В этой статье подробно описываются основные этапы измерения утечки H+ через внутреннюю митохондриальную мембрану с помощью метода пластырного зажима, нового подхода к изучению термогенной способности митохондрий.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование метода patch-clamp для изучения термогенной способности митохондрий
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Митохондриальный термогенез (также известный как митохондриальное разъединение) является одной из наиболее перспективных целей для увеличения расхода энергии для борьбы с метаболическим синдромом. Термогенные ткани, такие как коричневые и бежевые жиры, развивают узкоспециализированные митохондрии для производства тепла. Митохондрии других тканей, которые в первую очередь вырабатывают АТФ, также преобразуют до 25% от общего производства митохондриальной энергии в тепло и могут, следовательно, оказывать значительное влияние на физиологию всего организма. Митохондриальный термогенез не только необходим для поддержания температуры тела, но также предотвращает ожирение, вызванное диетой, и снижает выработку активных форм кислорода (АФК) для защиты клеток от окислительного повреждения. Поскольку митохондриальный термогенез является ключевым регулятором клеточного метаболизма, механистическое понимание этого фундаментального процесса поможет в разработке терапевтических стратегий борьбы со многими патологиями, связанными с митохондриальной дисфункцией. Важно отметить, что точные молекулярные механизмы, которые контролируют острую активацию термогенеза в митохондриях, плохо определены. Этот недостаток информации во многом связан с нехваткой методов прямого измерения разъединяющихся белков. Недавняя разработка методологии пластырного зажима, применяемой к митохондриям, позволила впервые непосредственно изучить явление, лежащее в основе митохондриального термогенеза, утечку H+ через ИММ, и первую биофизическую характеристику митохондриальных транспортеров, ответственных за него, разъединяющего белка 1 (UCP1), специфичного для бурых и бежевых жиров, и транспортера АДФ/АТФ (AAC) для всех других тканей. Этот уникальный подход даст новое представление о механизмах, которые контролируют утечку H + и митохондриальный термогенез, и о том, как они могут быть нацелены на борьбу с метаболическим синдромом. В этой статье описывается методология зажимов, применяемая к митохондриям для изучения их термогенной способности путем непосредственного измерения токов H+ через IMM.
Введение
Митохондрии славятся тем, что являются электростанцией клетки. Действительно, они являются основным источником химической энергии, АТФ. Что менее известно, так это то, что митохондрии также генерируют тепло. Фактически, каждая митохондрия постоянно генерирует два типа энергий (АТФ и тепло), а тонкий баланс между двумя энергетическими формами определяет метаболический гомеостаз клеток (рисунок 1). Как митохондрии распределяют энергию между АТФ и теплом, безусловно, является самым фундаментальным вопросом в области биоэнергетики, хотя он до сих пор в значительной степени неизвестен. Мы знаем, что увеличение производства митохондриального те....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все экспериментальные процедуры на животных, которые были выполнены, соответствуют руководящим принципам Национального института здравоохранения и были одобрены Калифорнийским университетом Лос-Анджелесского институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC).
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура выделения митохондрий основана на дифференциальном центрифугировании и незначительно варьируется от ткани к ткани. Например, поскольку коричневая жировая ткань чрезвычайно богата липидами, требуется дополнительный шаг для отделения клеточного мусора и органелл от липидной фазы перед сбором митохондрий. Чтобы избежать путаницы, две процеду....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Разработка методологии пластырного зажима, применяемой к митохондриям, обеспечила первое прямое исследование утечки H+ через IMM и митохондриальные транспортеры, UCP1 и AAC, которые отвечают за нее. Электрофизиологический анализ UCP1- и AAC-зависимых Утечек H+ может дать первый взгляд на термогенную емкость митохондрий. В разделе результатов описываются стандартные процедуры измерения утечки H+ через UCP1 и AAC.
UCP1-зависимое измерение тока H+
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Эта статья о методе направлена на то, чтобы представить метод зажимов, недавно примененный к митохондриям, новый подход к непосредственному изучению утечки H+ через IMM, ответственный за митохондриальный термогенез 5,6,7,15. Этот метод не ограничивается тканями, а также может быть использован для анализа утечки H+ и других проводок IMM в различных стандартных моделях челов.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Автор заявляет об отсутствии конкурирующих интересов.
Благодарности
Я благодарю доктора Юрия Киричка за великую науку, частью которой я был в его лаборатории, и членов лаборатории Киричка за полезные дискуссии. Я также благодарю доктора Дугласа К. Уоллеса за предоставление нокаутирующих мышей AAC1 . Финансирование: A.M.B была поддержана премией Американской кардиологической ассоциации за развитие карьеры 19CDA34630062.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,1% желатин | Millipore | ES-006-B | |
| 60X водный иммерсионный объектив, числовая апертура 1,20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B Усилитель | Молекулярные устройства | ||
| стеклянные капилляры | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Дигитайзер | Молекулярные приборы | ||
| Клетка Фарадея | Самодельный | ||
| френч-пресс | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 лабораторная верхняя мешалка | |||
| Инвертированный микроскоп | Olympus | IX71 или IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Микроманулятор MPC-385 | Sutter Инструменты | FG-MPC325 | |
| Держатель микроэлектродов для агарового моста | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Съемник микропипеток | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Мини-ячейка для френч-пресса | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| МИКСЕР IKA 6-2000 об/мин | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Объектив 100-кратное увеличение | Nikon объектив | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Молекулярные устройства | ||
| камера | Warner Instruments | RC-24E | |
| Гомогенизатор Potter-Elvehjem 10 мл | Wheaton | 358039 | |
| Центрифуга охлаждаемая SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Маленькие круглые стеклянные покровные стекла: диаметр 5 мм, толщина 0,1 мм | Warner Instruments | 640700 | |
| Виброизоляционный стол | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-глюконовая кислота | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Сигма Олдрич | 60128 | |
| MgCl2 | Сигма Олдрич | 63068 | |
| сахароза | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Сигма Олдрич | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Сигма Олдрич | T3253 |
Ссылки
- Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).
- Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond. Cell Metabolism. 29
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
