Слюнные железы были предложены в качестве тканевого целевого участка для генной терапии, особенно в области вакцинации путем переноса генов. Мы демонстрируем доставку генов в модели нечеловеческих приматов, использующей ретроградную инфузию прилежащей артерии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Ретроградная инфузия рядовидной железы через проток Стенсена у нечеловеческого примата для векторной доставки генов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Слюнные железы являются привлекательной тканевой мишенью для генной терапии с многообещающими результатами, уже приводящими к испытаниям на людях. Они по своей природе способны секретить белки в кровоток и легко доступны, что делает их потенциально превосходными тканевыми участками для производства замещающих гормонов или вакцинации путем переноса генов. Предлагаемые методы доставки генов включают чрескожную инъекцию и ретроградную инфузию через слюнные протоки. Мы демонстрируем, как выполнять ретроградную инфузию слюнных желез (RSGI) у нечеловеческих приматов. Мы описываем важные анатомические ориентиры, включая идентификацию сосочка рядового, атравматический метод каннюляции и герметизации протока Стенсена с использованием основных стоматологических инструментов, полиэтиленовых трубок и цианоакрилата, а также соответствующую скорость инфузии. Хотя это наименее травматичный метод доставки, метод по-прежнему ограничен объемом, который может быть доставлен (<0,5 мл) и возможностью травмирования протока и железы. Мы демонстрируем с помощью рентгеноскопии, что инфузия может быть полностью доставлена в железу, и дополнительно демонстрируем иммуногистохимией трансдукцию типичного вектора и экспрессию доставленного гена.
Введение
В то время как слюнные железы хорошо известны своей экзокринной выработкой слюны, исследователи давно признали их способность секретировать белки непосредственно в кровоток1,что делает их потенциальной мишенью для генной терапии для системного введения, такого как заместительные гормоны или выработка антител. Фактически, слюнные железы предлагают несколько преимуществ по сравнению с другими тканевыми мишенями, такими как врожденная способность производить белки для секреции (недостаток свойств мышц), тяжелая инкапсуляция, которая может ограничить диффузию векторов, и хорошо дифференцированная ткань, обеспечивающая стабильность для неинтегрируемых векторов. Кроме того, в случае серьезного неблагоприятного события слюнные железы не являются критическими для жизни и могут быть удалены хирургическим путем. Хотя и не сразу интуитивно понятные, почтительные железы также легко доступны изо рта через их главный выделительный проток, проток Стенсена2.
Учитывая преимущества слюнной ткани для генной терапии, растет интерес к изучению этой тканевой мишени. Многочисленные исследования уже были проведены на моделях грызунов, соб и нечеловеческих приматов, и, по крайнеймере,одно клиническое испытание на людях проводится3,4,5. Для дальнейшего изучения и развития полезности этой тканевой мишени для целей генной терапии необходимо будет провести больше исследований приматов, не являющихся людьми. В этой статье описывается метод доступа к правоушным железам через проток Стенсена для доставки векторного гена трансдукции в модели нечеловеческих приматов. Чтобы наглядно продемонстрировать доставку инфузии и анатомию протока при его поступлении в железу, была проведена рентгеноскопия с использованием радиоконтраста. Для демонстрации успешной трансдукции вектора был использован векторный ген egfp серотипа Аденовируса 5 (Ad5). Ad5 является хорошо описанным вектором, способным пропускать слюноотделение. Хотя он слишком иммуногенен для конечного клинического использования, вектор Ad5 был выбран для этого демонстрационного исследования, чтобы обеспечить эффективную трансдукцию. Оценка производства улучшенного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) является хорошо описанным методом демонстрации успешной транскрипции и трансляции векторного гена после трансдукции и была сделана здесь.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры были выполнены в Медицинской школе Уэйк Форест Кларксон Кампус для исследований на животных. Были проведены консультации с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) по этическим соображениям, и подробная информация о процедурах была представлена на рассмотрение. Wake Forest IACUC одобрил наш протокол исследования, и все процедуры были выполнены в соответствии с утвержденным протоколом IACUC #A17-147.
1. Подготовка инфузионного устройства
- Разрежьте полиэтиленовую трубку размера 10 (PET10) на 25 см длиной с помощью ножниц.
- Марки PET10 на 1 см и 2 см с одного конца с помощью черного маркера.
- Предварительно засыпнуть 0,5 мл раствора Ad5-EGFP(10 9 вирусных частиц/мл) в шприц 1 мл (туберкулин).
- Сдвиньте немаркированный конец трубки ПЭТ10 над иглой 29-31 г, прикрепленной к шприцу. Как правило, эту задачу легче выполнять при увеличении.
- Вливать раствор в ПЭТ10 до полного наполнения пробирки (видимая капля на свободном конце).
- Используйте полные стандартные СИЗ, включая хирургические скрабы, халат с длинными рукавами, непроницаемые перчатки, хирургическую маску, защитный экран для лица, чепчик для волос и бахилы.
2. Подготовка животного
ПРИМЕЧАНИЕ: Макаки Cynomolgus были использованы для видеодемонструи. Анатомия других нечеловеческих и человеческих приматов очень похожа, и протокол должен быть переведен на другие виды.
- Вводят подкожно 0,05 мг/кг атропина за 15 мин до процедуры, чтобы свести к минимуму секрецию слюны и оптимизировать распределение и удержание инфузии.
- Обеспечить анестезию используют шприцы 5 мл с внутримышечной кетамином/мидазоламом (10-15 мг/кг кетамина и 0,01-0,05 мг/кг мидазолама). Подтвердите правильную анестезию, когда успокоенное животное теряет сознание и не может реагировать на раздражители.
3. Выполнение процедуры
- Используйте оральные втягивющие средства, чтобы затянуть открытый рот.
