Экстракция и визуализация белковых агрегатов после лечения кишечной палочки протеотоксическим стрессором

Бактерии неизбежно подвергаются воздействию множества экологических стрессов, включая низкий рН (например, в желудке млекопитающих)^1,2,активные формы кислорода и хлора (ROS / RCS) (например, во время окислительного всплеска в фагоцитах)^3,4,5, повышенные температуры (например, в горячих источниках или во время теплового шока)^6,7и несколько мощных противомикробных препаратов (например, AGXX, используемый в этом протоколе)^8. Белки особенно уязвимы к любому из этих стрессоров, и воздействие может спровоцировать несложение белка, которое затем сеет агрегацию. Все организмы используют защитные системы, которые позволяют им справляться с неправильным свораскиванием белка^9. Однако сильный стресс может перегрузить механизм контроля качества белка и нарушить вторичную и /или третичную структуру белков, что в конечном итоге инактивирует белки. Как следствие, белковые агрегаты могут серьезно ухудшить критические клеточные функции, необходимые для роста и выживания бактерий, стрессоустойчивости и вирулентности^10. Поэтому исследования, посвященные агрегации белка и ее последствиям у бактерий, является актуальной темой из-за ее потенциального влияния на борьбу с инфекционными заболеваниями.

Тепловое развертывание и агрегация белка часто обратимы⁷. Напротив, другие протеотоксические стрессы, такие как окислительный стресс, могут вызывать необратимые модификации белка путем окисления определенных аминокислотных боковых цепей, что приводит к разложению белка и, в конечном итоге, агрегации белка^4. Стресс-индуцированное образование нерастворимых белковых агрегатов широко изучено в контексте молекулярных шаперонов и их защитных функций у дрожжей и бактерий^11,12,13. Было опубликовано несколько протоколов, которые используют различные биохимические методы для выделения и анализа нерастворимых белковых агрегатов^14,15,16,17. Существующие протоколы в основном использовались для изучения агрегации бактериального белка при тепловом шоке и/или идентификации молекулярных шаперонов. Хотя эти протоколы, безусловно, были продвижением в этой области, в экспериментальных процедурах есть некоторые серьезные неудобства, поскольку они требуют (i) большого объема бактериальной культуры до 10 л^14,17, (ii) сложных процессов физического разрушения, включая использование разрушителей клеток, френч-пресса и / или ультразвуковой^{обработка 14,15,17}или (iii) трудоемкие повторяющиеся этапы промывки и инкубации^15,16,17.

В данной работе описывается модифицированный протокол, направленный на устранение ограничений предыдущих подходов и позволяющий анализировать количество белковых агрегатов, образующихся в двух различных штаммах кишечной палочки после обработки протеотоксичным антимикробным поверхностным покрытием. Покрытие состоит из металл-серебра (Ag) и рутения (Ru)-кондиционированного аскорбиновой кислотой, а его антимикробная активность достигается за счет генерации активных форм кислорода^8,18. Приведено подробное описание получения бактериальной культуры после обработки антимикробным соединением и сравнение состояния агрегации белка при воздействии двух штаммов E. coli с различными профилями восприимчивости к повышению концентрации противомикробного препарата. Описанный способ является недорогим, быстрым и воспроизводимым и может быть использован для изучения агрегации белка в присутствии других протеотоксических соединений. Кроме того, протокол может быть модифицирован для анализа влияния, которое конкретные делеции генов оказывают на агрегацию белка у множества различных бактерий.

