Method Article

Визуализация и количественная оценка сигнализации TGFβ/BMP/SMAD в различных условиях напряжения сдвига жидкости с использованием бесконтактного лигирования

DOI:

10.3791/62608

⸱

September 14th, 2021

 ,  , 
1Institute for Chemistry and Biochemistry, Freie Universität Berlin, 2International Max-Planck Research School for Biology and Computation

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы устанавливаем протокол для одновременной визуализации и анализа нескольких комплексов SMAD с использованием анализа бесконтактной перевязки (PLA) в эндотелиальных клетках, подверженных патологическим и физиологическим условиям сдвига жидкости.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трансформирующий фактор роста β (TGFβ)/Костной морфогенетический белок (BMP) передачи сигналов жестко регулируется и сбалансирован во время развития и гомеостаза сосудистой системы Поэтому дерегуляция в этом сигнальном пути приводит к тяжелым сосудистым патологиям, таким как гипертония легочной артерии, наследственная геморрагическая телеангиэктазия и атеросклероз. Эндотелиальные клетки (ЭК), как самый внутренний слой кровеносных сосудов, постоянно подвергаются воздействию напряжения сдвига жидкости (SS). Было показано, что аномальные паттерны жидких SS усиливают передачу сигналов TGFβ / BMP, которые вместе с другими стимулами индуцируют атерогенез. В связи с этим было обнаружено, что атеропрон, низкий ламинарный SS усиливает передачу сигналов TGFβ / BMP, в то время как атеропротекторный, с высоким ламинарной SS уменьшает эту сигнализацию. Для эффективного анализа активации этих путей мы разработали рабочий процесс для исследования образования комплексов транскрипционного фактора в условиях низкого ламинарного SS и высокого ламинарного SS с использованием коммерчески доступной пневматической насосной системы и анализа бесконтактного лигирования (PLA).

Активная TGFβ/BMP-сигнализация требует формирования тримерных SMAD-комплексов, состоящих из двух регуляторных SMAD (R-SMAD); SMAD2/3 и SMAD1/5/8 для сигнализации TGFβ и BMP соответственно) с общим медиатором SMAD (co-SMAD; СМАД4). Используя PLA, нацеленную на различные субъединицы тримерного SMAD-комплекса, т.е. либо R-SMAD/co-SMAD, либо R-SMAD/R-SMAD, образование активных комплексов факторов транскрипции SMAD может быть измерено количественно и пространственно с помощью флуоресцентной микроскопии.

Использование проточных слайдов с 6 небольшими параллельными каналами, которые могут быть соединены последовательно, позволяет исследовать формирование комплекса транскрипционного фактора и включать необходимые элементы управления.

Рабочий процесс, описанный здесь, может быть легко адаптирован для исследований, направленных на близость SMAD к другим факторам транскрипции или к комплексам факторов транскрипции, отличным от SMAD, в различных условиях жидкого SS. Рабочий процесс, представленный здесь, показывает быстрый и эффективный способ изучения жидкостной SS-индуцированной сигнализации TGFβ /BMP в EC, как количественно, так и пространственно.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белки трансформирующего фактора роста бета (TGFβ) суперсемейства являются плейотропными цитокинами с различными членами, включая TGFβs, костные морфогенетические белки (BMP) и активины1,2. Связывание лигандов индуцирует образование рецепторных олигомеров, приводящих к фосфорилированию и, тем самым, активации цитозольного регулятора SMAD (R-SMAD). В зависимости от подсемейства лигандов активируются различные R-SMAD1,2. В то время как TGFβs и активины в основном индуцируют фосфорилирование SMAD2/3, BMP индуцируют фосфорилирование SMAD1/5/8. Тем не менее, накапливаются доказательства того, что BMP и TGFβs/Activins также активируют R-SMAD соответствующих других подсемейств в процессе, называемом «боковой сигнализацией»3,4,5,6,7,8, и что существуют смешанные комплексы SMAD, состоящие как из SMAD1/5, так и из SMAD2/3, членов3,9 . Два активированных R-SMAD впоследствии образуют тримерные комплексы с общим медиатором SMAD4. Эти комплексы транскрипционных факторов затем способны транслоцироваться в ядро и регулировать транскрипцию генов-мишеней. SMAD могут взаимодействовать с различными транскрипционными коактиваторами и ко-репрессорами, что приводит к диверсификации возможностей регулирования генов-мишеней10. Дерегулирование передачи сигналов SMAD имеет серьезные последствия при различных заболеваниях. В соответствии с этим, несбалансированная передача сигналов TGFβ / BMP может привести к тяжелым сосудистым патологиям, таким как гипертония легочной артерии, наследственная геморрагическая телеангиэктазия или атеросклероз3,11,12,13,14.

