Полисомное профилирование без градиентных строителей или систем фракционирования

Summary

Этот протокол описывает, как генерировать полисомный профиль без использования автоматизированных градиентных изготовителей или систем фракционирования градиентов.

Abstract

Фракционирование полисом путем центрифугирования градиента плотности сахарозы является мощным инструментом, который можно использовать для создания профилей рибосом, идентификации конкретных мРНК, транслируемых рибосомами, и анализа факторов, связанных с полисомами. В то время как автоматизированные производители градиентов и системы фракционирования градиентов обычно используются с этим методом, эти системы, как правило, дороги и могут быть непомерно дорогими для лабораторий, которые имеют ограниченные ресурсы или не могут оправдать расходы из-за их нечастой или случайной необходимости выполнять этот метод для своих исследований. Здесь представлен протокол для воспроизводимого создания полисомных профилей с использованием стандартного оборудования, доступного в большинстве лабораторий молекулярной биологии без специализированных инструментов фракционирования. Кроме того, приведено сравнение полисомных профилей, полученных с градиентной системой фракционирования и без нее. Обсуждаются стратегии оптимизации и получения воспроизводимых полисомных профилей. Saccharomyces cerevisiae используется в качестве модельного организма в этом протоколе. Однако этот протокол может быть легко модифицирован и адаптирован для создания профилей рибосом для многих различных организмов и типов клеток.

Introduction

Рибосомы представляют собой мега-Дальтонные рибонуклеопротеиновые комплексы, которые выполняют фундаментальный процесс трансляции мРНК в белки. Рибосомы отвечают за осуществление синтеза всех белков внутри клетки. Эукариотические рибосомы состоят из двух субъединиц, обозначенных как малая рибосомная субъединица (40S) и большая рибосомная субъединица (60S) в соответствии с их коэффициентами седиментации. Полностью собранная рибосома обозначается как моносома 80S. Полисомы представляют собой группы рибосом, занимающихся трансляцией одной молекулы мРНК. Фракционирование полисом путем центрифугирования градиента плотности сахарозы является мощным методом, используемым для....

Protocol

1. Препарат 7% - 47% градиентов сахарозы

ПРИМЕЧАНИЕ: Линейный диапазон градиента сахарозы может быть модифицирован для достижения лучшего разделения в зависимости от типа используемой клетки. Этот протокол оптимизирован для полисомных профилей для S. cerevisiae.

1. Готовят стоковые растворы 7% и 47% сахарозы в буфере градиента сахарозы (20 мМ Tris-HCl pH 7,4, 60 мМ KCl, 10 мМ MgCl₂ и 1 мМ DTT). Фильтр стерилизует растворы сахарозы через фильтр 0,22 мкм и хранит при 4 °C.
2. Готовят 14 мл 17%, 27% и 37% растворов сахарозы путем дозирования и смешивания 7% и 47% растворов сахарозы способом, описанным в

Results

Три репрезентативных полисомных профиля показаны на рисунке 3. Все профили из одного и того же штамма дрожжей. Типичный полисомный профиль будет иметь хорошо разрешенные пики для рибосомных субъединиц 40S, 60S и 80S, а также полисом. Гребень каждой рибосомной субъединицы и полисомный пик будут видны на каждом профиле (рисунок 3). Репрезентативный профиль из автоматизированной системы фракционирования плотности показан на рисунке 3А........

Discussion

Здесь описан способ создания полисомных профилей без использования дорогостоящих автоматизированных систем фракционирования. Преимущество этого метода заключается в том, что он делает полисомное профилирование доступным для лабораторий, которые не имеют автоматизированных систем фракционирования. Основными недостатками этого протокола являются утомительное ручное фракционирование и пониженная чувствительность по сравнению со специальной системой фракционирования плотности.

Этот протокол влечет.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Автоматический ректификатор	Brandel
Clariostar Многорежимный считыватель пластин	BMG Labtech
Циклогексимид	Sigma Aldrich	C7698
Дитиотреитол	Инвитроген	15508-013
Стеклянные бусины, промытые кислотой	Sigma Aldrich	G8772	425– 600 μ m
Гепарин	Сигма Олдрич	H4784
Хлорид магния, 1 м KD	Medical	CAC-5290
Игла, 22 г, металлическая ступица	Hamilton Company	7748-08	пользовательская длина 9 дюймов, тип точки 3
Optima XL-100K Ультрацентрифуга	Beckman Coulter
Полипропиленовая центрифуга	Beckman Coulter	331372
Полипропиленовая пробирка для колышков Fisher	Scientific	14-810-54A
хлорид калия	Sigma Aldrich	P9541
Qubit 4 Флуориметр	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Набор для анализа РНК Qubit	Thermo Fisher Scientific	Q32855
Ингибитор РНКазы	Applied Biosystems	N8080119
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389
SW41 Ротор качающегося ведра Pkg	Beckman Coulter	331336
шприц, 3 мл	Coviden	888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star Microplate, 96 лунок	Greiner Bio-One