1. Стресс-лечение штаммов E. coli MG1655 и CFT073

1. Инокулируют 5 мл среды лизогенезного бульона (ЛБ) одной колонией комменсального штамма E. coli MG1655 и уропатогенного штамма E. coli (УПЭК) CFT073 соответственно и инкубируют в течение 14-16 ч (ночью) при 37 °C и 300 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Escherichia coli CFT073 является патогеном человека. Обработка CFT073 должна осуществляться с соответствующими мерами биобезопасности в лаборатории, сертифицированной уровнем биобезопасности 2.
2. Разбавляют каждый штамм в колбу 500 мл, содержащую70 мл 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (MOPS)-глюкозы (MOPS-g)(таблица 1)среды до оптической плотности при значении 600 нм (OD₆₀₀₎0,1. Инкубировать при 37 °C и 300 об/мин до достижения средней фазы (OD₆₀₀ = 0,5-0,55).
3. Переложить 20 мл каждой культуры в три предварительно высушенные колбы по 125 мл и инкубировать при 37 °C и 300 об/мин в течение 2 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку требуется своевременная обработка образцов, обрабатывайте не более 6 культур одновременно.
4. Готовят раствор антимикробного соединения в среде MOPS-g в концентрации 2 мг/мл. Добавляют противомикробное противомикробное средстве в каждую культуру для достижения указанных концентраций. Для необработанных элементов управления добавьте необходимый объем среды MOPS-g.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вихрь антимикробного раствора 2 мг/мл, чтобы обеспечить равномерное распределение частиц соединения и избежать осаждения.
5. Инкубировать культуры в течение 45 мин при 37 °C и 300 об/мин.

Рисунок 1:Лечение стресса Escherichia coli. Бактериальные культуры выращивают в МОПС-г и обрабатывают указанными концентрациями серебро-рутений-содержащего противомикробного препарата при достижении средней фазы. Сокращения: LB = лизогенный бульон; Ag-Ru = серебро-рутениевый; MOPS-g = 3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота (MOPS)-глюкоза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Сбор образцов бактериальных клеток

1. После 45 мин лечения стрессом определяют ОД₆₀₀ каждой культуры. Для каждого образца собирают клетки, эквивалентные 4 мл ОД₆₀₀ = 1 в 15 мл центрифужных трубок путем центрифугирования в течение 15 мин при 3000 × г и 4 °C.
2. Полностью удалить супернатант и повторно суспендируют клеточные гранулы в 50 мкл ледяного лизисного буфера(таблица 1). Инкубировать образцы в течение 30 мин на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап лизиса ухудшает слой пептидо сликана. Всегда используйте свежеприготовленный буфер лизиса.
3. Перенесите образцы в микроцентрифужные трубки по 1,7 мл. Заморозить при -80 °C до дальнейшего использования.

Рисунок 2:Забор образцов бактерий. Образцы клеток собираются путем центрифугирования и повторно суспендируются в буфере лизиса с последующим хранением при -80 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Извлечение нерастворимых белковых агрегатов

1. Оттаивать образцы на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цикл замораживания-оттаивания способствует лизису клеток.
2. Добавьте 360 мкл ледяного буфера А(таблица 1)и аккуратно перемешайте путем пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осмотический шок также будет способствовать лизису клеток.
3. Перенесите образец в микроцентрифужную трубку размером 2 мл, содержащую ~200 мкл стеклянных шариков толщиной 0,5 мм. Инкубировать в течение 30 мин при 8 °C в термомиксаторе с встряхиванием при 1 400 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг приводит к физическому нарушению работы клетки. Ингибитор протеазы может быть использован для минимизации деградации белка. Разрушение может быть выполнено при 4 °C. Обратите внимание, что использование стеклянных шариков, как сообщается, вызывает агрегацию небольшого подмножества белков в дрожжах^19.
4. Инкубировать в течение 5 мин на льду без встряхивания, чтобы осесть стеклянные шарики. Перенесите 200 мкл клеточного лизата в микроцентрифужные трубки 1,7 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте переноса стеклянных бусин.
5. Центрифуга при 16 000 × г и 4 °C в течение 20 мин. Соберите супернатант, который содержит растворимые белки, и переходите к разделу 4.
6. Повторно суспендируют гранулу в 200 мкл ледяного буфера А(таблица 1)с помощью пипетки. Центрифуга при 16 000 × г и 4 °C в течение 20 мин. Осторожно удалите супернатант вообще.
7. Добавьте 200 мкл ледяного буфера B (см. Таблицу 1 и Таблицу материалов)и осторожно повторно суспендирование гранул путем пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Неионное моющее средство солюбилизирует мембранный белок.
8. Центрифугирование повторяют при 16 000 × г и 4 °C в течение 20 мин. Осторожно удалите супернатант.
9. Повторно суспендируют гранулу в 200 мкл холодного буфера А(таблица 1)путем пипетирования. Центрифуга при 16 000 × г и 4 °C в течение 20 мин. Полностью удалить супернатант.
10. Повторно суспендируют гранулу в 100 мкл 1x восстанавливающего буфера образца SDS(таблица 1)и кипятят в течение 5 мин при 95 °C в термомиксаторе.
11. Храните образец при -20 °C, чтобы продолжить позже или немедленно загрузить полиакриламидный гель SDS для разделения.