Эндотелиальные клетки (ЭК) образуют самый внутренний слой кровеносных сосудов и, следовательно, подвергаются напряжению сдвига (SS), силе трения, оказываемой вязким потоком крови. Интересно, что ЭК, находящиеся в частях сосудистой системы, которые подвергаются воздействию высоких уровней однородных, ламинаров СС, содержатся в гомеостатическом и спокойном состоянии. Напротив, ЭК, которые испытывают низкий, неоднородный SS, например, при бифуркациях или меньшем искривлении дуги аорты, являются пролиферативными и активируют воспалительные пути15. В свою очередь, участки дисфункциональных ЭК склонны к развитию атеросклероза. Интересно, что EC в этих атеропроновых областях демонстрируют аберрантно высокие уровни активированных SMAD2/3 и SMAD1/516,17,18. В этом контексте было обнаружено, что усиленная передача сигналов TGFβ/BMP является ранним событием в развитии атеросклеротических поражений19, и было обнаружено, что интерференция передачи сигналов BMP заметно снижает воспаление сосудов, образование атеромы и связанное с этим кальцификацию20.

Анализ бесконтактного лигирования (PLA) является биохимическим методом для изучения белково-белковых взаимодействий in situ21,22. Он опирается на специфичность антител различных видов, которые могут связывать интересующие белки-мишени, что позволяет высокоспецифично обнаруживать эндогенные белковые взаимодействия на уровне одной клетки. Здесь первичные антитела должны связываться со своим целевым эпитопом на расстоянии менее 40 нм, чтобы обеспечить обнаружение23. Таким образом, PLA очень полезен по сравнению с традиционными подходами коиммунопреципитации, где для обнаружения эндогенных белковых взаимодействий требуется несколько миллионов клеток. В PLA видоспецифические вторичные антитела, ковалентно связанные с фрагментами ДНК (называемые зондами Plus и Minus), связывают первичные антитела, и если интересующие белки взаимодействуют, зонды Plus и Minus находятся в непосредственной близости. ДНК перевязывается на следующем этапе, и становится возможным амплификация круговой ДНК. Во время амплификации флуоресцентно меченые комплементарные олигонуклеотиды связываются с синтезированной ДНК, что позволяет визуализировать эти белковые взаимодействия с помощью обычной флуоресцентной микроскопии.

Описанный здесь протокол позволяет ученым количественно сравнивать количество активных транскрипционных комплексов SMAD в условиях атеропротектора и атеропрона SS in vitro с использованием PLA. SS генерируется с помощью программируемой пневматической насосной системы, которая способна генерировать ламинарный однонаправленный поток определенных уровней и позволяет поэтапно увеличивать скорость потока. Этот метод позволяет обнаруживать взаимодействия между SMAD1/5 или SMAD2/3 с SMAD4, а также смешанными R-SMAD комплексами. Он может быть легко расширен для анализа взаимодействий SMAD с транскрипционными сорегуляторами или для транскрипционных факторных комплексов, отличных от SMAD. На рисунке 1 показаны основные этапы протокола, представленные ниже.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Схематическое представление описанного протокола. (A) Ячейки, засеянные в 6-канальные слайды, подвергаются сдвиговому напряжению с помощью пневматической насосной системы. (B) Фиксированные ячейки используются для эксперимента PLA или для контрольных условий. (C) Изображения экспериментов PLA получаются с помощью флуоресцентного микроскопа и анализируются с помощью программного обеспечения для анализа ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Воздействие клеточной культуры и напряжения сдвига жидкости

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера для изучения взаимодействия SMAD, индуцированного SS, были использованы EC ВЕН человека (HUVECs). Протокол, описанный ниже, может быть применен к каждому типу ячеек, реагирующих на SS.

