Методическая статья

Дифференцировка и поляризация макрофагов в M2-подобный фенотип с использованием клеточной линии лейкемии лейкемии человека, подобной THP-1

31.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62652

⸱

2 августа 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Price Institute of Surgical Research, Department of Surgery, University of Louisville

В этой статье

Краткое содержание

M2-подобные опухолеациоцировые макрофаги (TAM) связаны с прогрессированием опухоли и плохим прогнозом при раке. Этот протокол служит подробным руководством для воспроизводимой дифференцировки и поляризации моноцитоподобных клеток THP-1 в M2-подобные макрофаги в течение 14 дней. Эта модель является основой для исследования противовоспалительных эффектов ТАМ в микроокружении опухоли.

Аннотация

Опухолеассоциированная макрофаги (ТАМ) может переключать свою экспрессию и профиль цитокинов в соответствии с внешними раздражителями. Эта замечательная пластичность позволяет TAM адаптироваться к текущим изменениям в микроокружении опухоли. Макрофаги могут иметь в основном провоспалительные (M1-подобные) или противовоспалительные (M2-подобные) атрибуты и могут постоянно переключаться между этими двумя основными состояниями. M2-подобные макрофаги в опухолевой среде связаны с прогрессированием рака и плохим прогнозом при нескольких типах рака. Многие различные методы индуцирования дифференцировки и поляризации клеток THP-1 используются для исследования клеточных и межклеточных механизмов и эффектов ТАМ в микроокружении опухолей. В настоящее время не существует установленной модели поляризации М2-подобных макрофагов с использованием клеточной линии THP-1, а результаты экспрессии и профилей цитокинов макрофагов из-за определенных стимулов in vitro варьируются между исследованиями. Этот протокол служит подробным руководством для дифференцировки моноцитоподобных клеток THP-1 в макрофаги M0 и дальнейшей поляризации клеток в M2-подобный фенотип в течение 14 дней. Мы демонстрируем морфологические изменения моноцитоподобных клеток THP-1, дифференцированных макрофагов и поляризованных M2-подобных макрофагов с помощью световой микроскопии. Эта модель является основой для моделей клеточных линий, исследующих противовоспалительные эффекты ТАМ и их взаимодействия с другими клеточными популяциями микроокружения опухоли.

Введение

Опухолеассеоциированные макрофаги (TAM) и их роль в хроническом воспалении, возникновении рака и развитии опухоли являются важными целями в недавних исследованиях1,2. Моноциты периферической крови, которые рекрутируются в тканевую микросреду развивающейся опухоли, дифференцируются в макрофаги и могут быть поляризованы в два основных подтипа макрофагов3. Классически активированный макрофаг представляет собой преимущественно провоспалительный М1-подобный фенотип, а альтернативно активированный М2-подобный подтип проявляет преимущественно противовоспалительные характеристики4. Макрофаги могут динамически переключаться между этими двумя основными фенотипами в зависимости от их клеточного метаболизма, причем промежуточные подтипы имеют как воспалительные, так и противовоспалительные свойства5. TAM представляет собой гетерогенную популяцию обоих фенотипов. Опухоле-продуцирующие функции и плохой прогноз при различных видах рака, однако, особенно связаны с М2-подобными макрофагами6,7,8.