Рисунок 3:Экстракция нерастворимых белковых агрегатов. Экстракция белковых агрегатов включает в себя ряд этапов, включая разрушение клеток, отделение белковых агрегатов от растворимых белков, солюбилизацию мембранных белков и промывку. Аббревиатура: SDS = додецилсульфат натрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Пробоподготовка растворимого белка

1. Смешайте 1 объем 100% трихлоруксусной кислоты (ТЦА) с 4 объемами образца растворимого белка из шага 3.6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки TCA требуется вытяжной капюшон и средства индивидуальной защиты, а также утвержденная процедура удаления отходов.
2. Инкубировать в течение 10 мин при 4 °C, чтобы обеспечить осаждение белка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Белый осадок появится очень скоро.
3. Центрифуга выпадает в осадок при 21 000 × г и 4 °C в течение 5 мин и удаляет супернатант. Промыть гранулу 200 мкл ледяного ацетона для удаления клеточного мусора. Центрифуга при 21 000 × г и 4 °C в течение 5 мин и удаление супернатанта. Повторите эти действия на шаге 4.3 в общей сложности три раза.
4. Поместите микроцентрифужные трубки с открытыми крышками в термомикшер при 37 °C, чтобы удалить оставшийся ацетон из гранулы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация более 5 мин может снизить растворимость белковой гранулы.
5. Добавьте 100 мкл 1x восстанавливающего буфера SDS(таблица 1)и полностью растворите гранулу. Вскипятите образец в течение 5 мин при 95 °C.
6. Храните образец при -20 °C, чтобы продолжить позже или немедленно загрузить полиакриламидный гель SDS для разделения.

Рисунок 4:Получение растворимых белков. Приготовление растворимого белка включает стадию осаждения трихлоруксусной кислотой и многократное промывание ледяным ацетоном. Сокращения: TCA = трихлоруксусная кислота; SDS = додецилсульфат натрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Разделение и визуализация экстрагированных белковых агрегатов с помощью SDS-PAGE

1. Приготовьте 12% SDS-полиакриламидный гель.
   1. Для двух разделяющих гелей пипетка 5,1 мл двойной дистиллированной воды (ddH₂O), 3,75 мл Tris-HCl (рН 8,8), 7,5 мл 20% (мас./об.) SDS, 6 мл 30% раствора акриламида/бисакриламида (29:1), 75 мл 10% мас./v персульфата аммония и 10 мл тетраметилэтилендиамина (TEMED) в 15 мл центрифужной трубки и аккуратно перемешайте без введения пузырьков воздуха. Залейте гель, используя пипетку 1 мл, в стеклянные пластины, оставив верхние 2 см свободными от смеси. Добавьте 70% этанола в верхнюю часть разделяющего геля и обеспечьте равномерное сопряжение между двумя слоями.
   2. После полимеризации сепарационного геля готовят укладочный гель путем пипетирования 1,535 мл ddH₂O, 625 мл Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 мл 20% (мас./об.) SDS, 335 мл 30% раствора акриламида/бисакриламида (29:1), 12,5 мл 10% мас./об.персульфата аммония и 2,5 мл TEMED. Удалите этанол из разделительных гелей и добавьте раствор геля для укладки. Вставьте расческу с нужным количеством карманов без введения пузырьков воздуха. Опустить полимеризацию в течение 20-30 мин.
2. Загрузите 4 мкл каждого образца и белковую лестницу в отдельные скважины и запустите гель (гели) в буфере работы Трис-Глицина(Таблица 1)при 144 В в течение 45 мин при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Остановите гель, когда бромфенольный бандаж собирается мигрировать из геля.
3. Окрашивают гель(ы) в предварительно выплавленный раствор Фэрбенкса А(таблица 1)в течение 30 мин на коромысле.
4. Отклейте гель(ы) в предварительно распаленном растворе Фэрбенкса D(таблица 1)до желаемого фона (например, на ночь) на коромысле.

