Быстрая фиксация in vivo и выделение трансляционных комплексов из эукариотических клеток

Yoshika Janapala; Katrina Woodward; Jiwon Lee; Melanie Rug; Thomas Preiss; Nikolay E. Shirokikh

doi:10.3791/62639

Методическая статья

Быстрая фиксация in vivo и выделение трансляционных комплексов из эукариотических клеток

DOI:

10.3791/62639

⸱

25 декабря 2021 г.

Yoshika Janapala^*¹ , Katrina Woodward^*¹ , Jiwon Lee² , Melanie Rug² , Thomas Preiss¹^,³ , Nikolay E. Shirokikh¹

¹Division of Genome Sciences and Cancer, The John Curtin School of Medical Research, The Australian National University, ²Centre for Advanced Microscopy, The Australian National University, ³Victor Chang Cardiac Research Institute

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлена методика быстрой стабилизации поступательных (белковый биосинтез) комплексов со сшиванием формальдегида в живых дрожжевых и млекопитающих клетках. Этот подход позволяет препарировать переходные промежуточные продукты и динамические взаимодействия РНК:белок. Сшитые комплексы могут использоваться в нескольких последующих приложениях, таких как методы профилирования на основе глубокого секвенирования, микроскопия и масс-спектрометрия.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Быстрые ответы, включающие быстрое перераспределение матричной(м)РНК и изменения трансляции мРНК, имеют отношение к текущим гомеостатическим корректировкам клеток. Эти корректировки имеют решающее значение для выживаемости эукариотических клеток и «контроля повреждений» во время колебаний уровня питательных веществ и солености, температуры и различных химических и радиационных стрессов. Из-за высокодинамического характера ответов на уровне РНК и нестабильности многих промежуточных продуктов РНК:РНК и РНК:белок получение значимого снимка состояния цитоплазматической РНК возможно только при ограниченном числе методов. Эксперименты по профилированию рибосом на основе транскриптома на основе РНК-seq являются одними из наиболее информативных источников данных для контроля трансляции. Однако отсутствие равномерной промежуточной стабилизации РНК и РНК:белок может привести к различным смещениям, особенно в быстро меняющихся путях клеточного ответа. В этой статье мы предоставляем подробный протокол быстрой фиксации, применимый к эукариотическим клеткам различной проницаемости, чтобы помочь в промежуточной стабилизации РНК и РНК:белок. Далее приведены примеры выделения стабилизированных комплексов РНК:белок на основе их совместного осаждения с рибосомными и поли(рибо)сомальными фракциями. Отделенный стабилизированный материал может быть впоследствии использован в рамках экспериментов типа профилирования рибосом, таких как подход секвенирования трансляционного комплексного профиля (TCP-seq) и его производных. Универсальность методов в стиле TCP-seq в настоящее время продемонстрирована приложениями в различных организмах и типах клеток. Стабилизированные комплексы также могут быть дополнительно очищены сродством и визуализированы с помощью электронной микроскопии, разделены на различные поли(рибо)сомальные фракции и подвергнуты секвенированию РНК, благодаря легкости разворота сшивки. Поэтому методы, основанные на охлаждении и фиксации формальдегида с последующим осаждением или другим типом обогащения комплекса РНК:белок, могут представлять особый интерес для исследования более тонких деталей быстрой динамики комплекса РНК:белок в живых клетках.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Живые организмы подвержены динамическим внутри- и внеклеточным изменениям на протяжении всей своей жизни, которые требуют быстрых реакций для поддержания гомеостаза и обеспечения выживания. Чтобы обеспечить адаптацию к окружающей среде, эукариотические клетки регулируют свой метаболизм с помощью контроля экспрессии генов. Контроль экспрессии генов может осуществляться во время транскрипции и/или трансляции; с трансляционными ответами, как правило, происходящими быстрее^1,^2,^3,^4. Например, трансляционные изменения обычно возникают в течение 1-30 минут после начала стресса, в то время как изменения уровня транскрипции следуют через^{несколько}часов после воздействия стресса^3,^4,^5. Изменения в трансляционном выходе достигаются быстрее благодаря постоянной доступности молекул матричной (м)РНК в цитоплазме. И наоборот, на уровне транскрипции новые молекулы мРНК должны синтезироваться, а у эукариот обрабатываться и экспортироваться из ядра, вызывая обширные задержки во времени отклика^2,^4,^6,^7,^8.

Острая трансляционная реакция на стресс обычно характеризуется общим снижением трансляционного выхода с селективной регуляцией белков, необходимых для выживания клеток.¹^,³^,⁴^,⁹. Считается, что снижение производства белка имеет решающее значение из-за высоких энергетических затрат процесса.³^,⁷. Для облегчения селективного торможения и повышения регуляции трансляционные реакции обслуживаются целым рядом сложных регуляторных механизмов. Регуляция может осуществляться на всех этапах трансляции: инициация, удлинение, прекращение биосинтеза полипептидов и рециркуляция рибосомы¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³, но наиболее сильно проявляется на этапе инициации⁵^,⁷^,⁹^,¹⁰^,¹³. Во время инициации малая рибосомная субъединица (SSU), поддерживаемая эукариотическими факторами инициации (eIF), связывается и сканирует 5' нетранслированную область (UTR) мРНК до тех пор, пока не будет распознан стартовый кодон.²^,⁵^,⁶^,⁸^,¹¹^,¹²^,¹³. Регулирующие механизмы часто нацелены на eIF, влияющие на прикрепление, сканирование и распознавание кодонов. Например, фактор инициации eIF2, существенный фактор трансляции, который помогает в наборе инициатора Met-tRNA_i^Met в СБУ, часто нацеливается на эукариот в стрессовых условиях⁴^,⁶^,¹¹. В дрожжах фосфорилирование этого фактора может быть вызвано депривацией питательных веществ и осмотическим стрессом.¹^,⁴^,¹¹^,¹⁴^,¹⁵, а в клетках млекопитающих аминокислотное голодание, стресс эндоплазматического ретикулума (ER), УФ-стресс, вирусная инфекция и измененный уровень кислорода могут вызвать этот ответ⁸^,⁹^,¹¹. Быстрое повышение регуляции специфической трансляции мРНК проявляется в реакции клеток млекопитающих на гипоксию, которая демонстрирует глобальное быстрое ингибирование трансляции и селективное повышение регуляции биосинтеза гипоксий-индуцируемых факторов (HIFs). HIF являются факторами транскрипции, которые затем вызывают долгосрочное клеточное перепрограммирование на уровне транскрипции ДНК.⁸^,⁹^,¹⁶. Аналогичные реакции наблюдались у дрожжей при тепловом стрессе, с быстрой трансляционной экспрессией белков теплового шока (HSP), за которой следовали замедленные реакции на уровне транскрипции.¹⁷^,¹⁸. В дополнение к депривации питательных веществ и тепловому шоку, поступательные реакции в дрожжах были изучены при различном кислороде.⁸^,¹⁹солёность⁵, фосфат, сера²⁰^,²¹ и азот²²^,²³ Уровней. Это исследование имеет широкие последствия для промышленного использования дрожжей, таких как выпечка и ферментация.²⁴^,²⁵. Трансляционные реакции также могут играть важную роль в углублении понимания таких заболеваний, как нейродегенеративные расстройства и болезни сердца, которые характеризуются внутриклеточными стрессами, такими как окислительный стресс. В целом, трансляционные реакции являются неотъемлемой частью контроля экспрессии генов и способствуют быстрой адаптации к широкому спектру стрессовых состояний в эукариотических организмах.

Для изучения трансляционных ответов требуются методы, обеспечивающие минимально искаженные снимки переводческого ландшафта. Полисомное профилирование — классический подход, используемый при изучении трансляции через мРНК, включающий разделение поли(рибо)сомальных фракций мРНК посредством ультрацентрифугирования через градиенты сахарозы^26,^27. Этот подход может быть использован для изучения уровней трансляции для отдельных мРНК (с помощью методов обнаружения, таких как обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция,^{ОТ-ПЦР 26),}или глобально в сочетании с высокопроизводительными методами (микрочипы или РНК-seq^28,^29). Более развитым подходом является профилирование рибосом, позволяющее изучать положения удлиняющихся рибосом вдоль молекулы мРНК в общегеномном масштабе, а также делать вывод об эффективности трансляции через транскриптом и использовании основного и альтернативного стартовых участков^30,^31. Профилирование рибосом включает в себя выделение и секвенирование фрагментов мРНК, защищенных рибосомным присутствием над ними. Профилирование рибосом обеспечило значительное понимание динамики трансляции в ряде состояний, включая гипоксический стресс, тепловой шок и окислительный стресс^31,^32. Метод был адаптирован к нескольким типам исходного материала, включая дрожжи и клетки млекопитающих.

В то время как профилирование полисом и рибосом было фундаментальным в расширении возможностей исследований в переводе, процесс перевода включает в себя различные трансляционные промежуточные продукты и комплексы, которые трудно охватить с помощью этих методов^11,^13. Дополнительное ограничение связано с отсутствием способности изучать типы быстрого ответа, поскольку трансляционные комплексы либо стабилизируются in vivo путем добавления специфических ингибиторов трансляции (антибиотиков), что приводит к определенным артефактам распределения рибосом, либо ex vivo при клеточном лизисе конкретно (антибиотики) или неспецифично (с высоким содержанием соли или ионов магния), что приводит к лишению более короткоживущих или менее стабильных промежуточных продуктов^33, ³⁴^,³⁵.

Формальдегид широко используется для сшивания нуклеиновых кислот и белков, например, в исследованиях иммунопреципитации хроматина (ChIP) и сшивки иммунопреципитации (CLIP). Его небольшие размеры и отличная проницаемость клеток позволяют осуществлять быстрое in vivo действие^36. Основываясь на быстром сшивке формальдегида, подход профилирования рибосом был расширен с помощью секвенирования профиля translation Complex (TCP-seq)^10,^36,^37,^38,^39,^40. TCP-seq, впервые разработанный в дрожжах, позволяет захватывать все промежуточные трансляции, включая сканирующие или пост-терминальные комплексы SSU и множественные рибосомные конфигурации^37,^38,^41,^42. Метод был использован в нескольких исследованиях^10,^{38, 39,}^41,^42,некоторые из которых используют комбинаторный подход как ингибиторов трансляции, так и сшивки формальдегида для облегчения остановки трансляции. Еще одна модифицированная версия метода, селективный TCP-seq^39,недавно была использована для включения иммуноочищения сшитых комплексов, расширяя сферу применения TCP-seq. Быстрый, эффективный и обратимый характер сшивки формальдегида делает эти подходы подходящими для изучения переходных сложных взаимодействий мРНК:трансляции, особенно в контексте высокодинамичных путей ответа на уровне трансляции.