  1. Покрыть 6-канальный слайд 0,1% желатином свиной кожи в PBS в течение 30 мин при 37 °C.
  2. Семена HUVECs в предварительно покрытых 6-канальных слайдах при плотности 2,5 x 106 клеток на мл в 30 мкл полной среды M199.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации о том, как засеять ячейки на слайде потока, см. ссылку24.
  3. Дайте клеткам прилипнуть в течение 1 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе.
  4. Добавьте 60 мкл предварительно нагретой полной среды M199 в каждый из резервуаров.
  5. Культивировать в течение 2 дней, с мягким средним обменом один раз в день, при 37 °C в увлажненном инкубаторе.
    1. Аспирировать резервуары полностью, добавить 120 мкл предварительно нагретой полной среды M199 в один из резервуаров и аспирировать с другой стороны.
    2. Добавьте 60 мкл предварительно нагретой полной среды M199 в оба резервуара.
  6. Соберите и запустите настройку потока, как описано в ссылке 25.
    1. Монтаж НКТ на жидкостных агрегатах. Здесь силиконовые трубки диаметром 0,8 мм и 1,6 мм используются для применения напряжения сдвига 1 дин/см2 и 30 дин/см2 соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Материал и длина трубки должны оставаться постоянными, так как изменения могут влиять на возникающее напряжение сдвига. В общем, можно использовать другие комбинации насосных систем и трубок, если известно результирующее напряжение сдвига, и насос создает устойчивый ламинарный поток.
    2. Заполните резервуары соответствующим количеством предварительно нагретой полной среды M199 (минимум 10 мл).
    3. Подключите жидкостные блоки с трубкой к насосной системе и выполните предварительный запуск без ячеек, чтобы уравновесить среду и удалить оставшийся воздух25.
    4. Последовательно соединяйте одиночные каналы на 6-канальном затворе друг с другом с помощью трубки последовательного подключения. Первый и последний канал на слайде будут соединены с трубкой, собранной в 1.6.1 (схему см. на рисунке 1А ). Будьте осторожны, чтобы не вводить воздух в систему, так как это может серьезно повредить клетки. Дополнительную информацию о последовательном соединении можно найти в ссылке26.
    5. Для воздействия на клетки высоких уровней напряжения сдвига (>20 дин/см2) используют фазу рампы, т. е. увеличивают напряжение сдвига поэтапно с фазами адаптации. Ступени могут быть установлены с шагом 5 дин/см2 в течение 30 мин.

2. Фиксация

  1. Отсоедините слайды от насосов после воздействия жидкости SS. Используйте зажимы на трубке при отсоединении, чтобы избежать разлива среды в инкубаторе.
  2. Сразу же передача потока скользит по льду, в то время как оставшаяся трубка отсоединяется последовательно. При извлечении трубки из резервуаров резервуар с другой стороны следует держать закрытым пальцем, чтобы избежать улавливания пузырьков воздуха в канале. Это может помешать шагам фиксации.
  3. Удерживая клетки на льду, тщательно аспирируйте среду из резервуаров, но не из канала, где находятся клетки. Впоследствии промывку образцов холодной стерильной ПБС (4 °C) с трехкратным увеличением объема канала (90 мкл). Добавьте PBS в один резервуар и осторожно аспирируйте из другого резервуара. Повторите этот шаг в каждом из 6 каналов на слайд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех этапов промывки и инкубации соответствующий раствор добавляют в один из резервуаров, что приводит к обмену растворами в канале. Чтобы обеспечить полную замену растворов в канале, избыточный раствор затем аспирируется из другого резервуара. Раствор сверху клеток в канале не удаляется. Клетки не должны высыхать в любое время. Поэтому важно тщательно мыть без введения пузырьков воздуха в слайды.
  4. Зафиксируйте клетки, добавив 90 мкл буферного 4% раствора PFA в тот же резервуар, куда PBS был добавлен предварительно, и аналогичным образом аспирируйте жидкость из другого резервуара. Повторите этот шаг на каждом канале каждого слайда. После добавления раствора PFA перенесите образцы изо льда до комнатной температуры (RT) и инкубируйте в течение 20 мин.
    ВНИМАНИЕ: PFA токсичен и должен обрабатываться осторожно. Используйте перчатки и работайте под вытяжным капюшоном.
  5. Промывайте ячейки 3x pBS (RT), добавляя их в один резервуар и осторожно аспирируя из другого резервуара. Опустошите только водоемы, следя за тем, чтобы канал не пересыхал. Повторите этот шаг для каждого из 6 каналов на слайд.
  6. Погасить фиксацию ПФА путем добавления 90 мкл 50 мМ хлорида аммония в ПБС в одном из резервуаров. Аспирировать избыточный раствор из другого резервуара. Повторите для каждого канала на слайде. Инкубируйте образцы в течение 10 минут на RT.
  7. Промывайте, как описано в шаге 2.5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образцы могут храниться при температуре 4 °C в течение ночи, или протокол может быть немедленно продолжен с блокированием и первичной инкубацией антител (см. этап 3).

