Визуализация образования мембранных оборок с помощью сканирующей электронной микроскопии

Summary

Макропиноцитоз представляет собой высококонсервативный эндоцитарный процесс, инициируемый образованием F-актин-богатых листообразных мембранных проекций, также известных как мембранные оборки. Повышенная скорость макропиноцитотической интернализации растворенного вещества была вовлечена в различные патологические состояния. Этот протокол представляет собой метод количественной оценки образования мембранных оборок in vitro с использованием сканирующей электронной микроскопии.

Abstract

Взъерошение мембраны представляет собой образование подвижных выступов плазматической мембраны, содержащих сетку из вновь полимеризованных актиновых нитей. Оборки мембран могут образовываться спонтанно или в ответ на факторы роста, воспалительные цитокины и сложные эфиры форбола. Некоторые из протрузий мембраны могут реорганизоваться в круглые оборки мембраны, которые сливаются на своих дистальных краях и образуют чашечки, которые закрываются и отделяются в цитоплазму в виде больших, гетерогенных вакуолей, называемых макропиносомами. Во время процесса оборки захватывают внеклеточную жидкость и растворенные вещества, которые интернализируются в макропиносомах. Сканирующая электронная микроскопия с высоким разрешением (SEM) является широко используемым методом визуализации для визуализации и количественной оценки образования мембранных оборков, круговых выступов и закрытых макропиноцитарных чашек на поверхности клетки. Следующий протокол описывает условия клеточной культуры, стимуляцию образования мембранных рюшей in vitro, а также способы фиксации, обезвоживания и подготовки клеток к визуализации с использованием SEM. Также описана количественная оценка взъерошивания мембраны, нормализация данных, а также стимуляторы и ингибиторы образования мембранных рюшей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о роли макропиноцитоза в физиологических и патологических процессах, исследовать новые мишени, регулирующие образование мембранных оборок, и выявить еще не охарактеризованные физиологические стимуляторы, а также новые фармакологические ингибиторы макропиноцитоза.

Introduction

Макропиноцитоз представляет собой эндоцитарный процесс, ответственный за интернализацию большого количества внеклеточной жидкости и ее содержания путем образования динамических и актин-управляемых протрузий плазматической мембраны, называемых мембранными оборками¹. Многие из этих мембранных оборок образуют чашечки, которые закрываются и сливаются обратно в клетку и отделяются от плазматической мембраны в виде больших, гетерогенных внутриклеточных эндосом, также известных как макропиносомы¹. Хотя макропиноцитоз индуцируется факторами роста, такими как макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) и эпидермальный факт....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведен общий протокол, используемый для количественной оценки образования мембранных оборков в макрофагах RAW 264.7 с использованием микроскопии SEM. Оптимизация может потребоваться для различных типов клеток.

1. Клеточная линия и клеточная культура

1. Выращивайте макрофаги RAW 264,7 в модифицированной орлиной среде (DMEM) Dulbecco, дополненные 10% (об/об) термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂. Заменяйте питательные среды через день.
2. Когда клетки станут на 80% сливающимися, промыть пл....

Results

Здесь мы опишем результаты представленной методики. Репрезентативные изображения SEM, показанные на рисунке 1 , демонстрируют образование мембранных оборок в макрофагах RAW 264.7 после обработки PMA и M-CSF. Изображения были сначала сделаны с увеличением 3 500x для целей количественной оценки, а затем на более высоких уровнях увеличения (от 8 500x до 16 000x), чтобы показать плазматическую мембрану в более деталях. Предварительная обработка макрофагов ингибитором макропиноцитоза EIPA ослабля.......

Discussion

Настоящий протокол визуализации SEM предоставляет инструмент для визуализации и количественной оценки образования мембранных оборок, круговых выступов и макропиноцитарных чашек на поверхности клетки in vitro. Хотя текущий протокол фокусируется на макрофагах, исследования показали, что образование мембранных оборков также происходит на различных других типах клеток, включая дендритные клетки, фибробласты, нейроны и раковые клетки 11,12,14,21,30.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5% Трипсин-ЭДТА	Gibco	15400-054
2% Глутаральдегид	Электронная микроскопия	Sciences 16320
4% Параформальдегид	Santa Cruz Biotechnology	281692
5-(N-этил-N-изопропил)-амилорид	Sigma Life Science	A3085
Accuri C6 Проточный цитометр
Углеродные адгезивные таблетки	Электронная микроскопия Науки	77825-09
Диметилсульфоксид	Corning	25-950-CQC
Модифицированный Eagle Medium Dulbecco	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24-луночный прозрачный плоскодонный обработанный TC многолуночный клеточный культуральный планшет	Falcon	353047
фетальная сыворотка крупного рогатого скота	Gemini Bio	900-108
FitC-декстран	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i CO2 инкубатор	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Model 6.2 Распылитель Coater	Anatech США	58565
JSM-IT500HR сканирующий электронный микроскоп
Чехол для микроскопа	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
Ручка стрептококк	Gibco	15140-122
форбол 12-миристат 13-ацетат	Миллипоры Sigma	524400
RAW 264,7 макрофаг	ATCC	ATCC TIB-71
Рекомбинантный M-CSF человека	Peprotech	300-25
Samdri-790 Сушилка для критических точек	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM Алюминиевые крепления для образцов	Электронная микроскопия	Науки 75220
Какодилат натрия	Электронная микроскопия Науки	12300
Техас red-dextra	Thermo Fisher Scientific	D1864
Трипан синий раствор	Thermo Fisher Scientific	15250061
			Zeiss LSM 780