Здесь мы подробно описываем процессы сшивки формальдегида in vivo с целью комплексной стабилизации и изоляции комплекса переводов. Мы предоставляем отдельные протоколы, нюансированные для дрожжей и клеток млекопитающих(рисунок 1). Далее мы приводим примеры последующего использования стабилизированного сшиванием материала(рисунок 1),например, для обнаружения коочищенного белкового фактора с использованием иммуноблоттинга (вестерн-блоттинг), иммуноассистированной очистки (или «иммунопреципитации»; IP) и обогащение трансляционных комплексов, содержащих специфические интересующие факторы, электронная микроскопия и секвенирование РНК.

figure-introduction-1
Рисунок 1:Схема, изображающая обзор типичной экспериментальной установки. Основные этапы стабилизации in vivo формальдегида трансляционных комплексов изображены в виде блок-схемы, дополненной информацией о ключевых необходимых инструментах. Описаны потенциальные последующие применения сшитого материала, включая примеры, которые были успешно использованы, но непосредственно не охвачены в этом протоколе, такие как очистка шариков SPRI РНК, секвенирование РНК и масс-спектрометрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Протокол дрожжевых клеток

Культура и фиксация дрожжевых клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация и заготовка клеток адаптированы из^10,³⁸с модификациями.
1. В качестве примера приведены 1 л культуры дрожжевых клеток (дикий тип (WT) BY4741) в орбитальном шейкере с начальной оптической плотностью не более 0,05 а.е. при 600 нм (OD₆₀₀₎в подходящих средах (1% мас./об.дрожжевого экстракта, 2% мас./об.пептона, 2% мас./об.декстрозы (глюкозы), 40 мг/л аденинасульфата (YPD), используемого в качестве примера) при желаемых условиях (30 °C используется в этом эксперимент).
2. Установите препаративную центрифугу с совместимыми роторными и центрифужными баллонами для гранулирования культуры жидкой суспензии дрожжевых клеток. Для экспериментов по глюкозному голоданию гранулируют клетки после достижения оптической плотности 0,6-0,8 а.е. при 600 нм (OD_600),используя кратковременное центрифугирование при 30 °C, 5000 x g в течение 1 мин.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Ведите учет OD растущих клеток и позволяйте клеткам расти до тех пор, пока OD₆₀₀ не достигнет 0,6-0,8 а.е., если фаза экспоненциального роста представляет интерес.
3. Повторно суспендируют гранулы сразу в теплых (30 °C) средах YP, содержащих отсутствующую или низкую (0,25% мас./об.) добавленную глюкозу, и инкубируют культуру в течение еще 10 мин при 30°С в орбитальном шейкере-инкубаторе.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Композиция носителей может повлиять на последующую эффективность сшивки. Этот протокол был протестирован только с использованием YPD. При проведении экспериментов по голоданию решающее значение имеет соблюдение сроков и минимизация задержек между процедурами.
4. Как только ячейки будут готовы, установите ящик для льда внутри вытяжного шкафа с стаканом, содержащим 250 г чистого измельченного водяного льда. Убедитесь, что 25 мл полосатиков и свежеприготовленного 37% раствора формальдегида, стабилизированного метанолом, доступны внутри вытяжки. Вылейте 1 л культуры в стакан, содержащий 25% мас./об.щебня измельченного водяного льда.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Держите клетки на льду на протяжении всех последующих операций до тех пор, пока клетки не будут заморожены, если не указано иное.
5. Добавьте 75 мл 37% мас./об.раствора формальдегида до конечной концентрации 2,2% мас./об., и интенсивно перемешайте смесь до тех пор, пока лед не растает.
6. Как только лед растает, установите таймер на 10 минут.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Придерживайтесь рекомендуемых сроков и температурного режима для достижения воспроизводимых результатов фиксации.
7. После инкубации в течение 10 мин переводят культуру в предварительно охлажденные бутылочки центрифуги и гранулируют клетки центрифугированием при 4 °C, 5000 х г в течение 5 мин. Пока это вращение включено, предварительно охладите трубку объемом 50 мл и держите свежеприготовленный буфер А (содержащий глицин для нейтрализации любого оставшегося формальдегида) на льду.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к прилагаемой таблице для получения точных буферных составов.
8. После центрифугирования поместите трубки центрифуги на лед со стороной гранул, контактирующей со льдом. Занесите трубки в вытяжной шкаф и выбросьте супернатант в контейнер для отходов формальдегида.
9. Повторно суспендировать гранулу ячейки из всех пробирок в 20 мл буфера А с помощью полосы 25 мл и переложить в трубку объемом 50 мл.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Эта промывка имеет решающее значение для предотвращения невоспроизводимого сшивания, и добавление буфера не должно превышать 20 минут времени от сбора клеток.
10. Внесите объем до 40 мл с буфером А и соберите промытые ячейки центрифугированием при 4 °C, 5000 х г в течение 5 мин.
11. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу клетки в 40 мл буфера A1, который является буфером A, не содержащим глицина, чтобы удалить любое загрязнение глицином.
12. Грануляционные ячейки снова центрифугированием при 4 °C, 5 000 х г в течение 5 мин.
13. Повторите стирки с буфером A1 еще раз. Выбросьте супернатант и поместите гранулу ячейки на лед. Взвесьте пробирку с гранулой (масса влажных клеток должна составлять ~1 г на 1 л клеточной культуры).
Разрушение дрожжевых клеток и сбор цитозола
1. Наполните пенополистирольный ящик, облицованный алюминиевой фольгой, жидким азотом на глубину примерно 3 см. Поместите трубку объемом 50 мл в вертикальном положении в коробку.
2. Повторно суспендируют гранулу (~1 г влажной клеточной массы) в 550 мкл буфера А2 путем пипетирования и вихря в течение 10 с. Добавьте 10 мкл 40 Ед/мкл ингибитора РНКАЗЫ и снова вихрь в течение 10 с.
  ВНИМАНИЕ: Носите соответствующее защитное снаряжение, такое как термоизолированные перчатки, при обращении с жидким азотом. Убедитесь, что любой контейнер, используемый для хранения жидкого азота, не протекает, и что трубчатая стойка внутри не будет всплывать или падать на бок. Работайте в хорошо проветриваемом помещении, чтобы избежать истощения кислорода.
3. Используя пипетку объемом 1 мл, капните клеточную суспензию в трубку объемом 50 мл, содержащую жидкий азот.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Капание должно выполняться медленно и осторожно, чтобы избежать агрегации капель. Убедитесь, что капли замерзают, прежде чем вводить новые капли.
4. Перенесите трубку объемом 50 мл с каплями замороженной клеточной суспензии к комнатной температуре и подождите, пока жидкий азот полностью испарится. Запечатайте трубку крышкой и храните гранулы ячейки при -80 °C или немедленно продолжайте дальше.
  ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что жидкий азот полностью испарился перед герметизацией трубки. Оставшийся жидкий азот в герметичной трубке может вызвать опасное повышение давления.
5. Чтобы подготовиться к следующему этапу, предварительно охладите трубки без нуклеазы объемом 1,5 мл и 10 мл из нержавеющей стали на сухом льду.
6. Переложите замороженные капли клеточной суспензии в банки с помощью чистого стерильного шпателя.
  ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что банки для измельчения плотно закрыты.
7. Погрузите банки для измельчения в жидкий азот на 1 мин, чтобы жидкая фаза оставалась ниже соединения. Установите криомешалку с частотой 27 Гц для перемешивания в течение 1 мин.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда балансируйте шлифовальный контейнер с другой той же модели, даже если для обработки образца требуется только одна канистра.
8. Перемешайте запечатанные помолочные банки при частоте 27 Гц в течение 1 мин в смесительной мельнице.
9. Повторно охладите помоловые банки в жидком азоте, как и раньше, и встряхните при 27 Гц в течение 1 мин далее в смесительной мельнице.
10. Переложите банки в ящик для льда, содержащий сухой лед вместе с трубками без нуклеазы объемом 1,5 мл. Используя небольшой стальной шпатель, перенесите полученный порошкообразный образец в пробирки в ~100 мг аликвот и храните трубки при -80 °C.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать ~600 мг образца на эксперимент, включающий анализ профиля осаждения полисом, разделение цитозола на переведенные и непереведенные фракции и дальнейшее разделение переведенной фракции на фракции SSU, рибосомы и дезомы при сбраживании РНКазы.
Отделение фиксированных (поли)рибосомных комплексов от нетранслируемых фракций цитозоля
ПРИМЕЧАНИЕ: Порядок, установленный ранее¹⁰^,³⁸обычно используется для обогащения транслированной РНК на основе ее совместного осаждения с (поли)рибосомами. Здесь представлен более совершенный подход к разделению переведенных и нетранслируемых фракций цитозола, устраняющий необходимость осаждения и последующей повторной солюбилизации материала.
1. Готовят 2,5 мл линейных 10%-20% мас./об. градиентов сахарозы с буфером В методом замораживания-оттаивания⁴³ в тонкостенных ультрацентрифужных трубках (5 мл, 13 х 51 мм).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Метод замораживания-оттаивания выполняется путем последовательного добавления и замораживания буферизованных слоев сахарозы с линейно регрессирующими концентрациями друг на друге. Более подробную информацию см. в дополнительной таблице 1.
2. Для создания прерывистой 50% мас./v сахарозной подушки, после оттаивания и стабилизации линейных градиентов медленно дозируйте 0,5 мл 50% сахарозы в буфере B непосредственно на дно трубок, используя шприц объемом 1 мл, прикрепленный к игле 19 G x 1,5", или стеклянному капилляру аналогичных/подходящих размеров. Перед дозированием осторожно и медленно введите кончик иглы или капилляра сверху вниз по предварительно сформированным градиентам сахарозы, избегая каких-либо нарушений, пока он не достигнет дна трубки.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции по приготовлению буфера В см. в дополнительной таблице 1.
3. Тщательно сбалансируйте градиенты, удалив верхние части или наложив более 10 вт/в сахарозы в буфер B и держите их ледяными или при 4 °C.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Прерывистый градиент с нижним 50% слоем сахарозы необходим для сбора материала с более высокой скоростью осаждения без осаждения его на стенке трубы.
4. Разморозьте ~100 мг замороженной ячейки порошкообразного образца при комнатной температуре и немедленно поместите на лед. Смешать в 150 мкл буфера А2 путем пипетирования, добавить ингибитор РНКазы до 1 ЕД/мкл и перемешать путем вихря (избежать чрезмерного вспенивания и смешивания с газовой фазой) в течение 10 с.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте все операции, сохраняя материал на льду, если не указано иное.
5. Гранулируйте клеточный мусор путем центрифугирования трубок при 4 °C, 13 000 х г в течение 5 мин и восстанавливайте осветленный супернатант (~150 мкл) в новой 1,5 мл низкобелковой связывающей трубке.
6. Загрузите полученную осветленную смесь на прерывистые трубки градиента сахарозы со стадии 1.3.3 и тщательно сбалансируйте их.
7. Ультрацентрифугирование труб в роторе среднего объема при 4 °C со средней перегрузкой 287 980 х г (k-фактор 49) в течение 1 ч 30 мин.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Эти условия были предварительно оптимизированы (с использованием пост-ультрацентрифугированного градиентного анализа следов поглощения УФ-излучения) для сохранения свободных (не(поли)рибосомных) SSU и LSU (большая рибосомная субъединица) в верхней (10%-20% сахарозы) части градиента при концентрации (поли)рибосомной фракции в нижней (50%) подушке сахарозы без гранулирования материала.
8. Используйте новый стерильный шприц объемом 1 мл, оснащенный иглой 19 G x 1,5", чтобы собрать переведенную фракцию цитозола. Поместите градиент 5 мл на устойчивую стойку, чтобы было видно дно трубки.
9. Сверху трубки воткните иглу прямо в нижнюю часть градиента (не прокалывая трубку) и осторожно, не создавая никаких пузырьков, вытяните ровно 0,5 мл нижнего раствора, содержащего переведенный пул РНК.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что этот шаг выполнен в холодном помещении, и трубка крепко удерживается. Рекомендуется рисовать все 0,5 мл одним движением вверх, чтобы избежать нарушения градиента.
10. Подтвердить (поли)рибосомное присутствие и истощение SSU, LSU и более легких фракций в полученной смеси путем считывания поглощения градиента сахарозы при ультрацентрифугировании.
11. Концентрируйте собранный пул транслированных РНК с предыдущей стадии до 100 мкл с помощью ультрафильтрации в микроконцентрационном устройстве с отсечной регенерированной целлюлозной мембраной 10 кДа.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно промыть мембрану устройства микроконцентрации 0,5 мл буфера 1 (см. фиг.2а)и использовать условия отжима(g),рекомендованные заводом-изготовителем.
12. Далее разбавляют материал с предыдущей стадии пять раз (добавляют 400 мкл) буфером 1 и концентрируют обратно до 200 мкл, чтобы обеспечить меньший объем, а также частичное удаление сахарозы.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется хранить полученные смеси при -80 °C в течение 6 месяцев и использовать в качестве входного материала для построения библиотеки РНК-seq «общей транслированной РНК» или стадии сбраживания РНКазы конструкции библиотеки TCP-seq. «Нетранслированная» фракция цитозола может быть извлечена из верхней части градиента с использованием аналогичной процедуры и сохранена при -80 °C.
РНКазовое переваривание фиксированных (поли)рибосомных комплексов и разделение переваренного материала на мелкие рибосомальные субъединицы (ССУ), монорибосомальные (рибосомы, РС) и дирибосомальные (дисомы, ДС) фракции
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура, как правило, следует подходу, описанному ранее.¹⁰^,³⁸но используется модифицированный тип градиента, время разделения, ускорение и условия сбраживания РНКазы для достижения наилучшего разрешения во всех трех изолированных фракциях.