3. Блокирование и первичная инкубация антител

  1. Чтобы пропитать клетки, добавьте 90 мкл 0,3% Тритона-Х-100 в PBS в опорожненном резервуаре и аспират из другого резервуара для каждого канала. Инкубировать в течение 10 мин на РТ.
  2. Промывайте, как описано в шаге 2.5.
  3. Добавить 90 мкл стерильного блокирующего раствора PLA в один резервуар канала и аспирировать с другой стороны. Повторите этот шаг для каждого канала. Блок на 1 ч при 37 °С в увлажненной камере.
    1. Чтобы сделать увлажненную камеру, используйте 10-сантиметровую посуду с влажной тканью, запечатанную восковой пленкой, и поместите посуду в инкубатор. В качестве альтернативы могут использоваться другие форматы камер влажности, которые обеспечивают влажную атмосферу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, можно использовать самодельный блокирующий раствор (например, 3% (мас./об.) BSA в PBS, стерильный фильтрованный).
  4. Получают первичные антитела (1:100) в разбавителе антител PLA. Приготовьте 30 мкл раствора на канал. Добавьте оба первичных антитела одновременно и вихревые.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно может быть использован самодельный разбавитель антител (например, 1% (мас./об.) BSA в PBS). Антитела, используемые здесь, представляют собой комбинации SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 и фосфо-SMAD1/5-SMAD4. Подробную информацию можно найти в Таблице материалов.
  5. Перед применением первичных антител аспирируют блокирующий раствор из резервуаров, а также, осторожно, из русла. Пипетка 30 мкл раствора первичного антитела сразу же попадает в пустой канал путем наклона канала при добавлении раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняют удаление блокирующего раствора и добавление раствора антитела канал за каналом, чтобы клетки не пересыхали между ними.
  6. Инкубировать образцы с первичными антителами в течение ночи в увлажненных камерах при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация также может быть выполнена в течение 1 ч при комнатной температуре, если вы заинтересованы в продолжении следующих шагов в тот же день.

4. Инкубация зонда PLA

ПРИМЕЧАНИЕ: На всех этапах, указанных в разделах 4.1-7.3, моющие буферы А и В хранятся при температуре 4°С и должны быть нагреты до РТ перед использованием.

  1. Разбавляют PLA-зонды (+)-мыши и (-)-кролика до 1:5 в растворе разбавителя антител PLA (или 1% BSA). Приготовьте 30 мкл на канал.
  2. Промывайте образцы 2x в течение 5 мин, используя 90 мкл промывочного буфера A на RT, добавляя его в один из резервуаров и осторожно аспирируя из другого резервуара. Повторите этот шаг для каждого из 6 каналов на слайд.
  3. Тщательно аспирируйте промывочный буфер А и добавьте 30 мкл зондового раствора PLA (приготовленного на стадии 4.1), аналогично добавлению первичных антител на стадии 3.5.
  4. Инкубировать образцы в течение 1 ч при 37 °C в увлажненной камере.

5. Перевязка

  1. Промывайте образцы 2x в течение 5 мин, используя 90 мкл промывочного буфера A при RT, как описано в 4.2.
  2. Приготовьте разбавление лигационного буфера в 1:5 в деионизированной воде. Используйте этот буфер для разбавления фермента лигазы до 1:40 (на льду). Используйте 30 мкл на канал.
  3. Полностью аспирировать промывочный буфер А и добавить раствор для лигирования, как описано в 3.5.
  4. Инкубировать образцы в течение 30 мин при 37 °C в увлажненной камере.

