Визуализация образования мембранных оборок с помощью сканирующей электронной микроскопии

Макропиноцитоз представляет собой эндоцитарный процесс, ответственный за интернализацию большого количества внеклеточной жидкости и ее содержания путем образования динамических и актин-управляемых протрузий плазматической мембраны, называемых мембранными оборками¹. Многие из этих мембранных оборок образуют чашечки, которые закрываются и сливаются обратно в клетку и отделяются от плазматической мембраны в виде больших, гетерогенных внутриклеточных эндосом, также известных как макропиносомы¹. Хотя макропиноцитоз индуцируется факторами роста, такими как макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) и эпидермальный фактор роста (EGF) в широком диапазоне типов клеток, дополнительный уникальный, кальций-зависимый процесс, известный как конститутивный макропиноцитоз, также наблюдался во врожденных иммунных клетках 2,3,4,5,6,7,8.

Было показано, что способность клеток интернализировать внеклеточный материал посредством макропиноцитоза играет важную роль в различных физиологических процессах, начиная от поглощения питательных веществ до захвата патогенов и представления антигена ^9,10,11. Однако, поскольку этот процесс является неселективным и индуцируемым, он также был вовлечен в ряд патологических состояний. Действительно, предыдущие исследования показали, что макропиноцитоз играет важную роль в болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, раке, нефролитиазе и атеросклерозе 12,13,14,15,16. Кроме того, было показано, что некоторые бактерии и вирусы используют макропиноцитоз, чтобы проникнуть в клетки-хозяева и вызвать инфекцию^17,18. Интересно, что стимуляция макропиноцитоза может быть также использована для адресной доставки терапевтических средств при различных заболеваниях^19,20.

Предыдущие исследования изучали макропиноцитоз путем количественной оценки интернализованных флуоресцентно помеченных маркеров жидкой фазы в отсутствие и присутствие фармакологических агентов, которые ингибируют макропиноцитоз с использованием проточной цитометрии и конфокальной визуализации^21,22. Доступные в настоящее время фармакологические средства, ингибирующие макропиноцитоз, ограничены и включают в себя 1) ингибиторы полимеризации актина (цитохалазин D и латрункулины), 2) блокаторы PI3K (LY-290042 и wortmannin) и 3) ингибиторы теплообменников натрия водорода (NHE) (амилорид и EIPA)5,14,15,23,24,25 . Однако, поскольку эти ингибиторы обладают независимыми от эндоцитоза эффектами, трудно выборочно определить вклад макропиноцитоза в поглощение растворенного вещества и патогенез заболевания, особенно in vivo²¹.

Сканирующая электронная микроскопия (SEM) - это тип электронного микроскопа, который производит изображения клеток со сверхвысоким разрешением с использованием сфокусированного пучка электронов²⁶. В исследованиях макропиноцитоза визуализация SEM рассматривается как метод золотого стандарта для визуализации топографических и морфологических характеристик плазматической мембраны, количественной оценки образования мембранных оборок и исследования их прогрессирования в направлении интернализации макропиносом. Кроме того, сканирующая электронная микроскопия в сочетании с количественной оценкой поглощения растворенного вещества в присутствии и отсутствии блокаторов макропиноцитоза обеспечивает надежную стратегию для изучения интернализации макропиноцитотического растворенного вещества in vitro. В этой статье представлен подробный протокол о том, как подготовить клетки к SEM, визуализировать поверхность клеток, количественно оценить образование рюшей и изучить их прогресс в направлении закрытия чашки и интернализации макропиносом.

ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведен общий протокол, используемый для количественной оценки образования мембранных оборков в макрофагах RAW 264.7 с использованием микроскопии SEM. Оптимизация может потребоваться для различных типов клеток.

1. Клеточная линия и клеточная культура

1. Выращивайте макрофаги RAW 264,7 в модифицированной орлиной среде (DMEM) Dulbecco, дополненные 10% (об/об) термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂. Заменяйте питательные среды через день.
2. Когда клетки станут на 80% сливающимися, промыть пластину два раза, используя стерильный PBS.
3. Отделяют клетки путем добавления 1000 мкл 0,5% трипсина-ЭДТА и инкубируют пластину культуры клеток в течение 3-5 мин в увлажненном инкубаторе при 37 °C.
4. Исследуйте пластину под световым микроскопом, чтобы подтвердить диссоциацию клеток. Добавьте 10 мл питательной среды, содержащей 10% FBS, чтобы инактивировать трипсин.
5. Собрать клеточную суспензию в коническую трубку объемом 50 мл и центрифугу при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Осторожно повторно суспендируйте клетки в полной питательной среде клеток и определите количество клеток и жизнеспособность с помощью окрашивания Trypan Blue (0,4%).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая минимальная жизнеспособность клеток для этого эксперимента составляет >90%.
6. Поместите стерильные стеклянные крышки в колодцы из 24-луночной пластины с помощью автоклавных щипцов. Засейте клетки на покровные листы плотностью 1 х 10⁶ клеток/мл и инкубируйте пластину в течение ночи в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂.
7. Перед обработкой замените среду каждой лунки на свежую полную среду объемом 500 мкл. Предварительно обработать макрофаги носителем (ДМСО или другими растворителями, используемыми для растворения EIPA) или ингибитором макропиноцитоза 5-(N-этил-N-изопропил)-Амилоридом (EIPA, 25 мкМ²¹) в течение 30 мин.
8. Обрабатывайте клетки носителями и стимуляторами макропиноцитоза для содействия взъерошению мембран: форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA, 1 мкМ, 30 мин²¹) и макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF, 100 нг/мл, 30 мин³).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные ингибиторы [например, латрункулин А (1 мкМ, 30 мин) или цитохалазин D (1 мкМ, 30 мин)] и стимуляторы [например, эпидермальный фактор роста (EGF, 100 нг/мл, 10 мин) или тромбоцитарный фактор роста (PDGF, 100 нг/мл, 15 мин)] макропиноцитоза могут также использоваться для характеристики макропиноцитоза в макрофагах и других типах клеток^{16,27, 28,29.} Клеткам может потребоваться ночное сывороточное голодание перед лечением физиологическими стимуляторами макропиноцитоза. Важно отметить, что наиболее эффективные концентрации и время инкубации должны быть определены для стимуляции макропиноцитоза в других типах клеток.

2. Фиксация SEM

1. После обработки дважды аспирируйте среду из колодцев и промывайте крышки ледяными ПБС.
2. Фиксируют клетки (4% параформальдегида и 2% глутаральдегида в 0,1 М какодилата натрия) в течение 30 мин при комнатной температуре с последующей ночной инкубацией в фиксаторе при 4 °С.
3. Аккуратно промыть и инкубировать покровы с 500 мкл следующих реагентов, не нарушая клеточный монослой.
   1. Промыть однократно в 0,1 М какодилата натрия и инкубировать в течение 15 мин.
   2. Дважды промыть с dH₂O с 10 мин инкубации в каждой стирке.
   3. Дважды промыть 25% этанолом с 10 мин инкубации в каждой промывке.
   4. Дважды промыть 50% этанолом с 10 мин инкубации в каждой промывке.
   5. Дважды промыть 75% этанолом с 10 мин инкубации в каждой промывке.
   6. Дважды промыть 80% этанолом с 10 мин инкубации в каждой промывке.
   7. Дважды промыть 95% этанолом с 10 мин инкубации в каждой промывке.
   8. Дважды промыть 100% этанолом. Выполняйте 10 мин инкубации в каждой стирке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замена/замена реагентов должна производиться быстро, чтобы предотвратить высыхание клеток на воздухе. Покровные листы можно оставлять в 100% этаноле в течение нескольких дней при 4 °C. Для длительного хранения добавьте дополнительно 100% этанол и накройте колодцы парапленкой, чтобы предотвратить воздушную сушку образца.