1. Готовят тщательно сбалансированные 12,5 мл линейных 10%-40% мас./об.градиентов сахарозы, изготовленные с буферными 1 в 13 мл тонкостенных полипропиленовых трубок, 14 х 89 мм, используя метод⁴³ замораживания-оттаивания, как описано на этапе 1.3.1, и примечание к нему.
2. Разморозить при комнатной температуре и немедленно перенести образцы на лед или взять концентрированную и обедненную сахарозой переведенную фракцию цитозола со стадии 1.3.12.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте все процедуры на льду, если не указано иное.
3. Переварить переведенную фракцию цитозола перемешиванием в 4,5 ЕД E. coli RNase I на_{1 OD 260} единицы фракции в течение 30 мин при 23 °C. Немедленно добавляют и смешивают путем пипетирования ингибитора РНКАЗЫ, способного инактивировать РНКазу I до 0,25 ЕД/мкл в смесь, чтобы инактивировать РНКазу I.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ингибитор РНКазы, способный ингибировать РНКазу I. Получают AU₂₆₀ с помощью AU₂₆₀ = (Поглощение при 260 нм, стандартизированное к единицам оптической плотности, эквивалентное оптическому пути 1 см x объем лизата в мкл) / 1000.
4. Немедленно переложите образцы на лед.
  ВНИМАНИЕ: Очень важно придерживаться рекомендуемых условий пищеварения и тщательно измерять количество добавленной РНКазы I. Единица РНКазы I, упомянутая здесь, определяется как количество фермента, необходимого для получения 1 мкг кислоторастворимого материала из РНК печени мыши за 30 мин при 37 °C. Партии РНКазы I могут иметь недокументированные изменения активности и могут потребовать экспериментов для достижения оптимальных условий пищеварения. Если запас фермента слишком концентрированный, рекомендуется разбавить его буфером 1, чтобы избежать пипетирования очень маленьких объемов раствора.
5. Загрузите реакционные смеси на 10%-40% мас./об.градиентов сахарозы со стадии 1.4.1.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте конечные объемы в диапазоне 150-300 мкл на градиент. Каждая очистка требует минимум двух градиентов. Используйте различные входные объемы материала (более низкие AU_260,10-11 AU_260,для DS и сравнительно более высокие AU_260,13-14 AU_260,для SSU или RS) для достижения оптимального разделения.
6. Ультрацентрифугирование труб в роторе среднего объема при 4 °C со средней перегрузкой 178 305 х г (k-фактор 143,9) в течение 3 ч 30 мин.
  ВНИМАНИЕ: Если необходимы запасные балансировочные трубки, выровняйте их массу и распределение массы с пробирками, содержащими пробы. Используйте запасные градиенты сахарозы, наложенные на количество буфера, эквивалентное количеству наложения образца, а не пробирки с равномерной концентрацией сахарозы.
7. Установите устройство фракционатора градиента не менее чем за 30 мин до завершения отжима ультрацентрифугирования, включая заполнение 0,2 мкм отфильтрованного тяжелого раствора (например, 60% сахарозы в деионизированной воде, как используется здесь) в водотядерный насос.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется дезагрязнить линии и трубки фракционатора с использованием деионизированной воды, затем 1%-2% раствора SDS в деионизированной воде, деионизированной воды и, наконец, 80% этанола в растворе деионизированной воды до и после прогонов.
8. Отрегулируйте исходный уровень считывания абсорбции, сначала заполнив систему деионизированной водой и обнулив оптику в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя, а затем компенсируя смещение базового уровня с помощью запасного разгруженного градиента сахарозы 14 x 89 мм, изготовленного с буфером, идентичным пробоотборникам (например, буфер 1).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ту же скорость смещения для внесения корректировок, что и для считывания пробы, например 1,5 мл/мин.
9. Измерьте мертвый объем системы смещения, точно отсчитывая время между первым входом раствора в оптический тракт детектора и первым появлением на выходе дробного коллектора.
  ПРИМЕЧАНИЕ: При рекомендуемой скорости 1,5 мл/мин фракционирование может быть выполнено при комнатной температуре. Рекомендуется сразу же переносить собранные фракции на лед.
10. Выполняйте фракционирование с использованием показаний поглощения в реальном времени при 254 нм, скорости перемещения 1,5 мл/мин и поточного обнаружения фракций на основе ожидаемого положения осаждения и профиля поглощения образцов. Используйте переключение коллекторной трубки с временной задержкой, соответствующей измеренному ранее мертвому объему.
11. Изолировать фракции, соответствующие положениям и подвижности комплексов СГУ, РС и ДС, и собрать их в новые низкобелковые связывающие 1,5 мл микроцентрифужные трубки; немедленно переложить выделенные фракции на лед и сразу же заморозить, если они не обработаны дальше.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется немедленно заморозить собранные фракции в сухом льду или жидком азоте и хранить при -80 °C или ниже в течение 6 месяцев.
Размежевание рибосомных комплексов и выделение РНК для построения библиотек РНК-seq
1. Чтобы деблокировать/обратить вспять сшивки и изолировать РНК от ассоциированных белков, перенесите примерно половину всех фракций градиента сахарозы в новые низконуклеиновые кислоты, связывающие полипропиленовые трубки без нуклеазы 1,5 мл (350 мкл на трубку) с предохранительными / запирающими устройствами крышки.
2. Дополнить смеси 40 мкл 100% стоп-раствора (10% SDS мас./об.и 100 мМ ЭДТА), 4 мкл 1 М Трис-HCl рН 2 при 25 °C (до 10 мМ), 1,6 мкл 2,5 М глицина (до 10 мМ) и деионизированной безнуклеазной водой для получения конечного объема 400 мкл.
3. Перемешайте содержимое трубок путем пипетки и перенесите трубки при комнатной температуре.
4. Добавьте равный объем смеси кислый фенол:хлороформ:изоамиловой спирт 125:24:1 (рН 4,0-5,0) в каждую пробирку. Энергично встряхивайте смеси в течение 2 мин, используя вихревой смеситель, установленный на максимальную скорость.
  ВНИМАНИЕ: Фенол и хлороформ являются коррозионными и токсичными. Избегайте физического контакта с жидкостями и работайте в хорошо проветриваемом помещении или под вытяжным кожухом. Всегда используйте перчатки, лабораторное пальто и защитные очки или лицевой щиток при работе с фенолом или хлороформом.
5. Поместите трубки в термоколотушитель и непрерывно встряхивайте при 65 °C, 1 400 об/мин в течение 30 мин.
6. Облегчить агрегацию фаз путем центрифугирования смеси при 12 000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
7. Соберите верхние водные фазы и перенесите их в свежие трубки с низким содержанием нуклеиновой кислоты, связывающие 1,5 мл.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать перекрестного загрязнения, не пытайтесь полностью восстановить водные фазы. Разумный объем восстановления составляет 300-350 мкл.
8. Дополнить собранные водные фазы 0,1 объемами 3 М ацетата натрия (рН 5 при 25 °С), 20 мкг гликогена (с использованием запаса 5 мкг/мкл) и 2,5 объемами абсолютного этанола. Тщательно перемешайте растворы, вращая трубки в течение 1 мин.
9. Осаждение РНК путем инкубации образцов при -20 °C в течение не менее 2 ч (рекомендуется на ночь).
10. Прогрейте трубки до комнатной температуры и перемешайте путем вихря.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительный прогрев труб и последующее центрифугирование при комнатной температуре (без принудительного охлаждения) помогают уменьшить соли и феноловое совместное осаждение и перенос. Эти условия не должны приводить к потере материала или неэффективности сбора РНК, если они выполняются так, как описано, и с использованием достаточно чистого этанола.
11. Гранулы РНК выпадают в осадок путем центрифугирования пробирок при 12 000 х г в течение 30 мин при комнатной температуре.
12. Откажитесь от супернатанта и дважды промойте гранулу 80% v/v этанола, собирая его каждый раз центрифугированием при 12 000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
13. Высушите гранулы РНК, открыв крышки трубок и поместив открытые трубки в нагреватель сухого блока, установленный на 45 °C в течение 10 мин. Растворите полученную высушенную гранулу в 20 мкл 1x HE буфера.
14. Оцените результирующую концентрацию РНК с помощью измерения спектра поглощения УФ-излучения.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Длина фрагмента РНК и общее количество могут быть дополнительно оценены с использованием денатурирующего гелевого электрофореза, например, в автоматизированном аппарате капиллярного гелевого электрофореза на основе флуоресценции.
Селективная коиммуночистка SSU с помощью помеченных eIF и вестерн-блоттинг-анализа селективного обогащения SSU
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ~15 а.е. (260 нм) переваренной и седиментационно-сегрегированной фракции со стадии 1.4.11 для выполнения аффинной очистки с использованием магнитных шариков IgG. Сохраните ~5% фракции SSU в качестве входного элемента управления (Входная фракция, I). eIF4A-метки (TIF1-TAP; Был использован штамм дрожжей Tandem Affinity Purification tag), который также позволяет обнаружить eIF4A путем зондирования TAP-метки с использованием антител против TAP.
1. Перенести 100 мкл магнитной суспензии шариков IgG (на каждые 15 а.е. (260 нм) лизата или фракции) использовали 1 мг бусин (1 мг бусин) в новую трубку с низким связыванием белка 1,5 мл; соберите бусины с помощью магнитной стойки и аспирируйте их.
2. Дважды промыть магнитные шарики 1 мл буфера 1 с помощью последовательного повторного суспендирования путем пипетки и сбора с помощью магнитной стойки.
3. После стирки соберите и декантируйте бусины, держа их на магнитной стойке.
4. Добавьте фракцию SSU в промытые шарики и инкубируйте смесь в течение 4 ч с вращением при 4 °C в цикломиксере, установленном при ~20 об/мин.
5. Соберите бусины с помощью магнитной стойки при 4 °C и сохраните супернатант (проточная фракция, FT).
6. Мойте бусины дважды при 4 °C с буфером 1, дополненным 4 мМ DTT, каждый раз вращаясь в течение 10 минут в цикломиксере и собирая и декантируя бусины на магнитной стойке. Сохраните промывки (фракции W1 и W2).
7. Для аналитического применения, такого как вестерн-блоттинг, элюируют связанный материал в условиях денатурации и восстановления путем добавления буфера образца полиакриламидного гелевого электрофореза LDS (додецилсульфат лития) с рН от 8,5 до 1x и DTT до 2 мМ.
8. Нагревайте смесь при 95 °C в течение 5 мин в термоблоке для завершения элюирования.
9. Соберите шарики с помощью магнитной стойки и восстановите денатурированный элюат (фракция Е) в свежей микроцентрифуге с низким содержанием белка, связывающей 1,5 мл.
10. Используйте фракцию E из предыдущего шага для немедленного запуска денатурирующего додецилсульфата натрия (SDS) PAGE или храните фракцию E при -20 °C.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки коллекции обогащенных TAP-меткой трансляционных комплексов для любого последующего применения используйте альтернативный подход к элюированию с использованием протеазы вируса табачного травления (TEV). Более подробную информацию см. в Дополнительной таблице 1.
11. Чтобы сконцентрировать разбавленные фракции FT, W1 и W2, осадите их материал, добавив 3x объемов ледяного ацетона. Инкубировать образец ацетоновой смеси при -20 °C в течение 3 ч.
12. Гранулируйте осадок путем центрифугирования пробирок при 13 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
13. Выбросьте супернатант и высушите гранулы на воздухе в открытых пробирках при комнатной температуре в течение 30 мин.
14. Растворите гранулы в 7 мкл 1x буфера загрузки LDS, дополненного 2 мМ DTT. Нагревайте образцы в термоблоке, установленном на 95 °C, в течение 5 мин.
15. Загрузите все образцы I, FT, W1, W2 и E на 4%-12% мас./v акриламидного градиента, полиакриламидный денатурирующий гель Bis-Tris. Запустите гель, используя 1x MES SDS (2-[N-мофолино]этанесульфоновая кислота, додецилсульфат натрия), работая буфером при 80 В, пока белковый маркер (10-250 кДа) не разрешится хорошо и свинцовый краситель не достигнет дна геля.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется загружать последовательные разбавления WCL (целоклеточный лизат) (2-10 мкг) на гель в качестве контроля. Может потребоваться несколько попыток, чтобы достичь сопоставимой нагрузки геля через фракционный материал.
16. Перенос содержания белка в геле на мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) методом влажного переноса при 100 В в течение 1 ч в холодном помещении в соответствии с рекомендациями производителя оборудования для вестерн-блоттинга.
17. Блокируйте мембрану с помощью соответствующего блокирующего буфера (на основе фосфатного буферного физиологического раствора) при комнатной температуре в течение 1 ч при постоянном встряхивании.
18. Следуя инструкциям производителя по разведению антител, исследуйте мембрану анти-TAP-антителом для обнаружения меченого белка eIF4A, антитела против Pab1p или анти-β-актинового антитела (или любой другой желательной мишени) путем ночной инкубации мембраны с разбавленным блокирующим буфером (PBS) антителом (разведение 1:1000) в цикломиксе в холодном помещении.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Разведение антител 1: 1000 является хорошей отправной точкой.
19. Промыть мембрану три раза 1x фосфатно-буферным физиологическим раствором, 0,2% v/v Tween 20 (PBST) в течение 10 мин каждый.
20. Исследуйте мембрану флуоресцентно мечеными вторичными антителами в соответствии с инструкциями производителя путем инкубации в цикломиксе при комнатной температуре в течение 1 ч.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Разведение антител 1:20 000 является хорошей отправной точкой.
21. Промывайте мембрану три раза по 1x PBST в течение 10 минут каждый. Ненадолго промойте мембрану деионизированной водой, а затем абсолютным метанолом. Высушите и визуализируйте мембрану в флуоресцентной системе визуализации в соответствии с инструкциями производителя.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание для других белков может быть достигнуто путем использования вторичных антител с красителями, соответствующими различным флуоресцентным каналам (например, в паре eIF4A-TAP против β-актина, используемой здесь), путем последовательного окрашивания или удаления и окрашивания одной и той же мембраны или разрезания мембраны из геля, загруженного повторяющимся рисунком фракций, и отдельного зондирования каждого кусочка соответствующими антителами (как в примере Pab1p, используемом здесь).