Рисунок 5:Разделение и визуализация белков. Образцы разделены SDS-PAGE и визуализируются окрашиванием Coomassie. Аббревиатура: SDS-PAGE = электрофорез додецилсульфат-полиакриламидного геля натрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6:Репрезентативные результаты антимикробной агрегации белка в комменсальном штамме Escherichia coli MG1655 и штамме UPEC CFT073. Штаммы E. coli MG1655 и CFT073 выращивали при 37 °C и 300 об/мин до OD600= 0,5-0,55 в среде MOPS-g перед их обработкой указанными концентрациями (-, 0 мг/мл; +, 175 мг/мл; ++, 200 мг/мл) противомикробного средства в течение 45 мин. Образцы растворимых и нерастворимых белков были получены, как описано в протоколе и на фиг.1, фиг.2, фиг.3 и фиг.4 и визуализированы на 12% полиакриламидном геле SDS(фиг.5). Образование белкового агрегата (нерастворимая фракция) было увеличено в обоих штаммах в присутствии противомикробного препарата, в то время как количество растворимых белков было уменьшено. В целом, противомикробный эффект оказал гораздо более мощное влияние на MG1655, чем на CFT073. Сокращения: M= белковый маркер; ЮПЭК = уропатропогенная кишечная палочка; MOPS-g = 3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота (MOPS)-глюкоза; SDS = додецилсульфат натрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Здесь были использованы два штамма E. coli, которые отличаются по своей восприимчивости к протеотоксичному серебро-рутением-содержащему противомикробным препаратам, чтобы продемонстрировать этот протокол. Предварительные данные о выживаемости показали, что комменсальный штамм E. coli MG1655 значительно более чувствителен к АФК-генерирующим противомикробным препаратам, чем штамм UPEC CFT073 (данные не показаны). Оба штамма выращивали в среде MOPS-g при 37 °C и 300 об/мин. В середине фазы клетки либо оставляли без лечения, либо обрабатывали 175 мкг/мл и 200 мкг/мл противомикробного препарата соответственно и инкубировали в течение 45 мин. Впоследствии клетки были лизированы, а клеточные белковые агрегаты отделены от растворимых белков. Белки в обеих фракциях затем разделялись SDS-PAGE и визуализировались окрашиванием Кумасси. Нерастворимая фракция, показанная на фиг.6, представляет собой количество образующихся белковых агрегатов, которое было увеличено при инкубации клеток в присутствии противомикробного препарата по сравнению с необработанными клетками. Увеличение образования белковой агрегации не было связано с фоном штамма, хотя гораздо более выраженное увеличение образования агрегатов было обнаружено у более чувствительного штамма MG1655. И наоборот, более низкие количества растворимых белков (растворимая фракция) наблюдались после антимикробной обработки клеток по сравнению с необработанным аналогом. Такой результат был ожидаемым с учетом предварительных данных, которые показали значительно более высокую толерантность антимикробного препарата в CFT073, чем MG1655.

Таблица 1: Буфер, носители и решения. Рецепты для буфера, носителей и решений, используемых в этом протоколе.

Авторам нечего раскрывать.