6. Усиление

  1. Промывайте образцы 2x в течение 2 мин, используя 90 мкл промывочного буфера A при RT, как описано в 4.2.
  2. Подготовьте буфер амплификации, разбавив его 1:5 в деионизированной воде и используйте его для разбавления фермента полимеразы до 1:80 (на льду). Защита от света. Приготовьте 30 мкл на канал.
  3. Аспирировать промывочный буфер А полностью и сразу же добавить приготовленный амплификационный раствор в пустой канал, как описано в 3.5. Инкубировать образцы в течение 100 мин при 37 °C в увлажненной камере.

7. Монтаж

  1. Промывайте образцы 2x в течение 10 мин, используя 90 мкл wash Buffer B на RT, как описано в 4.2. Добавьте DAPI (1:500) из 1 мг/мл исходного раствора (в деионизированной воде) при первой промывке, чтобы окрасить ядра. Не сушите канал.
  2. Разбавьте промывочный буфер B в деионизированной воде (1:10) и промыть 1x 90 мкл 0,1x буферного раствора B, как описано в 4.2.
  3. Аспирировать промывочный буфер В полностью и сразу же добавить 2-3 капли жидкой монтажной среды в один резервуар. Распределите его по каналу, наклонив слайд. Храните образцы при температуре 4 °C во увлажненной среде до получения изображения.

8. Получение изображений

  1. Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа. Убедитесь, что соответствующие фильтры, устанавливающие флуоресцентные датчики PLA, доступны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно использовать конфокальный микроскоп, если это возможно, так как полученные пятна PLA более определены. Это также поддерживает дальнейшую обработку изображений и анализ данных.

9. Анализ и количественная оценка изображений с использованием ImageJ/FIJI

  1. Обрабатывайте экспортированные изображения (.tiff) с помощью программы обработки изображений, такой как ImageJ27.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все скрипты, используемые в этом исследовании и необходимые для автоматического подсчета клеточных, ядерных и всех событий PLA (на ячейку), можно найти в репозитории GitHub: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Выполняйте статистический анализ с помощью любой подходящей программы или инструмента.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ранее мы использовали PLA для обнаружения взаимодействий различных белков SMAD3 и анализировали изменения фосфорилирования SMAD28, вызванные напряжением сдвига28.