2. Протокол клеток млекопитающих

Культура и фиксация клеток млекопитающих
1. В 2 колбах T-175 выращивают клетки HEK293 до 60%-70% слияния в модифицированной орлиной среде Dulbecco и 10% v/v фетальной бычьей сыворотки при 37 °C и 5% v/v углекислого газа.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Полная среда производится путем добавления 55 мл коммерческого FBS в 500 мл коммерчески приобретенного DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащего L-глутамин, фенол-красный и бикарбонат натрия, но без HEPES или пирувата натрия. Количество клеток на колбу Т-175 при 70% слиянии должно быть в пределах 1,7-2,0 х 10^7.
2. По крайней мере, за 3 ч до желаемого времени фиксации замените среду колб Т-175 ровно 30 мл предварительно нагретой полной среды и замените колбы в клеточном инкубаторе.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что свежая среда пипетирована на противоположную сторону колбы к монослою ячейки, чтобы избежать отсоединения ячейки. Постарайтесь провести медиаобмен как можно быстрее, внеся минимальное нарушение газового и температурного баланса.
3. После того, как клеточная среда была заменена, подготовьте буферы и химические вещества, необходимые для фиксации. Приготовьте фосфат Dulbecco Buffered-Saline (DPBS) с 50 мМ глицина, добавив 10,2 мл 2,5 мл глицина в бутылку DPBS объемом 500 мл и перемешав.
4. Приготовьте флакон DMEM, дополненный 10% FBS, как на этапе 2.1.1, для использования в нестерильных условиях и 100 мл аликвоты 0,25% трипсина-ЭДТА. Источник дополнительной бутылки коммерческого DPBS, предварительно составленного с хлоридом кальция (CaCl₂₎и хлоридом магния (MgCl_2).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы можно хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
5. Подготовьте ящик со льдом до краев с измельченным водяным льдом, чтобы колба Т-175 могла равномерно поместиться сверху и держаться в вытяжном шкафу вместе с подготовленными буферами, также на льду.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за быстрой реакции трансляции на любое изменение окружающей среды все сроки между удалением клеточных колб из инкубатора и добавлением раствора формальдегида должны быть сведены к минимуму.
6. Чтобы охладить клетки, извлеките колбу Т-175 из инкубатора и плотно прижмите ее ко льду, обеспечив максимальный контакт с поверхностью. Внутри химического дымового капота наклоните колбу на бок так, чтобы среда собиралась на стороне, противоположной клеткам. Пипетка 168 мкл 37% мас./об.формальдегида непосредственно в объединенную среду (до конечной концентрации 0,2% мас./об.). Немедленно перемешайте, осторожно раскачивая колбу вперед и назад, закройте и переместите колбу на льду, убедившись, что она горизонтальна, а клетки равномерно покрыты.
  ВНИМАНИЕ: Формальдегид является вредным веществом с потенциальными долгосрочными побочными эффектами, а также раздражителем как для дыхательной системы, так и для кожи. Его следует обрабатывать только в подходящем химическом вытяжном шкафу. Контейнеры с формальдегидом всегда должны быть герметизированы снаружи вытяжного шкафа.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что формальдегид добавляется непосредственно в клеточную среду, а не в стенку колбы. Шаг 2.1.6 должен занять менее 1 мин.
7. Высиживайте колбы на льду еще 10 минут. Вылейте среду в соответствующий контейнер для отходов через сторону колбы, противоположную ячейкам.
8. Используя полоску, пипетку в 30 мл фосфатного буферного физиологического раствора Dulbecco без ионов кальция и магния и дополнительно содержащую 50 мМ глицина, мягко на стороне, противоположной клеткам. Смешайте, раскачивая колбу; вернуть колбу в горизонтальное положение и инкубировать еще 10 мин на льду.
9. Вылейте раствор через боковую колбу, противоположную клеткам, и осторожно добавьте 7 мл стандартного 0,25% мас./об.т. раствора Трипсина-ЭДТА для отсоединения и повторного суспендирования клеток. Инкубировать колбу при комнатной температуре в течение 5-10 мин.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что раствор Трипсина-ЭДТА равномерно покрывает все клетки. Используйте периодические мягкие наклоны и раскачивания, чтобы способствовать отсоединению клеток.
10. Переместите колбу вертикально и с помощью полосы соберите отсоединившиеся ячейки, аккуратно смыв все оставшиеся ячейки со стенок колбы. Переложите суспензию в трубку объемом 50 мл, установленную на льду.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированные клетки могут стать более хрупкими; не пипетку интенсивно или больше, чем требуется для отделения клеток от стенки колбы.
11. Немедленно дополните собранную клеточную суспензию 20 мл полной среды (нестерильная ледяная среда с 10% FBS) и перемешайте, осторожно перевернув трубку.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Полная среда клеточного культивирования (включая 10% FBS) добавляется для нейтрализации трипсина, предотвращая дальнейшее повреждение клеточных мембран и распад клеток.
12. Гранулируйте ячейки путем центрифугирования трубки при 100 х г в течение 5 мин и 4 °C. Ячейка гранулы должна быть хорошо видна.
13. Вылейте среду и осторожно повторно суспендируйте гранулу клетки в 10 мл ледяного DPBS с Ca^2+,Mg²⁺и без глицина.
14. Повторите шаг 2.1.12.
15. Вылейте буфер промывки и аккуратно повторно суспендируйте гранулу ячейки в 800 мкл ледяного DPBS с Ca^2+,Mg^2+,без глицина, на льду. Переведите повторно суспендированные клетки в новую микроцентрифугу с низким содержанием белка, связывающую 1,5 мл.
16. Центрифугируйте трубку при 100 х г в течение 3 мин и 4 °C. Осторожно выбросьте супернатант с помощью пипетатора объемом 1 мл. На этой стадии клеточная гранула может быть заморожена при -80 °C или перейти к стадии лизиса клеток.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженные клеточные гранулы могут храниться при температуре -80 °C до 1 года. Мы обнаружили, что замораживание клеточных гранул облегчает последующий лизис и рекомендует замораживание, даже если долгосрочное хранение не планируется.
Разрушение клеток млекопитающих и сбор цитозола
1. В шкаф для биобезопасности добавляют 300 мкл лизисного буфера на основе неионного, неденатурирующего детергента и 7 мкл ингибитора РНКазы 40 Ед/мкл. Хорошо перемешайте путем пипетки с использованием наконечника 1 мл.
2. Осторожно прикрепите иглу весом 25 Г к шприцу объемом 1-3 мл и энергично пипеткой смесь, используя по крайней мере семь медленных впускных и быстрых ударов выхлопных газов вниз.
3. Выбросьте шприц и иглу в корзину для острых предметов и повторите процедуру, используя шприц объемом 0,3 мл, оснащенный иглой весом 31 г.
4. Выбросьте шприц и иглу в корзину для острых предметов. Центрифугируйте трубки при 4 °C, 12 000 х г в течение 5 мин, чтобы гранулировать клеточный мусор.
5. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку с низким содержанием белка, связывающую 1,5 мл. Храните как клеточный мусор (для целей контроля), так и результирующий осветленный клеточный лизат при -80 °C.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Оптическая плотность лизата колеблется в пределах 25-30_{а.е. 260} при объединении двух колб Т-175 и соблюдении рекомендуемых объемов. Лизаты и клеточный мусор могут храниться при температуре -80 °C до 1 года.
Отделение фиксированных (поли)рибосомных комплексов от нетранслируемых фракций цитозоля
1. Готовят линейные 15%-45% мас./об.градиентов сахарозы в тонкостенных полипропиленовых трубках объемом 13 мл, 14 х 89 мм, используя метод замораживания-оттаивания, как описано на этапе 1.3.1 протокола дрожжей, но с использованием буфера 2(рисунок 2а).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Разморозьте градиенты на ночь в холодном помещении при температуре 4 °C в ночь перед фракционированием.
2. Нагрузка 150-250 (максимум 300) мкл лизата ячейки с предыдущего шага 2.2.5 на сбалансированные градиенты. Хранить оставшийся лизат при -80 °C и использовать в целях контроля.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь приведен пример сегрегации на основе седиментации на полисомальные, рибосомные и «свободные» фракции SSU. Альтернативный подход см. в представленной дополнительной таблице 1.
3. Ультрацентрифугирование труб в роторе среднего объема при 4 °C, средней перегрузке 178 305 х г (k-фактор 143,9) в течение 1 ч 45 мин.
4. За 30 мин до завершения отжима установите и установите исходный градиентный фракционатор, как описано в шагах протокола дрожжей 1.4.7-1.4.9.
5. Фракционировать градиенты, как правило, как описано на этапах 1.4.10-1.4.11 протокола дрожжей.
  ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе будут разделены полисомальные, рибосомные и «свободные» фракции SSU. Полисомальные фракции могут быть использованы в экспериментах по полисомному профилированию.
6. Немедленно переложите собранные фракции на лед и, если не обработайте их, храните при температуре -80°C до 6 месяцев.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Если замена трубки коллектора фракций синхронизирована с онлайн-идентификацией и сегрегацией фракций, мы рекомендуем использовать фракции до 800 мкл (время сбора 32 с на фракцию при 1,5 мл / мин). Если фракционирование проводится без использования поточных показаний абсорбции, рекомендуется использовать фракции 250-500 мкл (10-20 с на фракцию при 1,5 мл/мин). После разделения фракции могут быть использованы для иммуноочищения, электронной микроскопии, денатурации PAGE и западного блоттинга сразу или подвергнуты обращению поперечных ссылок для последующего анализа РНК и / или протеомики.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поступательные комплексы чувствительны к ионному составу буферов, что особенно важно при ультрацентрифугировании, где оцениваются седиментационные свойства. Таким образом, мы протестировали несколько буферов осаждения с использованием осветленного лизата, извлеченного из грунтового нефиксированного дрожжевого материала, чтобы выбрать условия, наиболее подходящие для разрешения поступательных комплексов и отдельных рибосомных субъединиц (SSU, LSU), моносом (RS) и полисом по всему градиенту. Все буферы были основаны на составе ядра, содержащем 25 мМ HEPES-KOH pH 7,6 и 2 мМ DTT. Концентрации KCl, MgCl_2,CaCl₂и ЭДТА дополнительно модифицировали побуферам (рисунок 2a),и эти компоненты добавляли к лизатам перед градиентной нагрузкой и к буферам градиента сахарозы перед градиентным литьем, соответственно.