- Поместите резиновую прокладку одного конца втягивлятеля на твердое небо за верхними зубами на стороне рта, противоположной железе, которая будет вливаться. Поместите резиновую прокладку другого конца на нижнюю ковку с той же стороны, что и верхний втягиватель. Осторожно позвольте пружине втягивателя расшириться и открыть рот.
- Определите приотитный сосочек, отверстие протока Стенсена, на задней щеке, прилегающее к верхнему2-му моляру. Это лучше всего визуализировать с помощью зубных петель для увеличения.
- Осторожно расширьте сосося рядовой с оковальней конического расширителя. Лучше всего поместить точку расширителя в центр или отверстие сосочки, а затем осторожно повернуть его вперед и назад. Точка должна медленно входить в сосочек и расширять его примерно на 20 - 30 с мягкого вращения.
- Вставьте трубку PET10 в расширенный сосоц рядовой. Этого лучше всего достичь, удерживая отмеченный конец трубки PET10 пинцетом примерно на 0,5 см от дистального конца и осторожно вставляя кончик трубки в расширенный сосочек.
- Осторожно выдвигайте трубку, чему часто способствуют небольшие вращающиеся движения, чтобы помочь трубке скользить, с последующей корректировкой пинцета на 0,5 см проксимально к предыдущему захвату. Повторяйте это до тех пор, пока отметка 2 см не достигнет сосочка.
- Нанесите цианоакрилат на щеку вокруг сосочки и вставленной трубки и подождите, пока он высохнет (никакого конкретного количества не зафиксировано, достаточно, чтобы запечатать вход сосочки Стенсена). Это обычно занимает менее минуты и помогает запечатать околоушный сосочек и уменьшить разлив инфузии обратно в ротовую полость.
- Медленно нажимайте на содержимое шприца в течение 5 мин со скоростью 100 мкл/мин. Эта медленная скорость инфузии сводит к минимуму риск повреждения протоков из-за внезапного увеличения внутрипротокового давления.
- Оставьте PET10 на месте не менее чем на 5 мин после завершения инфузии. Держите проток герметичным и дайте настою остаться в приушной железе.
- Удалите PET10 с мягким сцеплением. Цианоакрилат будет свободно тянуть вместе с трубкой.
- Повторите шаги с 3.2 по 3.8 на противоположной стороне.
- Медленно высвобождайте пероральные ретракторы после того, как обе паротиды были введены и обе трубки PET10 удалены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура для обеих сторон должна занять менее 30 минут.
4. Постпроцедурный уход
- После завершения инфузии и декандуляции протока Стенсена наблюдайте за животными до тех пор, пока эффект анестезии не исчезнет (обычно между 20-30 мин после процедуры).
- Предложите животным напитки, а затем еду после того, как они полностью проснутся и возобновят рутинный уход.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Успешная процедура, трансдукция и транскрипция
На рисунке 1 показан примыкающий к2-му моляру на задней верхней щеке. На изображении также показано правильное размещение скобы для рта, один резиновый конец на твердом небе, а другой резиновый конец на ипсилатеральном клыке. На рисунке 2 показано изображение, взятое после успешного каннуляции сосочкового сосачка на отметке 2 см на PET10. На рисунке 3 пока...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описываем протокол ретроградной инфузии в приушную железу через проток Стенсена. Описанная методология предлагает руководство, которое потенциально может быть использовано исследователями, изучающими полезность слюнной ткани в качестве места для генной терапии и других применений.
Существует несколько критических шагов для обеспечения успеха процедуры. В первую очередь, все процедурные шаги должны быть выполнены аккуратно. Принудительное крепление рта может привести к подвывиху нижней...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотят поблагодарить г-на Кэгни Джентри за его аудиовизуальную поддержку в съемках процедуры. Мы также хотим поблагодарить медицинский центр Hefner VA за академическую поддержку в реализации этого проекта.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 500 &микро; L Шприцы U100 с иглами 30-го калибра | Becton Dickinson | 328466 | фиксированной иглой для меньшего количества отходов |
| Клей (например, Ethicon Dermabond) | Различные | цианоакрилатные клеи для герметизации и удержания трубки в протоке во время инфузии. | |
| Атропин инъекционный раствор | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Атропин инъек. 0,54 мг/мл |
| BD Ультратонкие инсулиновые шприцы 30 г | Walmart | N/A | Avilable в размерах 0,5 мл и 1,0 мл. |
| Цианоакрилат (медицинский клей) | Ethicon | DNX12 | Dermabond местный клей для кожи |
| Стоматологические петли со светом | Амазонки (DDP) | B012M3IV80 | Используется для улучшения визуализации сосочка протока Стенсена |
| Детский слезный расширитель | Surgipro | SPOI-137 | |
| Раствор кетамина для инъекций | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Кетазет для инъекций 100 мг/мл |
| Слезный расширитель | Surgipro | SPOI-132 | Используется для диалирования протока стензена. |
| Мидазолам раствор для инъекций | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Мидазолам инъек. 5 мг/мл |
| Пара ножниц | Amazon (DDP) | Н/Д | Используется для разрезания трубки PET10 |
| Полиэтиленовая трубка (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Трубка, соединяющая шприц 30G и вставляемая в воздуховод. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Используется для нанесения цианоакрилата на щеку |
| Полиэтиленовая трубка размера 10 (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | полиэтиленовая трубка низкой плотности |
| Открыватель рта для мелких животных | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Используется для удержания рта животного открытым. |
| Пинцет | Amazon (DDP) | N/A | Используется для вставки трубки PET10 в проток Стенсона |
| Хлорид цинка | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Включен в плазмидные инфузии ДНК |
Ссылки
- Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
- Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
- Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
- Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4(2017).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
- Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
- Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
- Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).
- Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