Функциональные профили макрофагов и их взаимодействие с другими клетками в микроокружении опухоли сложны и сложны для захвата в постоянно меняющейся среде во время продолжающегося развития опухоли. Клеточные линии могут обеспечить однородную клеточную популяцию со стабильной жизнеспособностью в культуре, что может облегчить процесс демонстрации определенных клеточных и межклеточных механизмов. Моноцито-подобная клеточная линия THP-1 является законной модельной системой для первичных моноцитов человека9. Эта спонтанно увековеченная клеточная линия была получена из периферической крови годовалого младенца с острым моноцитарным лейкозом9,10. Дифференцировка и поляризация клеток THP-1 были зарегистрированы в нескольких исследованиях и были выполнены несколькими различными способами11, 12,13,14. Активация и, следовательно, поляризация макрофагов в М1-подобный фенотип сопровождается компенсаторным противовоспалительным механизмом отскока, способствующим М2-подобному фенотипу через цитокины, продуцируемые воспалительными макрофагами, такими как интерлейкин 6 (IL-6) или итаконат15,16. Это может служить механизмом разрыва для ослабления чрезмерной воспалительной реакции после активации клеток17. Процесс дифференцировки и поляризации моноцитов и моноцитоподобных клеток THP-1 в противовоспалительный М2-подобный фенотип сам по себе также сопровождается провоспалительными раздражителями, которые необходимо преодолеть. Воспалительный цитокиновый ответ может быть вызван механическим напряжением18,таким как изменение среды для повторного наполнения клеток или добавление химических соединений для дифференцировки клеток THP-1, таких как форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA), и индуцировать выработку фактора некроза опухоли α (TNFα), интерлейкина 1β (IL-1β) или IL-619. Этот измененный профиль экспрессии цитокинов в ответ на PMA может влиять и предотвращать последующую поляризацию макрофагов20. Адекватные периоды покоя, как сообщалось ранее после лечения ПМА, позволяют этим воспалительным реакциям уменьшаться и облегчают поляризацию клеток в отдельный M2-подобный фенотип21.

Этот протокол демонстрирует метод дифференцировки и поляризации моноцитоподобных клеток THP-1 в M2-подобный фенотип макрофагов в течение 14 дней.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор шагов, описанных в этом протоколе, показан на рисунке 1. Была приобретена клеточная линия моноцитоцитарного лейкоза человека THP-1. Был проведен короткий тандемный повторный анализ для аутентификации клеточной линии THP-1. Выполняйте все шаги в стерильных условиях. Моноцитарная клеточная линия THP-1 растет во суспензии и не прикрепляется к поверхностям клеточных культур. Адгезия может быть индуцирована путем дифференцировки моноцитов в макрофагоподобные клетки посредством, например, механического напряжения или специфического леченияПМА.

1. Культивирование и поддержание моноцитоподобных клеток THP-1

  1. Установите таймер на 150 с. Извлеките замороженный флакон, содержащий клеточную линию THP-1(Таблица материалов),из жидкого азота и немедленно разморозьте его на бане с чистой водой (37 °C). Запустите таймер, как только флакон будет помещен в водяную баню. Ослабьте крышку, чтобы освободить давление, которое накапливается из-за процесса оттаивания, но убедитесь, что отверстие трубы не контактирует с водой, чтобы избежать загрязнения. Оптимальный период времени для оттаивания клеток лежит между 120-150 с. Продолжайте размораживать клеточную суспензию до тех пор, пока во флаконе не останется ледяной чип размером около 4 мм; затем немедленно перейдите к следующему шагу.
  2. Перенесите жидкую фазу клеточной суспензии в трубку объемом 15 мл, содержащую 9 мл теплой (37 °C) рыхлой среды роста(Таблица материалов). Затем переложите 1 мл теплой среднеклеточной суспензии во флакон THP-1 и обратно в трубку 15 мл, чтобы растопить оставшийся ледяной чипс и промыть флакон, чтобы убедиться, что клетки не останутся позади.
  3. Осторожно перемешайте суспензию, пипеткой вверх и вниз пипеткой 1000 мкл. Удалите небольшой образец (примерно 10 мкл), чтобы подсчитать клетки на жизнеспособность (используя трипан синий для исключения), пока они вращаются. Открутите теплую клеточную суспензию при 200 х г в течение 7 мин при 37 °C.
  4. Удалите супернатант полностью и повторно суспендировать с определенным объемом теплой питательной среды для достижения плотности клеток 5 х 105/мл. Аккуратно перемешайте суспензию и переложите 22 мл объема в колбы для культивирования клеток Т-75(Таблица материалов). Храните колбы в вертикальном положении в инкубаторе при 37 °C с концентрацией 5% углекислого газа (CO2). Обменивайся питательными средами каждые 3-4 дня.