В буферах 1 и 2 получены хорошо разрешенные поступательные комплексы. Буфер 1 привел к несколько лучшему разделению малых рибосомных субъединиц (SSU)(рисунок 2a). Пропуск_MgCl2 и добавление ЭДТА (буферы 3,4) вызвали потерю высоких седиментационных свойств для большинства полисом и, вероятно, их частичную разборку(рисунок 2а). В то время как добавление 2,5 мМ CaCl₂ приводило к несколько более однородным полисомальным пикам, улучшение было незначительным, и общее количество полисомального материала уменьшилось в этом случае(рисунок 2a)по сравнению с буферами 1 и 2. Таким образом, мы выбрали буфер 1 в качестве рабочего буфера выбора.

figure-results-1
Рисунок 2:Буферные условия для извлечения поступательного комплекса и оценки стабилизирующего эффекта фиксации. Показаны профили поглощения УФ-излучения, собранные при 260 нм для общего лизата дрожжевых клеток, разделенных в 10%-40% мас./об.градиентов сахарозы. (a)Влияние моно- и двухвалентных солей и связывания ионов магния на осаждение материала, извлеченного из нефиксированных дрожжевых клеток. Красные и серые линии представляют собой типичную реплику. (б,в) Сравнение лизатов, полученных из нефиксированных (серая линия), 2,2% (черная линия) и 4,4% (черная пунктирная линия) с содержанием формальдегидно-фиксированных дрожжевых клеток. (d) Стабилизация полисом оптимизированной 0,2% мас./v фиксации формальдегида (черная пунктирная и пунктирная линия) ячеек HEK 293T по сравнению с материалом из тех же нефиксированных ячеек (серая линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Затем мы проверили эффект полисомальной стабилизации путем фиксации с различными концентрациями формальдегида. Используя в остальном тот же клеточный материал, буферы, подходы к обработке ячеек и таймингу, мы сравнили материал, извлеченный из нефиксированных ячеек и клеток, фиксированных с 2,2% и 4% мас./об.формальдегида(рисунок 2b,c). Мы обнаружили, что 2,2% мас./v формальдегида лучше подходит для фиксации, поскольку, хотя он отлично сохранял полисомы, о чем можно судить по соотношению полисом кмоносомам (рисунок 2b),он не уменьшал общий выход рибосомного материала по сравнению с 4% мас./v формальдегида, который демонстрировал явные признаки чрезмерной фиксации(рисунок 2c).

Для материала, полученного из клеток млекопитающих, из-за большего отношения буфера лизиса к объему клетки, требуемого экстракцией на основе моющего средства, использовался буфер 2(рисунок 2a). Это дало хорошо разрешенные поступательные комплексы при осаждении в градиентах сахарозы(рисунок 2d). Примечательно, что была использована гораздо более низкая концентрация формальдегида в размере 0,2% мас./об., поскольку более высокие концентрации приводили к существенной потере полисомального и рибосомного материала (данные не показаны). По аналогии с результатами, полученными с дрожжевыми клетками, стабилизированный сшиванием материал продемонстрировал лучшую сохранность полисом и более высокое соотношение полисом к моносомам(рисунок 2d).

Затем мы проверили, являются ли выбранные условия фиксации формальдегида достаточно эффективными для стабилизации активно транслируемой мРНК в полисомальных фракциях в результате сшивки, и улучшенный выход полисома не является просто следствием ингибирования функции фермента и прогрессирования удлинения трансляции. Мы использовали ЭДТА и высокомоновалентную соль (KCl) для дестабилизации полисом и рибосом. Эти реагенты добавляли к осветленным лизатам дрожжевых клеток и включали во все последующие буферы и градиенты сахарозы поверх буферной композиции 1 соответственно.

Действительно, 15 мМ ЭДТА проявляли меньшее дестабилизирующее воздействие на полисомальные фракции, полученные из фиксированных клеток(рисунок 3a),подтверждая, что сшитые комплексы более надежны. Дестабилизирующее действие ЭДТА может быть несколько преодолено путем увеличения концентрации формальдегида, так как материал из 4% мас./об., закрепленных формальдегидом клеток, лучше сопротивляется развертыванию(рисунок 3а). Однако повышение концентрации ЭДТА до 50 мМ привело к дестабилизации большинства поступательных комплексов как в фиксированных, так и в нефиксированных условиях, что может быть выведено из более медленного осаждения материала и отсутствия хорошо сформированных пиков(рисунок 3b). Это можно объяснить частичным развертыванием структур и общей потерей компактности, а не полной диссоциацией полисомальных компонентов от мРНК. Даже в этом случае сшитый материал продемонстрировал более быстрое осаждение(рисунок 3b).

figure-results-2
Рисунок 3:Влияние фиксации формальдегида дрожжей in vivo на стабильность полисом. Буфер 1 (см. текст и рисунок 2a)использовался во всех экспериментах. Тип данных и построение графиков, как описано в легенде на рисунке 2. (a)Сравнение добавления 15 мМ ЭДТА к лизатам клеток и последующим буферам по стабильности полисом, полученных из нефиксированных (серая линия), 2,2% (черная линия) и 4% (черная пунктирная линия) с/v закрепленных формальдегидом клеток. (b)то же самое, что и(a), но для добавления 50 мМ ЭДТА и исключая 4% мас./об., зафиксированных формальдегидом клеток. (c)то же самое, что и(a),но для добавления 500 мМ KCl и исключая 2,2% мас./об., закрепленных формальдегидом клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Подобно эффектам ЭДТА, при 500 мМ KCl мы обнаружили значительное улучшение стабильности с 4% мас./об фиксации формальдегида(рисунок 3c). Кажущаяся потеря компактности в этом случае также может быть объяснена частичной отслойкой составляющих рибосомных комплексов, а не их полной диссоциацией от РНК. В целом, полисомы, полученные из формальдегидно-фиксированных клеток, продемонстрировали более высокую устойчивость к развертыванию и структурной дестабилизации, что согласуется с формированием дополнительных ковалентных связей внутри этих комплексов.

Во время стимулирующих условий роста мРНК могут быть быстро инициированы, что приводит к накоплению нескольких рибосом на одних и тех же молекулах мРНК, которые образуют структуры, известные как полирибосомы или полисомы. Полисомы могут быть разделены ультрацентрифугированием в градиентах сахарозы, где они откладываются на основе их порядка (числа одновременно прикрепленных рибосом на мРНК). Когда трансляция подавляется, рибосомы не участвуют в другом раунде перевода достаточно быстро, что приводит к (частичной) «разборке» полисом, которая проявляется как модальный сдвиг в сторону полисом более низкого порядка и накопление моносом^4,^26.