3. Сушка в критической точке

1. Поместите крышки в сушилку критической точки и накройте 100% этанолом. Нажмите кнопку питания и откройте резервуар CO₂ .
2. Нажимайте кнопку Cool в течение примерно 30 с, пока температура не снизится до 0 °C. Нажимайте кнопку «Заполнить», пока в окне камеры не появится пузырь.
3. Нажимайте кнопку Purge до тех пор, пока запах этанола из выхлопных газов продувки не исчезнет. Нажмите кнопку Cool еще раз, пока температура не снизится до 0 °C.
4. Нажмите кнопки «Заполнить» и «Очистить », чтобы выключить их и закрыть резервуар CO₂ . Нажмите кнопку Cool , чтобы выключить ее, и нажмите кнопку Heat .
5. Установите температуру на уровне 42 °C и давление на уровне 1 200 фунтов на квадратный дюйм. Как только давление и температура стабилизируются, нажмите кнопку «Выпуск за обрез », чтобы давление медленно снижалось.
6. Как только давление в камере достигнет 150 фунтов на квадратный дюйм, нажмите кнопку Vent и подождите, пока давление не снизится до 0 фунтов на квадратный дюйм. Выключите сушилку в критической точке и снимите крышки.
7. Монтируйте обшивки на алюминиевые крепления SEM с помощью карбоновых клеевых вкладок и подвергайте напылянию покрытия с использованием золота / палладия в напыляющемся покрытии.
8. Включите кнопку питания и подождите, пока вакуум не достигнет 30 мТорр. Промывайте камеру, чтобы удалить влагу и воздух, выключив газовый выключатель и повернув газовый клапан Fine против часовой стрелки.
9. Как только вакуум увеличится до 200 мТорр выключите газовый выключатель и подождите, пока вакуум не достигнет 30 мТорр. Повторите этот шаг 3 раза.
10. Нажмите кнопку «Таймер» и отрегулируйте ручку напряжения до тех пор, пока датчик не покажет 10 мА. Снимите покрытые оболочкой чехлы из камеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям производителя для выполнения сушки в критических точках и напыления покрытия образца.

4. Визуализация и количественная оценка

1. Вставьте образцы крышки в камеру сканирующего электронного микроскопа. Закройте дверь и нажмите кнопку Evac .
2. Откройте операционное программное обеспечение SEM. Установите ускоряющее напряжение на 15 кВ и рабочее расстояние на 10 мм.
3. Нажмите кнопку «Координаты» и перемещайтесь вокруг контроллера, пока ячейки не появятся в центре экрана наблюдения. Установите увеличение в 3 500 раз и создайте образец, нажав кнопку «Фото».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте более высокий уровень увеличения (от 8 500x до 16 000x), чтобы показать плазматическую мембрану более подробно.
4. Делайте снимки по крайней мере из 10 случайных мест на крышках, убедившись, что каждое микроскопическое поле содержит несколько клеток. Сохраняйте изображения в виде .tif файлов.
5. На снимках найдите мембранные оборки, определяемые как выступающие одеялоподобные складки плазматической мембраны, размером более 500 нм (рисунок 1). Подсчитайте количество оборок на ячейку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С-образные оборки были идентифицированы как изогнутые мембранные выступы, которые не сливались на их боковых концах [(Рисунок 1 (обработка M-CSF) и Рисунок 2B]. Плавленые кольцевые мембранные оборки до их закрытия были идентифицированы как макропиноцитотические чашки (рисунок 2C).
6. Нормализуйте количество оборок мембраны до общего числа клеток в оцениваемом микроскопическом поле. Повторите этот анализ для образцов из каждой группы.