2. Посев клеток THP-1 и дифференцировка в макрофаги M0

  1. Подготовьте клетку, содержащую питательную среду с соответствующей плотностью клеток, к семенным клеткам при плотности 3х 10 5/мл / хорошо в 24-скважинные пластины длякультивовкиклеток ( Таблица материалов ). Аккуратно перемешайте среду и приготовьте аликвоты по 26 мл, каждая из которых помещена в пробирку по 50 мл. Используйте каждую аликвоту 26 мл для посева клеток в соответствующую пластину.
  2. Перенесите 1 мл клеточно-содержащей среды в каждую скважину 24-скважинной пластины. Осторожно перемешайте жим, пипетируя вверх и вниз между передачами.
  3. Готовят запасной раствор ПМА (растворяют 1 мг ПМА в 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) = ~16 мМ раствора ПМА в ДМСО) и разбавляют его холодным фосфатным буферизованным физиологическим раствором (ПБС) до конечной рабочей концентрации 10 нг/мкл непосредственно перед обработкой клеток(Таблица материалов). Держите раствор на льду и немедленно используйте его. Не замораживая повторно. Добавьте 100 нг PMA на скважину. Оставьте каждую клеточную пластинку в инкубаторе без какой-либо дальнейшей обработки в течение 72 ч.
  4. Через 72 ч удалить питательную среду и заменить ее 1 мл свежей питательной среды. Не прикасайтесь к дну колодцев наконечниками пипеток. Дайте клеткам отдохнуть еще 96 ч в инкубаторе.
  5. Через 96 ч повторите шаг 2.4 (смена носителя) и дайте ячейкам отдохнуть еще 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Макрофаги M0 теперь готовы к использованию для экспериментов(рисунок 2). Непосредственно перед обработкой клеток в рамках дальнейших экспериментов рассмотрите изменение среды только с RPMI(Таблица материалов),поскольку добавки питательных сред могут вызывать помехи реагентам, которые добавляются для обработки клеток. В случае, если необходимы М2-подобные макрофаги, переходите к разделу 3.

3. Поляризация макрофагов М0 в М2-подобные макрофаги

  1. Готовят запасной раствор IL-4 и IL-13 (растворяют 20 мкг IL-4 или IL-13 в 200 мкл воды без нуклеазы) и разбавляют его до конечной рабочей концентрации 2 нг/мкл с PBS непосредственно перед обработкой клеток. Держите раствор на льду и немедленно используйте его. Не замораживая повторно.
  2. Удалите питательную среду и замените ее 1 мл свежей питательной среды. Добавьте 20 нг интерлейкина 4 (IL-4) и 20 нг интерлейкина 13 (IL-13) на скважину. Дайте клеткам отдохнуть в течение 48 ч в инкубаторе.
  3. Через 48 ч повторите шаг 3.2. Дайте клеткам отдохнуть еще 48 ч в инкубаторе.
  4. Удалите питательную среду и замените ее 1 мл свежей питательной среды. Дайте клеткам отдохнуть в течение 48 ч в инкубаторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: M2-подобные макрофаги теперь готовы к использованию для экспериментов(рисунок 2). Непосредственно перед обработкой клеток в рамках дальнейших экспериментов рассмотрите изменение среды только с RPMI(Таблица материалов),поскольку добавки питательных сред могут вызывать помехи.

4. Отсоединение и сбор макрофагов для проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте механический метод, сочетающий холодное шокирование и соскоб клеток для отсоединения и сбора поляризованных макрофагов из пластин для проточной цитометрии.

