Одноклеточная характеристика притока кальция и инфекции ВИЧ-1 с использованием многопараметрической оптофлюидной платформы

Tracey Freeman; Christina Andreou; Robert P. Sebra; Kristin G. Beaumont; Talia  H. Swartz

doi:10.3791/62632

Методическая статья

Одноклеточная характеристика притока кальция и инфекции ВИЧ-1 с использованием многопараметрической оптофлюидной платформы

2.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62632

⸱

18 мая 2021 г.

Tracey Freeman¹ , Christina Andreou² , Robert P. Sebra³^,⁴ , Kristin G. Beaumont² , Talia H. Swartz¹

¹Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ²Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, ³Black Family Stem Cell Institute, Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, ⁴Sema4, a Mount Sinai venture

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол, в котором отдельные клетки контролируются на острые события и продуктивную инфекцию ВИЧ-1 на нанофлюидном устройстве. Данные визуализации определяют взаимодействие вируса и рецептора хозяина и динамику сигнального пути. Это первый метод нанофлюидной высокопроизводительной продольной одноклеточной культуры и визуализации для изучения кинетики передачи сигналов и молекулярных взаимодействий.

Аннотация

ВИЧ-1 вызывает хроническую инфекцию, которая поражает более 37 миллионов человек во всем мире. Люди, живущие с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), испытывают коморбидность, связанную с хроническим воспалением, несмотря на антиретровирусную терапию. Однако эти воспалительные сигналы не были полностью охарактеризованы. Роль ранних событий входа в активацию клеточных сигнальных событий и последующей экспрессии генов не была отражена на уровне одной клетки. Здесь авторы описывают метод, который применяет принципы флуоресцентной микроскопии живых клеток к автоматизированной одноклеточной платформе, которая культурирует и визуаизирует клетки в течение пользовательских курсов времени, что позволяет проводить высокопроизводительный анализ динамических клеточных процессов. Этот анализ может отслеживать одноклеточную живую флуоресцентную микроскопию ранних событий, которые непосредственно следуют за инфекцией ВИЧ-1, в частности приток кальция, который сопровождает воздействие вируса и развитие продуктивной инфекции с использованием флуоресцентного репортерного вируса. Клетки MT-4 нагружают чувствительным к кальцию красителем и культивируют в изолированных ручках на нанофлюидном устройстве. Культивированные клетки инфицированы вирусом-репортером ВИЧ-1 (ВИЧ-1 NLCI). Флуоресцентный микроскоп, расположенный над нанофлюидным устройством, измеряет приток кальция в течение 8-минутного временного времени после острого воздействия ВИЧ-1. Продуктивная инфекция ВИЧ-1 измеряется в тех же клетках в течение 4-дневного интервала. Данные визуализации из этих временных курсов анализируются для определения взаимодействий вируса и рецептора хозяина и динамики сигнального пути. Авторы представляют интегрированную, масштабируемую альтернативу традиционным методам визуализации с использованием новой оптофлюидной платформы, способной к одноклеточной сортировке, культивации, визуализации и автоматизации программного обеспечения. Этот анализ может измерять кинетику событий при различных условиях, включая тип клетки, агонист или эффект антагониста, при измерении массива параметров. Это первый установленный метод для нанофлюидной высокопроизводительной продольной одноклеточной культуры и визуализации: этот метод может быть широко адаптирован для изучения кинетики клеточной сигнализации и динамических молекулярных взаимодействий.

Введение

Хроническое воспаление является основной причиной ВИЧ-ассоциированных ранних заболеваний и смертности^1,^2,^3. Существует несколько механизмов, посредством которых ВИЧ может активировать воспалительную сигнализацию, и последние данные свидетельствуют о роли рецепторов P2X во входе^ВИЧ,которые являются кальциево-гатирующими аденозинтрифосфатными (АТФ) рецепторами^3,^4,^5,^6,^7,^8,....