Модель поступательного ответа, которая может быть визуализирована на уровне распределения полисомного порядка, может быть обеспечена глюкозным голоданием. Истощение глюкозы вызывает одно из самых драматических и быстрых поступательных ингибирующих эффектов на дрожжи^1,^3,^40. Предыдущие исследования показали, что в течение 1 мин после истощения глюкозы, потери полисом, накопления моносом и ингибирования инициации трансляции может произойти^4. В течение 5 мин после повторного приема глюкозы трансляция быстро восстанавливается с явным увеличением^{пополисом 3,}^4. Было также отмечено, что трансляция ингибировалась, когда клетки подвергались воздействию сред, содержащих глюкозу 0,5% (мас./об.) или ниже, и не наблюдалось эффекта при уровнях глюкозы 0,6% (мас./об.) или выше.

Таким образом, мы хотели определить, подходят ли наши условия фиксации для сохранения трансляционных различий в динамике реакции глюкозного стресса, что может быть оценено по соотношению полисом к моносоме. Мы сравнили материал из клеток, выращенных в среднеэкспоненциальной фазе на высоком уровне глюкозы (2,00% мас./об. добавленной) с теми, которые переносились в течение 10 мин в среду без или с низким добавлением (0,00% или 0,25% мас./об., соответственно) глюкозы. Фиксацию проводили с использованием 2,2% мас./об.формальдегида параллельно в контроле (без голодания; быстрая замена среды той же стандартной средой, содержащей 2% мас./об. добавленной глюкозы, с последующей инкубацией в течение 10 мин и фиксацией) и 10 мин голодающей (быстрая замена среды теми же средами, но низким содержанием 0,25 вт/об или без добавления глюкозы, с последующей инкубацией в течение 10 мин и фиксацией) клеток.

В соответствии с более ранними результатами, мы заметили, что дрожжевые клетки сильно подавляют трансляцию при стрессе глюкозного голодания(рисунок 4a). Как отсутствие добавлений, так и условия с низким содержанием глюкозы вызывали разборку полисом, при этом в случае низкого уровня добавленной глюкозы сохранялось немного, но, очевидно, больше полисом. Таким образом, реакция на удаление глюкозы дрожжами может быть не тотального или полностью выключенного типа и постепенно настраивается. Подтверждая ожидания стабилизирующего действия формальдегидного сшивания, полисомальный материал из фиксированных клеток продемонстрировал более высокое различие между голодающими и неголодными клетками, возможно, сохраняя более высокий динамический диапазон ответа(рисунок 4b). Интересно, что в случае материала из фиксированных клеток низкая добавленная концентрация глюкозы привела к специфическому многосомальному изобилию, которое гораздо лучше дифференцируется от состояния без добавления глюкозы по сравнению с нефиксированными клетками(рисунок 4a). Это является убедительным свидетельством пригодности подхода к фиксации формальдегида в сохранении и захвате относительно незначительных и переходных различий в равновесии высокодинамичных процессов, например, во время трансляционных реакций.

figure-results-3
Рисунок 4:Улавливание быстрых изменений в трансляции дрожжей при глюкозном голодании. Буфер 1 (см. текст и рисунок 2a)использовался во всех экспериментах. Тип данных и построение графиков, как описано в легенде на рисунке 2. (a)Клеточные лизаты, полученные из неголголодных (серая линия), ограниченных глюкозо-голодающих (0,25% мас./об. добавленной глюкозы в течение 10 мин; коричневая линия) и глюкозо-истощенных (без добавления глюкозы в течение 10 мин; красная линия) нефиксированных дрожжевых клеток. (b) то же самое, что и(a), но для 2,2% мас./v формальдегид-фиксированных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Мониторинг трансляционного статуса рибосомами, связанными с активной трансляцией мРНК с использованием градиентного осаждения сахарозы («полисомное профилирование»), является широко применяемой методикой^26,^27,^28. В сочетании с количественным анализом микрочипов и, в последнее время, с высокой пропускной способностью секвенирования^28,^44,профилирование полисом предоставляет информацию о рибосомно-ассоциированных мРНК транскриптома в масштабах всего транскриптома. С несколькими предположениями в области исследований биосинтеза белка традиционно утверждается, что полисомальное присутствие является признаком активного участия в трансляции соответствующих мРНК. Следующий вывод часто (но не всегда) оправдан, что чем больше рибосом присутствует на мРНК заданной длины (чем выше порядок полисом), тем активнее мРНК участвует в трансляции. Таким образом, отделение полисомальной фракции от остального материала может быть полезным с точки зрения выделения активно транслируемой РНК. В рамках подходов к профилированию следов, и в частности TCP-seq^10,^38,^39, который генерирует отдельную популяцию освобожденных SSU, полученных из комплексов кодонов сканирования, запуска и остановки, может быть дополнительно проницательным удаление рибосомных субъединиц, которые не сосуществуют с полными моносомами или полисомами.

Таким образом, мы использовали отделение «нетранслируемых» мРНК, таких как свободные SSU (мРНК, привязанные к одному SSU или SSU без прикрепленной мРНК), от «активно транслирующегося» пула мРНК. Чтобы достичь этого, мы предположили, что мРНК, участвующие во взаимодействиях с одной (моно-) или несколькими рибосомами (полисомами), могут быть активно транслированы. Такие комплексы могут быть отделены от других их более высоким коэффициентом осаждения. Мы также предложили отделить «активно переводимый» пул мРНК в сахарозную подушку (50% мас./об.сахарозы) вместо прямого гранулирования материала на стенке трубки. Центрифугирование быстроосаждающихся комплексов в подушку позволило контролировать сепарацию с использованием считывания профиля поглощения и добиться более высокой производительности солюбилизированного, неагрегированного и неденатурированного материала, по сравнению с гранулированием и ресолюбилизацией^10,^38.

В целом, для очистки отдельных SSU, рибосом, дезомов и потенциально компактно упакованных полисом более высокого порядка фиксированные осветленные лизаты подвергали двухступенчатому процессу ультрацентрифугирования(рисунок 5). В первом градиенте сахарозы ультрацентрифугирование приводило к разделению свободных SSU и LSU в верхней (10%-20% мас./v сахарозы) части градиента, тогда как сшитый переведенный пул, включающий полисомы и мРНК, связанные с одной полной рибосомой, был сосредоточен в нижней части (50% мас./об.сахарозы) градиента(рисунок 5a). ). Затем нижние 50% мас./об.слоя сахарозы, содержащего транслированный пул мРНК, концентрировали и переваривали его РНКазой I, за которым следовало второе ультрацентрифугирование градиента сахарозы для получения отдельных резистентных к РСУ, ЛСУ, РС, РНКаз-резистентных дезомов (ДС) и незначительной фракции устойчивых к нуклеазе более высокого порядка полисом(Рисунок 5b). Отрицательное окрашивание уранилацетатом и визуализация с помощью просвечивающего электронного микроскопа подтвердили идентичность комплексов, выделенных на каждой стадии осаждения(рисунок 5).

figure-results-4
Рисунок 5:Выделение общих транслированных фракций РНК от нетранслируемой РНК. (a,c) Схема (слева) и соответствующие репрезентативные результаты (справа; тип данных и построение графиков, как описано на рисунке 2) (a)первого прерывистого градиентного разделения нетранслированных фракций цитозы, включая свободные SSU и переведенный пул мРНК, идентифицированный путем совместного осаждения с рибосомами и полисомами, и(c)разделение отдельных рибосомных комплексов, высвобождаемых из транслированного пула мРНК путем контролируемого переваривания РНКазы I и ультрацентрифугирования через второй линейный градиент сахарозы на фракции SSU, LSU, рибосомные (RS) и нуклеазно-резистентные дезомальные (DS). Высокие (15 AU₂₆₀₎и низкие (8 AU₂₆₀₎количества нерасчетного переваренного материала были включены, чтобы продемонстрировать возможность увеличения ультрацентрифугирующих нагрузок, когда незначительные фракции представляют интерес. Также могут быть идентифицированы устойчивые к нуклеазе полисомы высшего порядка (например, трисомы в приведенных примерах). (б,г) Репрезентативные изображения ТЕА уранилацетат-контрастных фракций из (a,c), соответственно с маркировкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Чтобы проверить пригодность режима фиксации для удержания переходных рибосом-ассоциированных белков (в частности, eIF), мы проверили ко-осаждение eIF4A, лабильного eIF, динамически связанного с рибосомой, через рибосомные фракции. Мы воспользовались преимуществами штамма дрожжей с меткой eIF4A Tandem Affinity Purification (TAP) (TIF1-TAP) и исследовали присутствие eIF4A в материале, полученном из фиксированных и нефиксированных клеток с использованием антител против TAP, по сравнению с обилием Pab1p в качестве дополнительного РНК-связывающего контроля, используя SDS-PAGE с последующим западным блоттингом(рисунок 6).

figure-results-5
Рисунок 6:Стабилизация переходных белков в поступательных комплексах при фиксации формальдегида in vivo. (a,b) (верхние графики) Цельноклеточный лизат (WCL) из(a)нефиксированных и(b)2,2% формальдегид-фиксированных eIF4A-TAP дрожжевых клеток, разделенных ультрацентрифугированием и визуализированных, как описано на фиг.2 легенды. (нижние участки) Западно-блоттинговая визуализация соответствующих фракций градиента сахарозы при разделении материала, анализируемого в соответствующих градиентах (верхних графиках), и WCL в качестве контрольного. (c)Среднее соотношение между содержанием eIF4A или Pab1p в долях фиксированного и нефиксированного материала. Относительные пропорции (нормализованные к сигналу всех 2-7 фракций) eIF4A (черные полосы) и Pab1p (серые полосы) были рассчитаны по 2,3 (SSU, LSU), 4,5 (RS, легкие полисомы) и 6,7 (тяжелые полисомы) из данных (a,b) (нижние графики), и взято их фиксированное к нефиксированному соотношению. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение соотношения от среднего значения, при этом объединенные дроби (пунктирные квадраты) рассматриваются как реплики. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В соответствии с их высоким содержанием в клетках, мы наблюдали высокую интенсивность сигнала от обоих белков во всем клеточном лизате (WCL) и более медленно отстойных фракций, полученных из нефиксированных клеток(рисунок 6a,нижняя панель). Мы также обнаружили значительное количество этих белков в WCL, полученных из фиксированных клеток, и обнадеживают эффективность экстракции сшитого материала и отсутствие неожиданных потерь(рисунок 6b,нижняя панель). Однако, в отличие от нефиксированных клеток, материал из фиксированных клеток продемонстрировал повышенное относительное присутствие eIF4A в более быстро отстойных рибосомных фракциях по сравнению с Pab1p(рисунок 6c). Этот результат свидетельствует о том, что eIF4A остается более прочно связанным с полисомами в формальдегидно-сшитом материале.