Здесь мы опишем результаты представленной методики. Репрезентативные изображения SEM, показанные на рисунке 1 , демонстрируют образование мембранных оборок в макрофагах RAW 264.7 после обработки PMA и M-CSF. Изображения были сначала сделаны с увеличением 3 500x для целей количественной оценки, а затем на более высоких уровнях увеличения (от 8 500x до 16 000x), чтобы показать плазматическую мембрану в более деталях. Предварительная обработка макрофагов ингибитором макропиноцитоза EIPA ослабляет образование мембранных оборков (фиг.1). Активность плазматической мембраны, связанная с макропиноцитозом, может быть разделена на пять последовательных этапов: 1) инициирование взъерошения мембраны, 2) циркуляризация, 3) образование чашечек, 4) закрытие чашечки и 5) интернализация внеклеточной жидкости и связанных с ней растворенных веществ через образование макропиносом. На рисунке 2 показаны репрезентативные изображения этих морфологически различных активностей плазматической мембраны после стимуляции M-CSF. Большие листовидные оборки (рисунок 2A), круглые С-образные оборки (рисунок 2B) и макропиноцитарные чашечки (рисунок 2C) были захвачены с увеличением от 6000x до 7000x. Сканирующая электронная микроскопия может быть использована для получения изображений поверхности клетки с высоким разрешением, но не может быть использована для визуализации интернализованных макропиносом. Количественная оценка мембранных оборок после обработки PMA и M-CSF показана на рисунке 3. Образование макропиносом может быть подтверждено альтернативными методами визуализации, включая конфокальную микроскопию, как показано на рисунке 4. Наконец, количественная оценка SEM мембранного взъерошения должна быть дополнена количественной оценкой проточной цитометрии флуоресцентного жидкофазного маркера (например, FITC- или техасского красного декстрана) для подтверждения стимуляции макропиноцитоза (рисунок 5).

Рисунок 1: Сканирующая электронная микроскопия изображений макрофагов RAW 264.7. Макрофаги RAW 264.7 предварительно обрабатывали транспортным средством (dmso control) или EIPA (25 мкМ) в течение 30 мин и инкубировали с PMA (1 мкМ, 30 мин) или M-CSF (100 нг/мл, 30 мин) для стимуляции взъерошивания мембраны. Изображения справа показывают более высокое увеличение поверхности клетки. Красные стрелки: мембранные оборки. Зеленая стрелка: с-образная оборка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Морфологические стадии макропиноцитоза, фиксируемые сканирующей электронной микроскопией. Макрофаги RAW 264.7 обрабатывали M-CSF (100 нг/мл) в течение 30 мин, а клетки обрабатывали для визуализации SEM. (A) листовая мембранная протрузия, (B) С-образная мембранная оборка и (C) макропиноцитарная чашечка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Количественная оценка образования мембранных оборок. Макрофаги RAW 264.7 предварительно обрабатывали транспортным средством (dmso control) или EIPA (25 мкМ) в течение 30 мин и инкубировали с PMA (1 мкМ, 30 мин) или M-CSF (100 нг/мл, 30 мин) для стимуляции взъерошивания мембраны. Гистограмма показывает количество оборок мембраны, нормализованных до общего числа клеток (n = 3). Данные представляют собой среднее ± SEM. Односторонняя ANOVA; *p < 0,05 против транспортного средства, #p < 0,05 против лечения PMA или M-CSF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Образование макропиносом. Клетки предварительно обрабатывали ПМА в течение 30 мин и инкубировали техасским красным декстраном (25 мкг/мл, красный) и FM4-64 (5 мкг/мл, зеленый) в течение 10 мин. Визуализация проводилась с помощью конфокального микроскопа. Синие стрелки: взъерошивание мембраны, желтые стрелки: макропиносомы, содержащие техасский красный декстран, зеленые стрелки: макропиносомы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Количественная оценка макропиноцитоза. Макрофаги RAW 264.7 предварительно обрабатывали транспортным средством (контроль DMSO) или EIPA (25 мкМ) в течение 30 мин и инкубировали с PMA (1 мкМ) и FITC-декстраном (100 мкг/мл; 70 000 МВт) в течение 2 ч. Гистограмма показывает изменение средней интенсивности флуоресценции (MFI), нормализованное для обработки транспортного средства (n = 3, выполненное в трех экземплярах). Данные представляют собой среднее ± SEM. Односторонняя ANOVA; *p < 0,05 против автомобиля, #p < 0,05 против PMA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.