Здесь оба способа были объединены с протоколом, описанным выше. HUVEC подвергали сдвиговому напряжению 1 дин/см2 и 30 дин/см2 и анализировали на предмет взаимодействия факторов транскрипции SMAD. Показано, что по сравнению с высоким напряжением сдвига (30 дин/...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол на основе PLA, описанный здесь, предлагает эффективный способ определения непосредственной близости двух белков (например, их прямого взаимодействия) в ЭК, подверженных сдвиговому напряжению с количественным и пространственным разрешением. Используя проточные слайды с несколькими параллельными каналами, можно одновременно исследовать несколько различных белковых взаимодействий в клетках в одинаковых механических условиях. В отличие от этого, системы проточных камер, изготовленные на заказ, часто используют один ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим д-ра Марию Райхенбах и д-ра Кристиана Хипена за их поддержку в системе настройки потока, а также Элеонору Фокс и Юньюнь Сяо за критическое прочтение рукописи. P-L.M. финансировалась международной исследовательской школой Макса Планка IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). ПК получила финансирование от DFG-SFB1444. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
µ-Слайд VI 0.4Там же806066-канальный слайд
Хлорид аммонияКарл РотK298.1Гашение
бычьей сыворотки Альбумин Карл Рот8076.4Блокирование
DAPISigma Aldrich/ MerckD9542Окрашивание ДНК/ядер
DPBSPAN BiotechP04-53500PBS
Duolink In Реагенты для обнаружения на местеSigma Aldrich/MerckDUO92014набор PLA, содержащий лигазу, буфер лигирования, полимеразу и амплификационный буфер (с зелеными мечеными олигонуклеотидами)
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUSSigma Aldrich/ MerckDUO92004MINUS зонд
Duolink In Situ PLA Probe Anti-rabbit PLUSAldrich/ MerckDUO92002PLUS зонд
Duolink Буферы для промывки in situ, флуоресцентныеSigma Aldrich/MerckDUO82049PLA Промывочные буферы A и B Добавка
роста эндотелиальных клетокДобавка Corningдля среды (ECGS)
Фетальная икроножнаясыворотка для среды
FIJIПрограммное обеспечение для анализа изображений
Раствор формальдегида 4% буферизованныйKLINIPATH/VWRVWRK4186. BO1PFA
Полная средаM199 базальная среда +20 % FCS +1 % P/S + 2 нМ L-Glu +  25 &m; г/мл Hep +    50 & микро; г/мл ECGS
Желатин из кожи свиньи, тип АSigma AldrichG2500Использование 0,1% в PBS для покрытия проточных каналов
GraphPad Prism v.7GarphPadСтатистическая программа используется для графиков и статистических расчетов
Гепарин натриевая соль из слизистой оболочки кишечника свиньиSigma AldrichH4784-250MGдобавка для среднего (Hep)
HUVEC
ibidi Монтажная средаibidi50001Жидкая монтажная
среда ibidi Насосная системаibidi10902пневматический насос
Leica TCS SP8Leicaконфокальный микроскоп
L-глутамин 200mMPAN BiotechP04-80100добавка для среды (L-Glu)
Medium 199Sigma AldrichM2154Базовая среда
мышиный анти- SMAD1 антителоAbcamab53745Подходит для PLA
мышиный анти- SMAD2/3 АнтителоBD Bioscience610843Не подходит для PLA в сочетании с CST 9515
мышь анти- SMAD4 АнтителоSanata Cruz Biotechnologysc-7966Подходит для PLA
Пенициллин 10.000 ед/мл /стрептомицин 10 мг/млPAN BiotechP06-07100добавка для среды (P/ S)
Перфузионный набор БЕЛЫЙibidi10963Трубки для 1 дин/см2
Перфузионный набор ЖЕЛТЫЙ и ЗЕЛЕНЫЙibidi10964Трубки для 30 дин/см2
кролик антифосфо SMAD1/5 АнтителаCell Signaling Technologies9516Подходит для PLA
кролика анти- SMAD2/3 XPАнтитела Cell Signaling Technologies8685Подходит для
PLA кролик анти- SMAD4Антитела Cell Signaling Technologies9515Не подходит для PLA в сочетании с BD 610843
Serial Connector для µ-Slidesibidi10830последовательное соединение трубок
Triton X-100Carl Roth6683.1Permeabilization
Green Sigma для

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition. Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).
  2. Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).
  3. Hiepen, C., et al. BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGFβ responses and altered cell mechanics. PLoS Biology. 17 (12), 3000557(2019).
  4. Hildebrandt, S., et al. ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
  5. Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).
  6. Goumans, M. J., et al. Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling. Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).
  7. Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth. Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).
  8. Ramachandran, A., et al. TGF-β uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition. eLife. 7, 31756(2018).
  9. Flanders, K. C., et al. Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).
  10. Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. Dijke, P. T., Heldin, C. -H. , Springer Netherlands. Dordrecht. 277-293 (2006).
  11. Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989(2018).
  12. Cai, J., Pardali, E., Sánchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).
  13. Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. Deregulated TGF-β/BMP signaling in vascular malformations. Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).
  14. MacCarrick, G., et al. Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management. Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).
  15. Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
  16. Min, E., et al. Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling. bioRxiv. , 691980(2019).
  17. Zhou, J., et al. BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).
  18. Zhou, J., et al. Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).
  19. van Dijk, R. A., et al. Visualizing TGF-β and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation. Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).
  20. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).
  21. Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
  22. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  23. Alam, M. S. Proximity Ligation Assay (PLA). Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58(2018).
  24. Application Note 03: Growing Cells in µ-Channels. ibidi. , Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf (2012).
  25. Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi. , Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf (2019).
  26. ibidi. Application Note 31: Instructions µ-Slide VI 0.4. ibidi. , (2013).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Reichenbach, M., et al. Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-β induced osteogenic target genes. Advanced Biology. 5 (2), 2000051(2021).
  29. Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. It takes two to tango: Endothelial TGFβ/BMP signaling crosstalk with mechanobiology. Cells. 9 (9), 1965(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

TGF Beta SignalingBMP SignalingSMAD ComplexesFluid Shear StressProximity Ligation AssayEndothelial CellsTranscription Factor ComplexesMicrofluidic Flow ChannelsFluorescence MicroscopyVascular Biology

Related Articles