Подтвердив положительный и специфический стабилизационный эффект сшивки на присутствие eIF4A в рибосомных фракциях, мы использовали фиксированный материал из штамма дрожжей с меткой eIF4A (TIF1-TAP) для захвата и обогащения eIF4A-содержащих комплексов путем аффинной очистки магнитными шариками IgG. Мы имеем аффинно-обогащенные WCL, свободные фракции SSU и полисомальные (переведенный пул мРНК) после первого осаждения через градиент сахарозы (например, раздел 1.3 дрожжевого протокола), а также фракции SSU, LSU и RS из второго осаждения при разборке переведенного бассейна в отдельные комплексы с РНКазой I (например, раздел 1.4 дрожжевого протокола)(рисунок 7 ). Во всех случаях, кроме фракции LSU, нам удалось наблюдать селективное обогащение eIF4A в очищенных фракциях (элюат, E), по сравнению с присутствием β-актина в исходном материале (вход, I)(рисунок 7).

figure-results-6
Рисунок 7:Селективная иммуноочищение in vivo формальдегид-стабилизированных трансляционных комплексов транзиторно ассоциированным eIF4A. Схема иллюстрирует источник различных трансляционных комплексов и эпитопа eIF4A, включая нефракционированный осветленный WCL дрожжевых клеток eIF4A-TAP; свободные SSU и транслированный пул РНК (полисомы), сегрегированные при первом ультрацентрифугировании; Фракции SSU, LSU и RS высвобождаются из транслируемой РНК путем переваривания RNase I и сегрегируются с помощью второго ультрацентрифугирования (см. текст). Западное пятнистое изображение обеспечивает визуализацию обилия eIF4A в фракциях по сравнению с обилием одновременно окрашенных β-актиновых контролей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительная таблица 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фиксация формальдегида является удобным и популярным методом достижения быстрого in vivo сшивания биомолекул^10,^36,^45,^46,^47,^48. По сравнению с другими потенциальными мишенями биомолекул, успешный захват трансляционных комплексов требует немедленной фиксации во время мгновенного охлаждения клеток или другого материала. Без неустановленной стабилизации существует вероятность продолжения различных процессов, связанных с трансляцией, смещения сложного распределения от невозмущенного состояния in vivo ^49. По сравнению с другими методами трансляционной остановки и стабилизации рибосомного комплекса, быстрота действия формальдегида через клеточные мембраны и неизбирательный характер сшивок обещают сохранение максимального разнообразия промежуточных продуктов трансляционного комплекса ближе к их изначально распределенным состояниям^50.

Представленный здесь подход был установлен и оптимизирован как в дрожжевых, так и в клетках млекопитающих, и в настоящее время методы были получены другими группами для использования в более разнообразном биологическом материале, например, у целых позвоночных (например, эмбрионов рыбок данио)^10,^38,^39,^49,^51,⁵² . Хотя эти работы в совокупности убеждают в универсальности и широкой применимости подхода, быстрое сшивание формальдегида трансляционных комплексов можно считать несколько трудным для переноса на новые типы биологического материала из-за необходимости оптимизации и корректировки.

Главным требованием к успеху метода является повторная оптимизация концентрации формальдегида и метода сбора и разрушения клеток. Менее проницаемые, мелкие и круглые дрожжевые клетки требуют гораздо более высокой (по крайней мере, в 10 раз) концентрации формальдегида и физического разрушения фиксированных клеток. Напротив, крупные и уплощенные адгезивные клетки млекопитающих в культуре могут быть легко перефиксированы и требуют бережного обращения при фиксации, в то время как извлечение фиксированных комплексов может быть выполнено химическим путем с разрушением мембраны с использованием моющих средств. Недостаточное сшивание может позволить менее стабильным или более короткоживущим промежуточным продуктам диссоциировать или просачиваться в более позднее состояние. Чрезмерное сшивание может негативно повлиять на способность выделять и изучать рибосомные фракции и может создавать селективные смещения, такие как более глубокое истощение тяжелых комплексов. По нашим наблюдениям, даже незначительные изменения, такие как тип используемых адгезивных клеток человека, могут повлиять на выход восстановленных сшитых комплексов и могут потребовать повторной оптимизации режима сшивания. Мы также можем ожидать, что клетки с существенно отличающимися свойствами проницаемости, такие как растительные клетки, потребуют дополнительной обширной оптимизации условий фиксации^52. Тем не менее, трудно представить себе тип биологического материала, который был бы совершенно несовместим с подходом.

Одним из соображений, относящихся к протоколу фиксации млекопитающих, является плотность и количество клеточного материала, используемого в качестве входных данных. Рекомендуется, чтобы клетки непрерывно росли без повторного посева или других возмущений в течение не менее 2 дней, чтобы избежать внешних воздействий на динамику клеточной трансляции. Применимо для большинства типов клеток, но для большинства адгезивных клеток последовательно достигнутые уровни слияния не более 70% обеспечат отсутствие серьезных эффектов ингибирования контакта, которые могут негативно и непредсказуемо влиять на скорость трансляции.

Еще одной интересной и потенциально уникально удобной особенностью фиксации формальдегида, вытекающей из его неизбирательной реакционной способности, является стабилизационное воздействие на поступательные комплексы в системах смешанной таксономии. Бактериальные, а тем более поступательные комплексы митохондрий, хлоропластов и различных внутриклеточных паразитов, как известно, трудно нацелить на специфические ингибиторы трансляции. Напротив, в данных TCP-seq следы, отображаемые с митотранскриптомом, легко наблюдаются в данных^38,^39,^50. Интересным последующим событием могло бы стать использование подхода к исследованию трансляции в целых микросообществах, таких как образцы почвы, воды или кишечника, где надежная быстрая трансляционная остановка и комплексная стабилизация любыми другими средствами были бы проблематичными.

Следует также отметить, что для наиболее сложного материала (такого как твердые и/или громоздкие ткани) ничто не препятствует использованию стабилизации формальдегида сразу после разрушения клеток и гомогенизации материала. Этот подход уже часто используется для устранения задержки входа в клетку при стабилизации поступательных комплексов со специфическими ингибиторами малых молекул^33,^53,^54,^55. Учитывая, что фиксация формальдегида традиционно использовалась с отличными результатами для стабилизации образцов ex vivo/in vitro в таких приложениях, как электронная микроскопия^45,^56,^57,^58,мы можем ожидать еще меньших негативных эффектов в этом случае, особенно тех, которые связаны с плохим извлечением поступательных комплексов из тщательно зафиксированных клеток.

Наши результаты подтверждают удобство быстрой фиксации формальдегида для стабилизации высокопреходящих комплексов, таких как те, которые включают eIF4A. Примечательно, что в отличие от млекопитающих, дрожжи eIF4A гораздо слабее связаны с колпачковым связывающим комплексом eIF4F и, как следствие, трансляционными комплексами в целом. eIF4A обычно теряется при любой обширной очистке рибосомного материала в дрожжах^29,^59,^60,^61,^62,^63. Тем не менее, в in vivo-фиксированномдрожжевом материале можно добиться надежного обогащения eIF4A во всех фракциях поступательных комплексов, где ожидается его присутствие. Ранее опубликованные данные Sel-TCP-seq продемонстрировали обогащение eIF2 и eIF3, которые более прочно ассоциируются с рибосомами (но также выявили временно происходящую котрансляционную сборку белкового комплекса)^39. Таким образом, метод подходит для обнаружения как более сильных, так и более слабых прикрепленных составляющих поступательных комплексов.

Подводя итог, мы представили подход, полезный для получения информации в первую очередь об изменениях, происходящих на начальной фазе трансляции и когда требуется минимально возмущенное рибосомное распределение по мРНК. Важно отметить, что подход подходит для стабилизации относительно лабильных и динамических компонентов поступательных комплексов, таких как eIF4A, и может широко использоваться при условии необходимой оптимизации. Мы также предоставили доказательства полезности фиксации формальдегида в сценариях быстрого динамического изменения трансляции, открывая области исследования, такие как быстро меняющиеся клеточные реакции на изменения окружающей среды или стрессовые условия.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Австралийского исследовательского совета Discovery Project (DP180100111 для T.P. и N.E.S),грантом Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (GNT1175388 to N.E.S.) и исследовательской стипендией (APP1135928 to T.P.). Авторы признают возможности Microscopy Australia в Центре передовой микроскопии Австралийского национального университета, который финансируется Университетом и федеральным правительством.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Дрожжевой экстракт	Merck, Sigma-Aldrich	70161
Пептон	Merck, Sigma-Aldrich	70178
D-глюкоза (декстроза)	Merck, Sigma-Aldrich	49139
Сульфат аденина	Amresco	0607-50G
Раствор формальдегида	Merck Sigma-Aldrich	F11635-500ML	Реагент ACS, 37 масс. % в H₂O, содержит 10-15% метанола в качестве стабилизатора (для предотвращения полимеризации)
RNaseOUT™ Рекомбинантный ингибитор рибонуклеазы	Invitrogen™ by Thermo Fischer Scientific	10777019
cOmplete™, коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТА	COEDTAF-RO Roche by Merck	11873580001
раствор хлорида магния	(Merck/Sigma-Aldrich)	M1028
Раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты	(Merck/Sigma-Aldrich)	E7889
Ambion™ РНКаза I, клонированная, 100 U/&микро; L	Ambion	AM2294
SUPERase• In™ Ингибитор РНКазы (20 U/μ L)	Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific	AM2694
Кислотный фенол:хлороформ:изоамиловый спирт 125:24:1 (pH 4,0-5,0)	(Merck/Sigma-Aldrich)	P1944-100ML
Dynabeads™ Goat Anti-mouse IgG	Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific)	11033
Ацетат натрия (3 M), pH 5,5	Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific)	AM9740
Гликоген (5 мг/мл)	Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific)	AM9510
Этиловый спирт, чистый	Merck; Sigma Aldrich	E7023
Amersham^™ Hybond^® P Western blotting мембраны, PVDF	Merck	GE10600023	PVDF мембрана для вестерн-блоттинга
Bolt™ от 4 до 12%, Bis-Tris, 1,0 мм, Mini Protein Gel	Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific	NW04120BOX	Protein gel
4X Bolt™ Буфер для образцов LDS	Invitrogen™ от ThermoFischer Sientific	B0007	Буфер для загрузки образцов LDS
Precision Plus Protein™ Калейдоскоп и торговля; Стандарты окрашенного белка	BioRad	1610375	Протеиновая лестница
20X Bolt™ MES SDS Бегущий буфер	ThermoFischer Scientific	B0002	PAGE runninjg буфер
Intercept® (ПБС) Блокирующий буфер	LI-COR	927-70001	Odyssey Blcoking buffer (PBS)
IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG Вторичное антитело	LI-COR	92632210
IRDye® 800CW Goat anti-rabbit IgG Вторичное антитело	LI-COR	92632211
TAP Tag Polyclonal Антитело	Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific	CAB1001
Анти-бета-актиновое антитело	Abcam	ab8227
Sucrose	(Merck/Sigma-Aldrich)	84097	BioUltra, для молекулярной биологии, ≥ 99,5% (ВЭЖХ)
DL-раствор дитиотреитола	(Merck/Sigma-Aldrich)	43816	BioUltra, для молекулярной биологии, ~1 M в H₂O
Шприц Terumo 1CC/мл	Terumo Шприц	878499
хлоридом калия	(Merck/Sigma-Aldrich)	60128
HEPES(	Merck/Sigma-Aldrich)	H3375
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - высокий уровень глюкозы	Sigma Aldrich	D5796
Фетальная бычья сыворотка	Sigma Aldrich	12003C
Trypsin-EDTA (0,05%), фенол красный	Gibco	25300062
Дульбекко Фосфатный буферный физиологический раствор с кальцием и магнием	Sigma-Aldrich	D8662
Глицин	Sigma-Aldrich	G7126
Трис гидрохлорид	Merck/Sigma-Aldrich	10812846001
Додецилсульфат натрия	Merck/Sigma-Aldrich	436143
IGEPAL CA-630	Merck/Sigma-Aldrich	I3021
Ингибитор рибонуклеазы Rnasin	Promega	N2111
Шлифовальный кувшин из нержавеющей стали	Retsch	02.462.0059
Смесительная мельница MM400	Retsch	20.745.0001
Градиентный ректификатор	Brandel	BRN-BR-188
Термомиксер R	Eppendorf	Z605271
Нанокапельный спектрофотометр	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
0,5-мл микроцентрифужные пробирки с блокировочными устройствами	Eppendorf Safe-Lock	30121023
Мини гелевый бак	(Thermo Fisher Scientific)	A25977	PAGE беговой бак
5 мл, ультрапрозрачная трубка с открытым верхом, 13 x 51 мм	Beckman-Coulter	344057
13,2 мл, сертифицированный бесплатный тонкостенный полипропилен с открытым верхом, 14 x 89 мм - 50 шт.	Beckman-Coulter	331372
	устройства для ультрафильтр	UFC5030	ации Amicon Ultra-0,5Мембрана из регенерированной целлюлозы Ultracel-30, объем образца 0,5 мл
Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge	Cambridge Scientific	15566
Beckman Coulter Optima L-90K	GMI	8043-30-1191
Nunc EasYFlask 175см2	Thermofisher Scientific	159910
Falcon 50 мл конические центрифужные пробирки	Thermofisher Scientific	14-432-22
Серологическая пипетка 25 мл	Sigma-Aldrich	SIAL1250
серологическая пипетка 10 мл	Sigma-Aldrich	SIAL1100
ДНК-лобиндовые пробирки	Eppendorf	30108051
холодная центрифуга 5810 R	Eppendorf	EP022628188	для пробирок 50 мл
Орбитальный трясущийся инкубатор	Ratek	OM11
Микроцентрифуга Frezco 17	Thermofisher Scientific	75002402
Eppendorf DNA lo-bind tubes	Merck/Sigma-Aldrich	EP0030108051
Eppendorf® Пробирки Protein LoBind	Merck/Sigma-Aldrich	EP0030108116
SW 41 Ti Качающийся ротор ведра	Beckman-Coulter	331362
Heracell™ 150i CO2 Incubator, 150 л	Thermofisher Scientific	51026282
0,3 мл ультратонкий II короткий инсулиновый шприц	BD Medical	328822
3 мл с наконечником Luer Lok	BD Medical
25 г x 16 мм игла для подкожных инъекций	Terumo	TUAN2516R1