  1. Удалить теплую клеточную среду и заменить ее смесью ледяного PBS (без кальция и магния) и 5% фетальной бытовой сыворотки (FBS), 1 мл на скважину. Сразу после этого поместите клеточную пластину на лед на 45 мин. Не помещайте клеточную пластину на лед до удаления теплой клеточной среды, так как это значительно снизит жизнеспособность клеток. Держите клетки на льду только после того, как индуцирует холодный шок ледяной смесью PBS/5% FBS.
  2. Через 45 мин на льду соскоблите ячейки с помощью мини-скребков(Таблица материалов). Осторожно перенесите отделивые макрофаги в холодном PBS/5% FBS в пробирку с 15 мл. Держите трубку на льду все время, пока клетки не будут окрашены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объедините восемь колодцев клеток для достижения адекватного количества клеток для окрашивания.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Были охарактеризованы M2-подобные макрофаги, и M2-поляризация была подтверждена с использованием проточной цитометрии для cluster of Differentiation markers (CD) CD14, CD11b, CD80 (M1-подобный маркер) и CD206 (M2-подобный маркер). Окрашивание проточной цитометрией проводилось в соответствии с инструкциями производителя. Макрофаги промывали PBS/5% FBS и инкубировали с блоком Fcγ-рецепторов, чтобы избежать неспецифического связывания. Затем клетки окрашивали FITC-конъюгированных мышиными античеловеческими антителами CD14 и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол дифференцировки и поляризации моноцитоподобных клеток THP-1 в течение 14 дней обеспечивает метод получения макрофагов с отчетливым М2-подобным фенотипом за счет длительной инкубации клеток с адекватными периодами покоя между этапами.

Определенные шаги имеют решающее значение для этого протокола. Время удвоения моноцитов THP-1 составляет примерно 26 ч. Клетки могут быть разделены при плотности клеток 9 x 105/mL и должны быть засеяны при плотности 3 x 105/mL в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии потенциальных конфликтов интересов.

