Успешная трансформация зародышевой линии у травяной совки, Spodoptera frugiperda,была достигнута с помощью мРНК гиперактивной транспоза piggyBac.
Стабильная вставка генетического груза в геномы насекомых с использованием транспонируемых элементов является мощным инструментом для функциональных геномных исследований и разработки стратегий борьбы с генетическими вредителями. Наиболее используемым транспонируемым элементом в трансформации насекомых является piggyBac,а трансформация зародышевой линии на основе piggyBacбыла успешно проведена у модельных насекомых. Тем не менее, по-прежнему сложно использовать эту технологию у немодельных насекомых, которые включают сельскохозяйственных вредителей. В этой статье сообщается о трансформации зародышевой линии глобального сельскохозяйственного вредителя, травяной совки (FAW), Spodoptera frugiperda,с использованием гиперактивной транспоза piggyBac (hyPBase).
В этой работе мРНК hyPBase была получена и использована вместо плазмиды-хелпера в микроинъекциях эмбриона. Это изменение привело к успешному поколению трансгенных FAW. Кроме того, описаны методы скрининга трансгенных животных, быстрого обнаружения трансгенной вставки трансгена на основе ПЦР и определения сайта интеграции на основе термической асимметричной чересстрочной ПЦР (TAIL-PCR). Таким образом, в данной работе представлен протокол получения трансгенного FAW, который облегчит трансгенез на основе piggyBacу FAW и других чешуекрылых насекомых.
Травяная совка (FAW), Spodoptera frugiperda,является родной для тропических и субтропических регионов Америки. В настоящее время это разрушительное насекомое травоядное животное в более чем 100 странах мира1. Личинки FAW питаются более чем 350 растениями-хозяевами, включая некоторые важные основные продовольственные культуры2. Сильная миграционная способность взрослых особей FAW способствует его недавнему быстрому распространению из Северной и Южной Америки в другие места1,2. В результате это насекомое в настоящее время угрожает продовольственной безопасности на международном уровне. Применение новых технологий может способствовать проведению углубленных исследований в FAW и обеспечить новые стратегии борьбы с этим вредителем.
Трансформация зародышевой линии насекомых была использована для изучения функции генов и генерации трансгенных насекомых для использования в генетическом контроле3,4. Среди различных методов, используемых для достижения генетической трансформации у насекомых, метод на основе элементов piggyBac является наиболее используемым методом5. Однако из-за низкой скорости транспозиции по-прежнему сложно проводить трансгенез у немодельных насекомых. Недавно была разработана гиперактивная версия транспозазы piggyBac (hyPBase)6,7. Трансформация зародышевой линии была достигнута в FAW недавно8,что является первым отчетом, в котором используется hyPBase у чешуекрылых насекомых. В этом отчете описана подробная информация об использовании мРНК hyPBase для генерации трансгенного FAW. Метод, описанный здесь, может быть применен для достижения трансформации других чешуекрылых насекомых.
1. In vitro синтез мРНК hyPBase
ПРИМЕЧАНИЕ: Полная кодирующая последовательность последовательности hyPBase была синтезирована и вставлена в вектор pTD1-Cas9 (см. Таблицу материалов)для получения конструкции pTD1-hyPBase, которая содержит экспрессирующую hyPBase кассету, промотор T7: polyhedrin-5′ UTR: hyPBase: polyhedrin-3′ UTR: poly (A). Полная последовательность конструкции pTD1-hyPBase приведена в Дополнительном материале.
2. Микроинъекция
3. Флуоресцентный скрининг и генетическое скрещивание
4. ПЦР-обнаружение трансгенной вставки
5. Определение места трансгенной вставки
Низкая скорость транспозиции и сложность доставки трансгенных компонентов в свежие эмбрионы ограничивают успех трансформации зародышевой линии у многих немодельных насекомых, особенно у чешуекрылых. Для увеличения скорости трансформации зародышевой линии была разработана гиперактивная версия наиболее широко используемой транспозазы piggyBac (hyPBase)7,10. На сегодняшний день об успешной трансформации зародышевой линии у чешуекрылых насекомых в основном сообщается в модели насекомого шелкопряда Bombyx mori11. Тем не менее, проведение работ по трансгенезу у других чешуекрылых насекомых, включая некоторых крупных вредителей сельского хозяйства, по-прежнему является сложной задачей.
Основными ограничениями и ключевыми шагами создания трансгенной линии FAW с использованием этого протокола являются синтез высококачественной мРНК hyPBase и доставка компонентов транспозиции piggyBac в ранние эмбрионы. Двумя основными компонентами традиционной системы piggyBac являются донорская плазмида, содержащая груз, который должен быть вставлен в геном, и вспомогательная плазмида, обеспечивающая транспозазу12. Для повышения эффективности трансформации в хелперной плазмиде используют высокоактивные промоторы для управления экспрессией транспозазы13,14. Поскольку эти промоторы обычно получают из модельных насекомых, их активность у других насекомых может быть не высокой, как у видов, от которых был идентифицирован промотор. Таким образом, транспозазна мРНК более эффективна, чем плазмида-хелпер, которая может улучшить трансформацию зародышевой линии у большинства немодельных насекомых.
В этом протоколе мРНК hyPBase была получена in vitro путем построения плазмиды, содержащей экспрессирующую hyPBase кассету (промотор T7: полиэдрин-5’UTR: hyPBase: многогранник-3’UTR: поли(A) сигнал). Промотор Т7 позволяет синтезировать мРНК in vitro с использованием коммерчески доступных наборов синтеза мРНК. Как полигедрин-5’UTR, так и многогранник-3’UTR могут помочь в улучшении транскрипции мРНК hyPBase in vitro и трансляции белка hyPBase in vivo. Наличие поли (А) сигнала способствует повышению стабильности мРНК hyPBase in vivo15. Кроме того, инъекция компонентов piggyBac в самые ранние эмбрионы с ограниченным количеством делящихся клеток также имеет решающее значение для повышения шансов доставки компонентов системы piggyBac предшественников клеток зародышевой линии. События транспозиции, происходящие в клетках зародышевой линии, могут быть унаследованы. В этом протоколе эмбрионы FAW в возрасте до 2 часов собирались и хранились на льду, чтобы замедлить их развитие перед инъекцией. Для большинства насекомых сбор эмбрионов как можно раньше и поиск способа замедлить их развитие также могут помочь в успешной трансформации зародышевой линии.
Использование флуоресцентных белков в трансгенезе насекомых помогает в идентификации трансгенных животных. В этом протоколе промотор IE1, который, как сообщалось, является эффективным и вездесущим промотором у чешуекрылых насекомых11,полученный из раннего раннего гена вируса ядерного полигедроза Autographa california multicapsid (AcNPV), был объединен с энхансером hr5 для стимулирования экспрессии EGFP. У трансгенных людей, у которых EGFP был вставлен в геном FAW, сигнал EGFP мог наблюдаться на всех этапах (данные не показаны). Молекулярное подтверждение пиггиБак-опосредованнойвставки обычно выполняли с помощью южного пятна или обратной ПЦР и секвенирования. В этом протоколе ПЦР-амплификация фрагмента в трансгенном грузе использовалась для быстрого подтверждения трансгенной вставки. Кроме того, для идентификации сайта интеграции трансгенной вставки 9 наоснове ПЦРбыл использован высокоэффективный метод TAIL-PCR на основе ПЦР, которым легко манипулировать по сравнению с широко используемым методом обратной ПЦР. Разработан высокоэффективный метод TAIL-PCR для идентификации участков трансгенной интеграции в растениях. В данном исследовании этот метод впервые используется у насекомых. Представленный протокол обеспечивает эффективный способ генерации трансгенного FAW, а также может быть в дальнейшем применен ко многим другим модельным и немодельным насекомым.
The authors have nothing to disclose.
1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
<em>Spodoptera frugiperda</em> Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
<em>Spodoptera frugiperda</em> Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
Taq MasterMix | polymerase mixture |