302113

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Janapala, Y., Preiss, T., Shirokikh, N. E. Control of translation at the initiation phase during glucose starvation in yeast. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4043(2019).
Masvidal, L., Hulea, L., Furic, L., Topisirovic, I., Larsson, O. mTOR-sensitive translation: Cleared fog reveals more trees. RNA Biology. 14 (10), 1299-1305 (2017).
Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Molecular Biology of the Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
Crawford, R. A., Pavitt, G. D. Translational regulation in response to stress in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 36 (1), 5-21 (2019).
Melamed, D., Pnueli, L., Arava, Y. Yeast translational response to high salinity: global analysis reveals regulation at multiple levels. RNA. 14 (7), 1337-1351 (2008).
Hershey, J. W., Sonenberg, N., Mathews, M. B. Principles of translational control: An overview. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 011528(2012).
Mata, J., Marguerat, S., Bähler, J. Post-transcriptional control of gene expression: a genome-wide perspective. Trends in Biochemical Sciences. 30 (9), 506-514 (2005).
Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational regulation of gene expression during conditions of cell stress. Molecular Cell. 40 (2), 228-237 (2010).
Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 5 (3), 301-315 (2014).
Archer, S. K., Shirokikh, N. E., Beilharz, T. H., Preiss, T. Dynamics of ribosome scanning and recycling revealed by translation complex profiling. Nature. 535 (7613), 570-574 (2016).
Hinnebusch, A. G., Ivanov, I. P., Sonenberg, N. Translational control by 5'-untranslated regions of eukaryotic mRNAs. Science. 352 (6292), 1413-1416 (2016).
Dever, T. E., Green, R. The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (7), 013706(2012).
Shirokikh, N. E., Preiss, T. Translation initiation by cap-dependent ribosome recruitment: Recent insights and open questions. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 9 (4), 1473(2018).
Jiménez-Díaz, A., Remacha, M., Ballesta, J. P., Berlanga, J. J. Phosphorylation of initiation factor eIF2 in response to stress conditions is mediated by acidic ribosomal P1/P2 proteins in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 8 (12), 84219(2013).
Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
Majmundar, A. J., Wong, W. J., Simon, M. C. Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress. Molecular Cell. 40 (2), 294-309 (2010).
Barraza, C. E., et al. The role of PKA in the translational response to heat stress in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 12 (10), 0185416(2017).
Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. The heat shock response: Life on the verge of death. Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).
Jamar, N. H., Kritsiligkou, P., Grant, C. M. The non-stop decay mRNA surveillance pathway is required for oxidative stress tolerance. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6881-6893 (2017).
Chen, Z., et al. The complete pathway for thiosulfate utilization in Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology. 84 (22), (2018).
Marzluf, G. A. Molecular genetics of sulfur assimilation in filamentous fungi and yeast. Annual Review of Microbiology. 51, 73-96 (1997).
Miller, D., Brandt, N., Gresham, D. Systematic identification of factors mediating accelerated mRNA degradation in response to changes in environmental nitrogen. PLoS Genetics. 14 (5), 1007406(2018).
Zhang, W., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Regulation of sensing, transportation, and catabolism of nitrogen sources in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 82 (1), (2018).
Tokpohozin, S. E., Fischer, S., Becker, T. Selection of a new Saccharomyces yeast to enhance relevant sorghum beer aroma components, higher alcohols, and esters. Food Microbiology. 83, 181-186 (2019).
Walker, G. M., Stewart, G. G. Saccharomyces cerevisiae in the production of fermented beverages. Beverages. 2 (4), 30(2016).
Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15(2017).
Jin, H. Y., Xiao, C. An integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).
Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3889-3894 (2003).
Lackner, D. H., et al. A network of multiple regulatory layers shapes gene expression in fission yeast. Molecular Cell. 26 (1), 145-155 (2007).
Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-Wide Analysis in Vivo of Translation with Nucleotide Resolution Using Ribosome Profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. Ribosome Profiling: Global Views of Translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), (2019).
Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).
Hussmann, J. A., Patchett, S., Johnson, A., Sawyer, S., Press, W. H. Understanding biases in ribosome profiling experiments reveals signatures of translation dynamics in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences Genetics. 11 (12), 1005732(2015).
Santos, D. A., Shi, L., Tu, B. P., Weissman, J. S. Cycloheximide can distort measurements of mRNA levels and translation efficiency. Nucleic Acids Research. 47 (10), 4974-4985 (2019).
Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6 (3), 209-217 (2010).
Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: A tool for the study of chromatin complexes. Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
Kage, U., Powell, J. J., Gardiner, D. M., Kazan, K. Ribosome profiling in plants: What is not lost in translation. Journal of Experimental Botany. 71 (18), 5323-5332 (2020).
Shirokikh, N. E., Archer, S. K., Beilharz, T. H., Powell, D., Preiss, T. Translation complex profile sequencing to study the in vivo dynamics of mRNA-ribosome interactions during translation initiation, elongation and termination. Nature Protocols. 12 (4), 697-731 (2017).
Wagner, S., et al. Selective translation complex profiling reveals staged initiation and co-translational assembly of initiation factor complexes. Molecular Cell. 79 (4), 546-560 (2020).
Zlotorynski, E. Profiling ribosome dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (9), 535-535 (2016).
Sen, N. D., Gupta, N., S, K. A., Preiss, T., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Functional interplay between DEAD-box RNA helicases Ded1 and Dbp1 in preinitiation complex attachment and scanning on structured mRNAs in vivo. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8785-8806 (2019).
Zhao, J., Qin, B., Nikolay, R., Spahn, C. M. T., Zhang, G. Translatomics: The global view of translation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 20010212(2019).
Luthe, D. S. A simple technique for the preparation and storage of sucrose gradients. Analytical Biochemistry. 135 (1), 230-232 (1983).
Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Review Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends in Biochemical Sciences. 25 (3), 99-104 (2000).
Schmiedeberg, L., Skene, P., Deaton, A., Bird, A. A Temporal Threshold for Formaldehyde Crosslinking and Fixation. PLoS One. 4 (2), 4636(2009).
Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: A probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (19), 6470-6474 (1985).
Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping proteinDNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
Bohlen, J., Fenzl, K., Kramer, G., Bukau, B., Teleman, A. A. Selective 40S footprinting reveals cap-tethered ribosome scanning in human cells. Molecular Cell. 79 (4), 561-574 (2020).
Shirokikh, N. E. Translation complex stabilization on messenger RNA and footprint profiling to study the RNA responses and dynamics of protein biosynthesis in the cells. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. , (2021).
Giess, A., et al. Profiling of small ribosomal subunits reveals modes and regulation of translation initiation. Cell Reports. 31 (3), 107534(2020).
Firmino, A. A. P., et al. Separation and paired proteome profiling of plant chloroplast and cytoplasmic ribosomes. Plants (Basel). 9 (7), (2020).
Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Research. 42 (17), 134(2014).
Santos, D. A., Shi, L., Tu, B. P., Weissman, J. S. Cycloheximide can distort measurements of mRNA levels and translation efficiency. Nucleic Acids Research. 47 (10), 4974-4985 (2019).
Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6 (3), 209-217 (2010).
Plénat, F., et al. Formaldehyde fixation in the third millennium. Annales De Pathologie. 21 (1), 29-47 (2001).
Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
Wang, N. S., Minassian, H. The formaldehyde-fixed and paraffin-embedded tissues for diagnostic transmission electron microscopy: A retrospective and prospective study. Human Pathology. 18 (7), 715-727 (1987).
Grifo, J. A., et al. Characterization of eukaryotic initiation factor 4A, a protein involved in ATP-dependent binding of globin mRNA. Journal of Biological Chemistry. 257 (9), 5246-5252 (1982).
Li, Y. Commonly used tag combinations for tandem affinity purification. Biotechnology and Applied Biochemistry. 55 (2), 73-83 (2010).
Blum, S., et al. ATP hydrolysis by initiation factor 4A is required for translation initiation in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (16), 7664-7668 (1992).
Merrick, W. C. eIF4F: A Retrospective. Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).
Rogers, G. W., Komar, A. A., Merrick, W. C. eIF4A: The godfather of the DEAD box helicases. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 72, 307-331 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Быстрая фиксация in vivo и выделение трансляционных комплексов из эукариотических клеток

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи