Method Article

AAV Развертывание конструктов экспрессии на основе энхансеров In Vivo в мозге мыши

DOI:

10.3791/62650

⸱

March 31st, 2022

 ,  , 
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает новый анализ переходного энхансера-репортера на основе rAAV. Этот анализ может быть использован для индуцирования экспрессии in vivo, управляемой энхансерами, в мозге мыши.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Энхансеры являются связывающими платформами для разнообразного набора факторов транскрипции, которые управляют специфическими паттернами экспрессии ткане- и клеточных генов. Многочисленные средства оценки некодирующей ДНК и различных состояний хроматина оказались полезными для прогнозирования наличия энхансерных последовательностей в геноме, но проверка активности этих последовательностей и поиск органов и стадий развития, в которых они активны, является трудоемким процессом. Недавние достижения в области переносчиков аденоассоциированного вируса (AAV) позволили широко доставить трансгены в ткани мыши, что позволило проводить тестирование усилителей in vivo без необходимости трансгенного животного. Этот протокол показывает, как репортерная конструкция, которая выражает EGFP под контролем минимального промотора, который сам по себе не управляет значительным выражением, может быть использована для изучения паттернов активности последовательностей-усилителей кандидатов в мозге мыши. Упакованную AAV конструкцию репортера доставляют в мозг мыши и инкубируют в течение 1-4 недель, после чего животное приносят в жертву, а участки мозга наблюдают под микроскопом. EGFP появляется в клетках, в которых тестируемого энхансера достаточно для инициирования экспрессии генов, точно определяя местоположение и стадию развития, на которой энхансер активен в мозге. Стандартные методы клонирования, недорогая упаковка AAV и расширение серотипов AAV и методов доставки in vivo и стандартного считывания изображений делают этот подход доступным для изучения того, как экспрессия генов регулируется в мозге.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Энхансеры представляют собой геномные цис-регуляторные элементы, которые служат сайтами связывания транскрипционного фактора и могут стимулировать экспрессию гена-мишени пространственно-временнымспецифическим способом 1,2. Они дифференциально активны в различных типах клеток, тканях и стадиях развития и могут быть субстратами геномной вариации, связанной с риском заболевания 3,4. Таким образом, необходимость понимания динамики функции энхансера имеет решающее значение для прогресса как в трансляционных, так и в фундаментальных научных приложениях в ген....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Калифорнийского университета в Дэвисе (Протокол No 22339) и Институциональным комитетом по биобезопасности Калифорнийского университета в Дэвисе (BUA-R1903). Этот протокол был протестирован на мышах C57BL/6J обоих полов на послеродовой день 0-1.

1. Клонируйте последовательность-кандидат энхансера в векторную плазмиду AAV.

ПРИМЕЧАНИЕ: Приводятся репрезентативные протоколы, однако стратегия клонирования обладает высокой степенью гибкости.

  1. Выберите или спроектируйте конструкцию репортера. Здесь кандидат....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя эти методы, последовательность 915 bp в связанном с психиатрическим риском третьем интроне гена CACNA1C 19,49,50 была протестирована на энхансерную активность в постнатальном мозге мыши. Эта последовательность была обнаружена в MPRA из 345 последовательностей энхансеров-кандидатов, сосредоточенных на психиатрических и неврологических рисках SNP12, и эксперименты по характеристике описан.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает основанный на rAAV метод развертывания трансгенов, управляемых энхансерами, в постнатальном мозге мыши. В этом обобщенном протоколе энхансер-кандидат, минимальный промотор, репортерный ген и необязательная последовательность штрих-кода клонируются в плазмидную основу AAV. Эти эксперименты могут быть проведены с одной последовательностью-кандидатом энхансера или со многими последовательностями параллельно. Плазмида упаковывается в rAAV и доставляется в постнатальный мозг мыши. Через некоторое время.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Секвенирование проводилось в UC Davis DNA Technologies Core. Мы благодарим лабораторию Лин Тяня в Калифорнийском университете в Дэвисе за обучение упаковке rAAV и щедро дарим нам помощника AAV и плазмиды rep /cap. Эта работа была поддержана NIH/NIGMS R35GM119831.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x Цитратный буферSigma-AldrichC9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3'IntegratedDNA TechnologiesN/A: Специально разработанныйфорвардный праймер для проверки клонов после трансформации. Эти праймеры специфичны для используемого вектора и были разработаны для конкретного вектора, используемого в наших экспериментах.
5'-gatggctggcaactagaagg-3'IntegratedDNA TechnologiesN/A: Специально разработанныйобратный праймер для проверки клонов после трансформации. Эти праймеры специфичны для используемого вектора и были разработаны для конкретного вектора, используемого в наших экспериментах.
AgaroseVWRVWRVN605-500G
Аспиратор в сбореSigma-AldrichA5177-5EAдля доставки рААВ
Бактериологические чашки ПетриThermo Fisher Scientific08-757-100D
КарбенициллинSigma-AldrichC1389-5G
Курица IgY анти-GFPThermo Fisher ScientificA10262
Конфокальный микроскопZeissLSM900Изображения были сделаны на модели LSM800, но в последние годы компания Zeiss выпустила модель LSM900 для замены LSM800.
Конические центрифужные пробирки 15 млThermo Fisher Scientific12-565-269
CryomoldsThermo Fisher ScientificNC9806558Эти формы подходят для мозга мыши P28. Другие размеры могут быть более подходящими для больших или меньших тканей.
DAPISigma-AldrichD9542-10MG
Препарирующие ножницы, 4,5"VWR82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488Jackson ImmunoResearch703-545-155
Dulbecco's PBS 1xThermo Fisher ScientificMT21031CV
Eppendorf Микроцентрифужные пробирки 2,0 млThermo Fisher Scientific
Falcon круглодонные тубы 14 млThermo Fisher Scientific352059
Fast Green dyeGraingerF0099-1G
Набор мелких деталей малярных кистейArtbrush TowerB014GWCLFO
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S
Стеклянные капиллярные трубкиDrummond Scientific Company5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi KitQIAGEN12663Коммерческий набор для подготовки плазмиды
макси HyClone HyPure Molecular Biology Grade WaterVWRSH30538.03
Набор для внутривенного вливания бабочки с 12-дюймовой трубкой и иглой 25GThermo Fisher Scientific26708
KimwipesKimberly Clark34155Безворсовая салфетка
LB АгарThermo Fisher ScientificBP1425-500LB агар предварительная смесь для селективных сред
McPherson Vannas ирис ножницыIntegra LifeSciences360-215
Минеральное маслоSigma Life Science69794-500ML
NEB Stable Competent E. coliNEBC3040I
NucleoSpin Гель и ПЦР для очисткиTakara740609.5Набор для ферментативной реакции очистка и экстракция геля
OCT средаVWR25608-930
Орбитальный шейкерCole Parmer60-100
ПараформальдегидSigma-Aldrich158127-500G
ПЦР-стрип-пробирки 0,2 млVWR490003-692
Перистальтический насосGilsonF155005
Фосфатный буферный раствор (PBS) 10xThermo Fisher Scientific70011044
Phusion Hot Start II Высокоточная ДНК-полимеразаThermo Fisher ScientificF549L
Сухое молокоSunny Select
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36934
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28106
rCutSmart БуферNEBB6004SБуфер для рестрикционного расщепления с PacI, AscI и ферментом рестрикции XmaI
: AscINEBR0558L
Фермент рестрикции: PacINEBR0547L
Фермент рестрикции: XmaINEBR0180L
Среда роста SOCNEBB0920SСреда восстановления после трансформации
Сахароза ( Millipore Sigma033522.5KG
TAE буферApex20-194
Передаточная трубкаGilsonF1179941Для перистальтического насоса
Triton X100Sigma-AldrichX100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps Система очистки ДНКThermo Fisher ScientificA1460Plasmid mini prep kit
22431048

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

AAV DeliveryEnhancer TestingMouse BrainReporter ConstructEGFP ExpressionIn Vivo ExpressionGibson CloningBrain InjectionFluorescence ImagingSingle Cell RNA Sequencing

Related Articles