Благодарности

Институт хирургических исследований Прайса, Университет Луисвилля, финансово поддерживается Фондом Джона У. Прайса и Барбары Трастон Этвуд Прайс. Источники финансирования не играют никакой роли в разработке и проведении исследования, а также в сборе, управлении, анализе и интерпретации данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,4% трипановый синийVWR, Раднор, США152-5061
1,5 мл микроцентрифужная пробиркаСША Scientific, Окала, США1615-5510
10 мл серологическая пипеткаVWR, Раднор, США  89130-898
1000 μ L TipOne наконечники для пипетокСША Scientific, Окала, США1111-2821
15 мл  Центрифуга пробиркаVWR, Раднор, США89039-664
20 μ L TipOne наконечники для пипетокСША Scientific, Окала, США1120-1810
200 μ L TipOne пипеточные наконечникиСША Scientific, Окала, США1120-8810
25 мл серологическая пипеткаVWR, Раднор, США  89130-900
5 мл серологическая пипеткаVWR, Раднор, США  89130-896
50 мл Центрифужная пробиркаVWR, Раднор, США89039-662
Раствор аккутазы 500 млSigma, Сент-Луис, СШАA6964
Антимикотический раствор антибиотика (100x), стабилизированныйSigma, Сент-Луис, СШАA5955-100 млс 10 000 единиц пенициллина, 10 мг стрептомицина и 25 мкм; г амфотерицина B на мл, стерильно-отфильтрованный, биореагент, подходит для клеточной культуры
Связующее CO2 IncubatorVWR, Раднор, СШАC170-ULE3
CytoOne T-75cm колба с фильтрующей крышкойСША Scientific, Окала, СШАCC7682-4875
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер (PBS)Sigma, Сент-Луис, СШАD8537-500 млPBS без хлорида кальция и хлорида магния, так как оба могут изменять поляризацию макрофагов
Eppendorf Centrifuge 5804 R (охлажденный)Eppendorf, Enfield, США-Этиловый
спирт (70%)-
FACSКалибурский проточный цитометрBD Biosciences, Сан-Диего, США-Проточный цитометр работает с программным обеспечением CellQuest (BD Biosciences)
Falcon 24-well plateVWR, Radnor, США353504
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)ATCC, Манассас, США30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14BD Biosciences, Сан-Диего, США 555397Проточная цитометрия, маркер миелоидных клеток (100 тестов)
FITC Mouse Anti-Human CD80BD Pharmingen, Сан-Диего, США557226Проточная цитометрия, маркер M1 (100 тестов)
FITC Mouse IgG1 κ Контроль изотипаBD Pharmingen, Сан-Диего, США 555748Проточная цитометрия, контроль изотипа для CD80 (100 тестов)
FITC Mouse IgG2a, κ Контроль изотипаBD Biosciences, Сан-Диего, США 553456Проточная цитометрия, контроль изотипа для CD14 (100 тестов)
Человек BD Fc BlockBD Biosciences, Сан-Диего, США564220Проточная цитометрия, Fc-блок (0,25 мг)
Интерлейкин человека 13 (IL-13)R& D, Миннеаполис, СШАИЛ-771-10 g
Человеческий интерлейкин 4 (IL-4)R& D, Миннеаполис, СШАSRP3093-20 μ g
Шкаф биобезопасности Labconco (серия Delta 36212/36213)Labconco, Канзас-Сити,
Solution, 200 mMATCC, Манассас, США30-2214
Липополисахарид (ЛПС) из E. coli 0111:B4Sigma, Сент-Луис, СШАL2630-100 мг
Мини-клеточные скребкиBiotium, Фримонт, США22003
Neubauer гемоцитометрFisher Scientific, Уолтем, США02-671-5
Nikon Eclipse инвертированный микроскоп TS100Nikon, Мелвилл, США-Нуклеаза
водаInvitrogen, Карлсбад, СШАAM9937
Olympus Световой микроскоп RH-2Микроскоп Центральный, Фистервилль, США40888
P10 переменная пипетка - GilsonVWR, Раднор, США76180-014
P1000 вариабельная пипетка-GilsonVWR, Radnor, США76177-990
P200 вариабельная пипетка-GilsonVWR, Radnor, США76177-988
PE Мышь Anti-Human CD11bBD Biosciences, Сан-Диего, США 555388Проточная цитометрия, маркер миелоидных клеток (100 тестов)
PE Mouse IgG1, κ Контроль изотипаBD Biosciences, Сан-Диего, США555749Проточная цитометрия, контроль изотипа для CD11b (100 тестов)
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206BD Pharmingen, Сан-Диего, США 551136Проточная цитометрия, маркер M2 (100 тестов)
PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Контроль изотипаBD Pharmingen, Сан-Диего, США555750Проточная цитометрия, контроль изотипа для CD206 (100 тестов)
Phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA)Sigma, Сент-Луис, СШАP8139
Пипеттор Powerpette PlusVWR, Раднор, США75856-448
Прецизионная водяная баня (модель 183)Precision Scientific, Чикаго, США66551
RPMI-1640 MediumATCC, Манассас, США30-2001
THP-1 клеточная линия, Американская коллекция типовых культур (ATCC)ATCC, Манассас, СШАTIB-202
США-L-Glutamine

Ссылки

  1. Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273(2019).
  2. Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
  3. Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582(2018).
  4. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
  5. Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
  6. Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
  7. Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
  8. Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
  9. Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438(2016).
  10. The American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021).
  11. Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721(2020).
  12. Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577(2015).
  13. Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601(2018).
  14. Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
  15. Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
  16. O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
  17. Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
  18. Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3(2019).
  19. Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
  20. Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
  21. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668(2010).
  22. Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097(2017).
  23. Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687(2013).
  24. Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393(2019).
  25. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
  26. Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

M2THP 1CD14CD2064

Похожие статьи