Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Рост, очистка и титрование онколитического вируса простого герпеса

7.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62677

⸱

13 мая 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunotherapeutics and Biotechnology, Jerry H. Hodge School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Molecular Neurosurgery Laboratory and the Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой рукописи мы описываем простой метод роста, очистки и титрования онколитического вируса простого герпеса для доклинического использования.

Аннотация

Онколитические вирусы (ОВ), такие как онколитический вирус простого герпеса (oHSV), являются быстро растущей стратегией лечения в области иммунотерапии рака. ОВ, включая oHSV, избирательно реплицируются и убивают раковые клетки (щадя здоровые / нормальные клетки), одновременно индуцируя противоопухолевый иммунитет. Из-за этих уникальных свойств стратегии лечения на основе oHSV все чаще используются для лечения рака, доклинически и клинически, включая одобренный FDA талимоген лагерпаревек (T-Vec). Рост, очистка и титрование являются тремя основными лабораторными методами для любых ОВ, включая oHSV, прежде чем их можно будет использовать для экспериментальных исследований. В этой статье описывается простой пошаговый метод усиления oHSV в клетках Vero. Когда oHSV размножаются, они производят цитопатический эффект (CPE) в клетках Vero. Как только 90-100% инфицированных клеток показывают CPE, их аккуратно собирают, обрабатывают бензоназой и хлоридом магния (MgCl2),фильтруют и подвергают очистке с использованием метода сахарозы-градиента. После очистки количество инфекционных oHSV (обозначенных как бляшеобразующие единицы или PФУ) определяется с помощью «анализа бляшек» в клетках Vero. Протокол, описанный в настоящем описании, может быть использован для получения высокотитерного запаса oHSV для исследований in vitro в клеточной культуре и экспериментов in vivo на животных.

Введение

Онколитические вирусы (ОВ) являются новой и уникальной формой иммунотерапии рака. ОВ избирательно реплицируются и лизируют опухолевые клетки (щадя нормальные/здоровые клетки)1, индуцируя противоопухоляющий иммунитет2. Онколитический вирус простого герпеса (oHSV) является одним из наиболее широко изученных вирусов среди всех ОВ. Он находится дальше всего в клинике, причем Talimogene laherparepvec (T-VEC) является первым и единственным OV, получившим одобрение FDA в США для лечения прогрессирующей меланомы3. В дополнение к T-VEC, многие другие генетически модифицированные oHSV тестируются доклинически и клинически при различных типах рака3,4,5,6,7,8. Современная передовая рекомбинантная биотехнология ДНК еще больше повысила возможность разработки новых oHSV-кодирования для терапевтических трансгенов3,5. Эффективная система распространения, очистки и определения титра oHSV имеет решающее значение до того, как любой (недавно разработанный) oHSV может быть протестирован для исследований in vitro и in vivo. В данной работе описывается простой пошаговый метод роста oHSV (в клетках Vero), очистки (методом сахарозы-градиента) и титрования (путем анализа oHSV-бляшек в клетках Vero)(рисунок 1). Он может быть легко принят в любых лабораторных условиях уровня биобезопасности 2 (BSL2) для достижения высококачественного вирусного запаса для доклинических исследований.

Vero, африканская зеленая обезьянья клеточная линия почек, является наиболее часто используемой клеточной линией для распространения oHSV9,10,11,12,13, поскольку клетки Vero имеют дефектный противовирусный интерфероновый сигнальныйпуть 14. Другие клеточные линии с инактивированным стимулятором передачи сигналов генов интерферона (STING) также могут быть использованы для роста oHSV12,13. Этот протокол использует клетки Vero для роста oHSV и анализа бляшек. После размножения oHSV-инфицированные клетки собирают, литизируют и подвергают очистке, при этом лизированные клетки сначала обрабатывают нуклеазой бензоназы для деградации ДНК клеток-хозяев, предотвращения агрегации нуклеиновых кислот-белков и снижения вязкости клеточного лизата. Поскольку правильная активация бензоназы часто требуетMg 2+,1-2 мМ MgCl2 используется в этомпротоколе 15. Обломки клеток-хозяев из обработанного бензоназой клеточного лизата дополнительно удаляются путем последовательной фильтрации перед высокоскоростным центрифугированием градиента сахарозы. Вязкая подушка из 25% раствора сахарозы помогает обеспечить более медленную скорость миграции вируса через слой сахарозы, оставляя компоненты, связанные с клетками-хозяевами, в супернатанте, тем самым улучшая очистку и ограничивая потерю вируса в грануле16. Очищенный oHSV затем титруется на клетках Vero, а вирусные бляшки визуализируются окрашиванием Giemsa17 или окрашиванием X-gal (для LacZ, кодирующей oHSV)18.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1) рост oHSV

ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечить одобрение институционального комитета по биобезопасности до начала работы с oHSV. Это исследование проводилось в соответствии с утвержденным Протоколом IBC No 18007. Соблюдайте меры предосторожности BSL2: отбеливайте все пипетки, наконечники, трубки и другие материалы, которые вступают в контакт с вирусом. Распылите перчатки с 70% изопропиловым спиртом перед руками покинуть вытяжку для культивовки клеток BSL2. Всегда тщательно мойте руки с мыльной водой после работы с вирусом.

  1. На 1-й день семена низкопроходных клеток Веро в 20 Т-150см2 колбы при плотности 7-8 × 106 клеток/колбу в обычной клеточной среде Веро.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среда Vero получают путем добавления модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) 10% термоинфактивированной сывороткой для телят плода (IFCS).
  2. На 0-й день (клетки на 80-90% сливаются) добавляют инокулят oHSV на клетки Vero.
    1. Приготовление вируса инокулят
      1. Используйте кратность инфекции (MOI) 0,01 (MOI может варьироваться от 0,01 до 0,1 в зависимости от репликационной способности вируса) для амплификации вируса. Используйте формулу(1)для расчета количества вируса (мл) на 20 колбы.
        Количество вируса (мл) на 20 колбы = количество необходимого вируса (pfu)/титр запаса вируса (pfu/mL)(1)
      2. Используйте высокоглюкоузный фосфатно-буферный физиологический раствор Dulbecco (DPBS), дополненный 1% IFCS для приготовления инокулята вируса (7 мл на Т-150см2 колбы, т.е. ~ 140 мл на 20 колб). Добавьте необходимое количество oHSV в 140 мл высокоглюкозаглекового раствора DPBS/1% IFCS, вихрь в течение 1 мин и держите смесь готовой к добавлению к клеткам Vero.
    2. Промыть колбы Т-150 см2x с высоким содержанием глюкозы DPBS, дополненной 1% МФХБ (10 мл/промывка). Аспирировать DPBS/1% МФХБ и добавить 7 мл вирусной инокулята/Т-150см2 колбы.
    3. Аккуратно раскачивают колбы в течение 5 мин с помощью колбы-коромысла для правильного распределения инокулята по монослою Веро, а затем инкубируют колбы при 37 °C в течение 1,5-2 ч. Убедитесь, что полка инкубатора ровная.
    4. Удалить инокуляту и добавить ДМЭМ, дополненный 1% МФХК (25 мл/колба). Высиживать колбы в течение 2-4 дней.
  3. Ежедневно проверяйте колбы на 90-100% CPE (см. Рисунок 2).
  4. Соберите oHSV-инфицированные vero клетки.
    1. Соберите супернатант культуры (~20 мл) из каждой колбы (оставьте ~5 мл в каждой колбе) в 50 мл конических центрифужных трубок или контейнера для среды.
    2. Используйте скребок для клеток, чтобы аккуратно соскоблить ячейки со дна колб.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быстро отрываться от колбы.
    3. Добавьте ~15 мл супернатанта культуры (собранного на этапе 1.4.1) в каждую колбу (что приносит объем ~20 мл в каждую колбу, т.е. 400 мл на 20 колбы) и осторожно промыть дно колбы несколько раз, используя 10 мл стерильного серологического пипетка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не пипететь энергично. Стремитесь сохранить все клетки нетронутыми.
    4. Соберите клетки (+ среда) в конические центрифужные трубки по 50 мл на льду (используйте 8 трубок для хранения 400 мл собранных клеток из 20 колб).
    5. Раскрутите клетки при 300 г в течение 10 мин при 4 °C и аспирировать супернатант.
    6. Добавить 1,25 мл (50%) вирусного буфера (VB) и 1,25 мл (50%) супернатанта культуры (собранного на этапе 1.4.1) в каждую трубку центрифуги и тщательно суспендировать каждую гранулу. Перенесите повторно взвешенные ячейки из восьми 50 мл центрифужных трубок в одну коническую центрифужную трубку 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. приготовление раствора VB в таблице 1. Фильтруйте раствор VB с помощью фильтра для стерилизации среды. Используйте 0,5 мл VB + 0,5 мл супернатанта на Т-150см2 колбы для повторной суспензии, т.е. для 20 колб (20 мл), используйте 10 мл VB и 10 мл культивального супернатанта.
    7. Заморозьте повторно взвешенные ячейки с использованием сухого льда / 100% этанола и храните при -80 °C.

2) очистка oHSV

  1. Замораживание (в сухом льду и 100% этаноле)/оттаивание (на теплой водяной бане 37 °C) клеток с последующей водной баней-ультразвуком в течение 1 мин в общей сложности 3 цикла для обеспечения надлежащего лизиса клеток для высвобождения вируса в супернатанте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте ультразвук в течение 1 мин, используя мощность 40 кГц, 120 В. Если перестраиваемый ультразвуковой ультракабельный ультразвуковой аппарат для водяной бани недоступен. Возьмите аликвоту 50 мкл для титрования в разделе 3, которая поможет определить, какой из следующих этапов (шагов) отвечает за потенциальную потерю вируса во время процедуры очистки.
  2. Обработать клеточный лизат нуклеазой бензоназы (175 единиц/мл) + 2 мМ MgCl2 (1 М запас = 2 мкл/мл), вихрем и инкубировать в течение 30 мин при 37 °C. Поместите трубку на лед и выполните следующие действия при 4 °C.
  3. Гранулирование клеточного мусора низкоскоростным центрифугированием.
    1. Раскрутите клетку лисатом при 300 г в течение 10 мин.
    2. Соберите супернатант в новую коническую центрифужную трубку емкостью 50 мл (повторно суспендируйте ячейку гранулы в 0,5 мл VB, обозначьте ее как гранулу-1 и храните при 4 °C для использования на этапе 2.3.5; см. Рисунок 1).
    3. Раскрутите супернатант (полученный на этапе 2.3.2) снова при 500 г в течение 10 мин.
    4. Соберите супернатант в новую коническую центрифужную трубку емкостью 50 мл (повторно суспендируйте ячейку гранулы в 0,5 мл VB, обозначьте ее как гранулу-2 и храните при 4 °C для использования на этапе 2.3.5; см. Рисунок 1).
    5. Смешайте повторно суспендированную гранулу-1 (от 2.3.2) и гранулу-2 (от 2.3.4) в новую центрифужную трубку 1,7 мл, вихревую/ультразвуковую (водяную баню) 2x и вращаем при 400 г в течение 10 мин. Соберите супернатант и объедините его с супернатантом, полученным на шаге 2.3.4; см. рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте ультразвуковую работу в течение 1 мин, используя мощность 40 кГц, 120 В для предотвращения вирусной агрегации перед процедурой фильтрации на этапе 2.4. Возьмем 50 мкл аликвоты комбинированного супернатанта для титрования в разделе 3.
  4. Фильтруйте комбинированный супернатант (~21 мл, т.е. 20 мл из 1,4,6, 0,5 мл из 2,3,2 и 0,5 мл из 2,3,4) с использованием следующего 3-ступенчатого метода фильтрации.
    1. Дотяните 21 мл супернатанта с помощью шприца 10 мл (каждый раз по 5-7 мл для легкого прохождения через фильтр) и пропустите его через стерильный мембранный фильтр из поливинилидендифторида (PVDF) размером 50 мл, помещенный на новую коническую центрифужную трубку 50 мл (обозначенную как TUBE 1).
      1. Добавьте 1 мл VB в 50 мл конической центрифужной трубки, опорожненной в 2.4.1 (для сбора оставшегося количества супернатанта вируса), и пройдите через тот же 5-мкм PVDF-фильтр, размещенный на TUBE 1 (в результате чего общее количество фильтрата составит 22 мл). Перейдите к шагу 2.4.2.
    2. Вытяните 22 мл фильтрата из TUBE 1 (как в 2.4.1) и пропустите его через стерильный мембранный фильтр смешанного эфира целлюлозы (MCE) 0,8 мкм, помещенный на новую коническую центрифужную трубку 50 мл (маркированную как TUBE 2).
      1. Добавьте 1 мл VB в ТРУБУ 1, опорожненную на этапе 2.4.2, вихревую, и пропустите ее через тот же фильтр MCE 0,8 мкм, размещенный на TUBE 2 (в результате чего общее количество фильтрата составит 23 мл). Перейдите к шагу 2.4.3.
    3. Вытяните 23 мл фильтрата из TUBE 2 (как в 2.4.1) и пропустите его через стерильный ПВДФ-фильтр 0,45 мкм, размещенный на новой конической центрифужной трубке 50 мл (обозначенной как TUBE 3).
      1. Добавьте 1 мл VB в ТРУБУ 2, опорожненную на этапе 2.4.3, вихревую, и пропустите ее через тот же 0,45 мкм PVDF-фильтр, размещенный на TUBE 3 (в результате чего общее количество фильтрата составит 24 мл).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите 50 мкл аликвоты фильтрата для титрования в разделе 3.
  5. Высокоскоростное центрифугирование методом сахарозы-градиента
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовался ротор с фиксированным углом F13-14x50cy. Как ротор, так и центрифуга должны находиться при 4 °C, прежде чем приступать к следующим шагам.
    1. Добавьте 10 мл ледяного, стерильно-фильтрованного 25% раствора сахарозы (приготовленного путем растворения 25 г порошка сахарозы в 100 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка) в новую 50 мл коническую центрифужную трубку.
    2. Медленно (3 мл/мин) добавляют 24 мл фильтрата вируса (полученного из этапа 2.4.3.1) поверх слоя сахарозы. Позаботьтесь о поддержании отдельных слоев фильтрата вируса и раствора сахарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: До 30 мл вирусного слоя может быть добавлено более 10 мл раствора сахарозы.
    3. Центрифугировать пробирку в течение 90 мин при 22,620 г при 4 °C.
    4. Удалите супернатант и слой сахарозы из конической центрифужной трубки 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула вируса должна быть беловатой. Возьмем 50 мкл аликвоты супернатанта и 50 мкл аликвоты слоя сахарозы для титрования в разделе 3.
  6. Повторно суспендируют гранулы в 10% растворе глицерина/ПБС.
    1. Добавьте 1 мл стерильного 10% глицерина (разбавленный в PBS) в 50 мл конической центрифужной трубки для покрытия гранулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество повторно суспензированной смеси может варьироваться (например, 0,8-1,2 мл) в зависимости от размера гранул. Меньший объем даст более высокую концентрацию вируса.
    2. Поместите коническую центрифужную трубку 50 мл на лед на 2-4 ч. В течение этого периода вышивайте / вихрь гранулы каждые 15 минут в течение 30 с, чтобы помочь выбить / повторно приостановить гранулу.
    3. Соберите повторно суспендированную гранулу (1 мл 10% глицерина / PBS + размер гранулы доведет общий объем до ~ 1,3 мл) в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл. [Необязательно: Добавьте еще 0,3 мл 10% глицерина/PBS в ту же 50 мл коническую центрифужную трубку для сбора оставшегося количества следов гранулы, пипеткой вверх и вниз и соедините с повторно суспендированной гранулой на этапе 2.6.3, чтобы довести общий объем до ~1,6 мл.]
      1. Если суспензия на этапе 2.6.3 мутная или мутная (из-за остатков клеток), центрифугируют трубку при 500 г в течение 10 мин, переложите супернатант в новую микроцентрифужную трубку 2 мл и перейдите к этапу 2.6.4.
    4. Возьмите аликвоту 50 мкл для титрования oHSV в разделе 3. Аликвотировать остальную часть раствора (250 мкл/аликвот) в стерильные микроцентрифужные трубки с винтовыми колпачками (хорошо герметизированными для длительного хранения), заморозить и хранить при -80 °C до использования (готовы к экспериментальным исследованиям после определения титра oHSV).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы, которые вступают в контакт с вирусом, должны быть отбелено или обработаны ультрафиолетовым излучением перед удалением из вытяжки или утилизацией.

3. титрование oHSV и анализ бляшек

  1. Семена 1,7-1,8 х 105 клеток Vero/скважина в 6-скважинной клеточной культурной пластине в клеточной среде Vero (DMEM с 10% IFCS; см. этап 1.1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клетки однородно распределены по всей скважине; не закручивайте пластину, что может вызвать скопление клеток в середине колодцев. Чтобы предотвратить закрутку, медленно раскачивайте пластину вручную вертикально, затем горизонтально, а затем аккуратно поместите пластину в инкубатор.
  2. На следующий день (когда клетки достигают 70-80% конфлюентности) аспирируют культурную среду и добавляют 1 мл/гольцо высокоглюкого PBS, дополненного 1% МФХБ. Оставьте пластину в вытяжке для культивирований клеток до завершения шага 3.3.
  3. Последовательно разбавляют вирус в 5 мл полипропиленовых пробирок с использованием PBS/1% IFCS(рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте аликвоту 50 мкл, собранную на этапе 2.6.4, для последовательного разбавления. В1-ю пробирку (10-3 разведения) добавляют 2 мкл вируса в 1998 г. мкл PBS/1%IFCS, вихревой. Во2-й пробирке (10-5 разведение) берут 10 мкл из 1-й пробирки в 990 мкл PBS/1% IFCS, вихревом. В3-й пробирке (10-6 разведение) берут 100 мкл из2-й пробирки в 900 мкл PBS/1% IFCS, вихревом; продолжайте это 10-кратное последовательное разведение до 10-9 разведения. Подробности см. на рисунке 3.
  4. Аспирировать PBS/1% МФХБ и добавлять 0,7 мл/хорошо последовательно разбавленный вирус (начиная с 10-5 до 10-9)к клеткам Vero.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не дайте клеткам высохнуть.
  5. Аккуратно покачайте пластину на коромысле в течение 5 мин при комнатной температуре (для обеспечения однородного распределения вируса инокулята).
  6. Инкубировать пластину в течение 1,5 ч при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого инкубационного периода готовят 1:1000 разведения человеческого иммуноглобулина G (IgG) в DMEM, дополненном 1% IFCS. Для плиты с 6 скважинами подготовьте 12,5 мл, чтобы на этапе 3,7 можно было использовать 2 мл/скважину. Отрегулируйте разбавление, чтобы учесть вариации партии в IgG человека.
  7. Удалить вирусный инокулят из скважин и добавить 2 мл/0,1% человеческого IgG (для нейтрализации oHSV в культуральной среде и предотвращения образования вторичных бляшек) в DMEM, дополненный 1% IFCS. Инкубировать пластину при 37 °C в течение 3-4 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прозрачные бляшки обычно образуются через 3 дня.
  8. Крепежные и окрашивающие пластины
    1. Удалите супернатант и зафиксируйте клетки в чистом метаноле (1 мл/лунка) в течение 5 мин. Удалите метанол и дайте пластинам высохнуть на воздухе.
    2. Разбавьте пятно Giemsa (1:5) деионизированной водой и добавьте 1 мл разбавленного пятна Giemsa на скважину. Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 10-15 мин.
    3. Удалите пятно, промойте водопроводной водой и дайте пластинам высохнуть на воздухе.
    4. Подсчитайте бляшки с помощью рассекающего микроскопа.
    5. Опционально для oHSV с выражением lacZ:
      1. Удалите супернатант и зафиксируйте клетки холодным 0,2% глутаровым альдегидом/2% параформальдегидом в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
      2. Удалите фиксаторный раствор и промыть ячейки 3x PBS.
      3. Добавьте раствор X-gal в ячейки (1 мл/хорошо) и инкубируют пластину при 37 °C в течение 2 ч.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Пятно X-gal должно быть приготовлено свежим в день окрашивания; длительное хранение может привести к выцветание цвета. Смотрите приготовление раствора X-gal в таблице 1.
      4. Удалите пятно X-gal и промойте пластину водопроводной водой в течение 1 мин.
      5. Противопоставляемое окрашивание нейтральным красным раствором (1 мл/колодец) в течение 2 мин при комнатной температуре.
        ПРИМЕЧАНИЕ: См. приготовление нейтрального красного раствора в таблице 1.
      6. Промыть тарелку водопроводной водой в течение 1 мин; дайте пластинам высохнуть на воздухе.
      7. Подсчитайте синие бляшки с помощью рассекающего микроскопа(рисунок 4).
  9. Вычисление титра по формуле (2)
    Титр в пФУ/мл = Количество бляшек/0,7 мл × коэффициент разбавления (2)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если в разбавляемом колодке 10-9 обнаружено 25 бляшек, титр составляет 25/0,7 ×10 9 = 35,7 ×10 9 = 3,57 × 1010 pfu/мл. Это заключительный титр аликвот oHSV, подготовленный на этапе 2.6.4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Краткий обзор всего протокола показан на рисунке 1,который представляет критические этапы, связанные с ростом, очисткой и титрованием oHSV. CPE в клетках Vero может быть обнаружен уже через 4 ч после ВПГ-инфекции19. Рисунок 2 демонстрирует CPE в клетках Vero в трех различных временных точках после инфекции oHSV. Уровень CPE увеличивается с течением времени. В этом протоколе 90-100% CPE обычно наблюдается в течение 48 ч после инокуляции с ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол начинается с роста oHSV в низкопролетных клетках Vero. Слияние монослоя клеток Vero должно составлять ~ 80% во время инокуляции вируса, так как разросшиеся клетки могут развивать плотные волокнистые структуры, которые могут уменьшить проникновение oHSV в клетки Vero20. После наблюдения 90-100% CPE супернатант культуры удаляют, клетки собирают, повторно суспендируют в VB/супернатанте (см. шаг 1.4.6), замораживают и хранят при -80 °C для последующей очистки. Блахо и его коллеги использовали...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

SDR является соавтором патентов, относящихся к онколитическим вирусам простого герпеса, принадлежащих и управляемых Джорджтаунским университетом и Массачусетской больницей общего профиля, которые получили роялти от Amgen и ActiVec Inc. и вступают в Научно-консультативный совет EG 427. Другим авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Исследования в лаборатории Saha частично поддерживались средствами DoD (W81XWH-20-1-0702) и Dodge Jones Foundation-Abilene. Сэмюэл Д. Рабкин и Мелисса Р.M. Хамфри были частично поддержаны NIH (R01 CA160762).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,7 мл центрифужные пробиркиSigmaCLS3620
15 мл полипропиленовые центрифугиFalcon352097
5 мл полипропиленовые пробиркиFalcon352063
50 мл полипропиленовые центрифугиFalcon352098
6-луночные клеточные культурные планшетыFalcon353046
бензоназа НуклеазаSigmaE8263-25KU
Скребокдля клеток Fisher Scientific179693
ДиметилсульфоксидSigmaD2650-100ML
Dulbecco' s Модифицированный Eagle MediumCorningMT-10-013-CV
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буферCorningMT-21-031-CV
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаГиклонSH3007003
Giemsa StainSigmaG3032
ГлутаральдегидFisher Scientific50-262-23
ГлицеринSigmaG5516
Сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS)CorningMT-21-021-CV
Дульбекко с высоким содержанием глюкозы s Фосфатно-солевой буферSigmaD4031
Иммуноглобулин человекаGamastanNDC 13533-335-12
Хлорид магнияFisher ChemicalM33-500
Фильтр для стерилизации среды, 250 млNalgene, Fisher Scientific09-740-25E
Фильтр для стерилизации среды, 500 млNalgene, Fisher Scientific09-740-25C
Нейтральный красный растворSigmaN4638
ПараформальдегидFisher научный  15710S
Пластинчатое коромыслоFisher88861043
Феррицианид калияSigmaP8131
Ферроцианид калияSigmaP9387
Хлорид натрияFisher ChemicalS271-3
Sorvall ST 16R ЦентрифугаThermoFisher Scientific75004381
Sorvall ST 21R ЦентрифугаThermoFisher Scientific75002446
стерильные микроцентрифужные пробирки с завинчивающимися крышкамиFisher Scientific02-681-371
СахарозаFisher ScientificBP220-1
Шприцевой фильтр, 0,45 PVDFMilliporeSigmaSLHV033RS
шприцевой фильтр, 0,8 MCEMilliporeSigmaSLAA033SS
Фильтр для шприцев, 5 & микро; m PVDFMilliporeSigmaSLSV025LS
T150 колба для культурыFalcon355001
Tris-HClMP Biomedicals LLC816116
Ультразвуковая водяная баняBransonCPX-952-116R
X-galCorning46-101-RF

Ссылки

  1. Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
  2. Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
  3. Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
  4. Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010(2015).
  5. Nguyen, H. -M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
  6. Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514(2020).
  7. Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310(2020).
  8. Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400(2020).
  9. Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
  10. Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441(2019).
  11. Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
  12. Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407(2020).
  13. Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477(2021).
  14. Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
  15. Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
  16. Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. , Humana Press. New York, USA. (2014).
  17. Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
  18. Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40(2006).
  19. Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
  20. Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 14, Unit 14E 1(2005).
  21. Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
  22. Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
  23. Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
  24. Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224(2013).
  25. Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
  26. Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441(2019).
  27. Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065(2014).
  29. Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
  30. Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Онколитический герпесвирусочистка вирусаметод бляшекцитопатический эффектклетки Veroсахарозный градиентиммунотерапия ракатитрование вирусаобработка бензоназойприготовление вирусного стока
Рост, очистка и титрование онколитического вируса простого герпеса
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.