллоидина в пробирку и инкубируйте образцы в течение 2 ч при комнатной температуре.
  12. Удалите разбавитель фаллоидина с помощью пипеттора, а затем смойте остатки фаллоидина тремя 10-минутными промывками 200 мкл PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательная промывка имеет решающее значение для уменьшения фона и неспецифического связывания.
  13. Поместите каплю монтажной среды, содержащей DAPI, на предметное стекло микроскопа и перенесите кишки на носитель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно разверните каждую кишку пинцетом и избегайте образования пузырьков. На одном слайде около 15 кишок.
  14. Аккуратно накройте образцы покровным стеклом, не образуя пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предметное стекло следует держать при температуре 4 ° C в темноте, чтобы ингибировать гашение флуоресценции перед наблюдением с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа.
  15. Просмотрите все образцы с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Захватите изображения с помощью синего света и сохраните файлы на компьютере.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 показаны все этапы этого протокола: выращивание насекомых, приобретение вируса, иссечение кишечника, иммунофлуоресцентная маркировка и изготовление слайда.

Иссеченные кишки WBPH взрослых людей фиксировали в 4% (м/об) параформальдегиде, пермеабилизировали 2% (об./об.) Triton X-100, а затем инкубировали с фаллоидином Dylight 63310,18. Конфокальная микрофотография лазерного сканирования на

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для достижения наилучших результатов следует учитывать несколько ключевых моментов. Во-первых, необходимо высокое соотношение вирулентных насекомых от общей численности населения. Несмотря на то, что минимальный AAP для SRBSDV нимфами и взрослыми особями WBPH составляет 5 мин17, насекомым следует позволить питаться свежими растениями риса, зараженными SRBSDV, в течение 2 дней для достижения эффективности захвата до 80%. Поскольку вирионы SRBSDV могут быть обнаружены в 80% средней кишки

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (31630058 по X.W. и 31772134 по W.L.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3% Бычий сывороточный альбумин (БСА)CoolaberSL1331Разбавленные антитела
Покровное стеклоSolarbioYA0771-18*18mmДля изготовления предметных стекол
Препарирующий микроскопBeitjaXTL-7045B1Для препарирования насекомых
Лазерный сканирующий конфокальный микроскопZeissZeiss LSM880Наблюдение за сигналом флуоресценции Предметные
стекла микроскопаSolarbioZBP-7105Для изготовления слайдов
Монтажная среда с 4'6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI)AbcamAB104139Label cell necleus
Параформальдегид Sigma158127Для фиксации тканей
Фаллоидин  InvitrogenA22284Label actin эпитиелей средней кишки
Triton X-100Amresco0290C484Для проникновения в ткани
Пинцет (5-SA)AsOne6-7905-40Для вскрытия насекомых

Ссылки

  1. Nault, L. R. Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis. Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).
  2. Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens. Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).
  3. Gautam, S., et al. Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics. Virus Research. 286, 198069(2020).
  4. Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
  5. Hogenhout, S. A., et al. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  6. Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. Insect vector-mediated transmission of plant viruses. Virology. 479, 278-289 (2015).
  7. Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics. Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).
  8. Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses. Frontiers in Microbiology. 12, 628262(2021).
  9. Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects. Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).
  10. Qin, F., et al. Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector. PLOS Pathogens. 14, 1007201(2018).
  11. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).
  12. Barnard, G. The development of fluorescence immunoassays. Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).
  13. Wang, W., et al. The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication. eLife. 6, 26591(2017).
  14. Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909(2018).
  15. Zhang, Y., et al. TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728(2020).
  16. Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus. Scientific Reports. 6, 32445(2016).
  17. Pu, L., et al. Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers. Crop Protection. 41, 71-76 (2012).
  18. Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus. Virus Research. 167, 404-408 (2012).
  19. Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli. Plant Protection. 47, 55-60 (2021).
  20. Ammar, E. D. Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. Nault, L. R., Rodriquez, J. G. , Wiley. New York. 1(1985).
  21. Tsai, J., Perrier, J. L. Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae). Fla Entomology. 79, 563(1996).
  22. Wei, T., Li, Y. Rice reoviruses in insect vectors. Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).
  23. Kruse, A., et al. Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut. PLoS ONE. 12, 0179531(2017).
  24. Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts. Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).
  25. King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13, 8(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи