Method Article

Получение, поддержание и характеристика органоидов кишечника и толстой кишки, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека

DOI:

10.3791/62721

⸱

July 9th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе подробно описаны методы получения, поддержания и определения характеристик органоидов тонкого кишечника и толстой кишки, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека. Эти методы предназначены для улучшения воспроизводимости, расширения масштабируемости и сокращения рабочего времени, необходимого для нанесения гальванических покрытий и пропускания органоидов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Регионарная спецификация кишечника описывает процесс, посредством которого определенным областям развивающегося желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) придается уникальная морфология и функция. Регионарная специфичность в кишечнике обусловлена несколькими путями развития, включая путь костного морфогенетического белка (BMP). На основе нормальной региональной спецификации был разработан метод получения органоидов толстой кишки человека (ГСО) из плюрипотентных стволовых клеток человека (ГПСК), которые включают эмбриональные стволовые клетки человека (ГЭС) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК). Трехдневная индукция передачи сигналов BMP в достаточной степени преобразует культуры средней/задней кишки в специальные HCO, экспрессирующие АТ-богатые последовательно-связывающими белки 2 (SATB2), содержащие все основные типы эпителиальных клеток, присутствующих в толстой кишке человека, а также совместно развивающиеся мезенхимальные клетки. Пропуск BMP (или добавление ингибитора BMP NOGGIN) в течение этого критического периода формирования привел к образованию кишечных органоидов человека (HIO). HIO и HCO морфологически и молекулярно напоминают развивающуюся тонкую и толстую кишку человека соответственно. Несмотря на полезность ГИО и ГКО для изучения развития кишечника человека, создание ГИО и ГКО является сложной задачей. В данной статье представлены методы создания, поддержания и определения характеристик ГИО и ОЦ. Кроме того, в протоколе содержатся критические шаги и рекомендации по устранению неполадок.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение развития толстой кишки человека затруднено из-за ограничений на использование тканей человеческого плода. Животные модели были бесценны и исторически использовались для генетических подходов на мышах для изучения развития кишечника. Тем не менее, различия между развитием кишечника у мышей и человека ограничивают применимость мышей в качестве модельной системы. Например, хотя формирование крипт в тонком кишечнике и толстой кишке мышей происходит постнатально, люди рождаются с полностью сформированными криптами. Кроме того, тонкая кишка и толстая кишка человека содержат типы клеток, которые не обнаружены у мышей, в том числе энтероэндокринные клетки, экспрессирующие мотилин (MLN) в тонком кишечнике2 и бокаловидные клетки, экспрессирующие муцин 5B (MUC5B) в толстой кишке 3,4. По этой причине важно иметь систему клеточных культур, которая точно моделирует динамические молекулярные события, определяющие ранние стадии развития толстой кишки. Таким образом, направление hPSCs на генерацию клеток с характеристиками толстой кишки обеспечивает мощную модель для изучения развития толстой кишки человека.

Были разработаны протоколы, способствующие воспроизводимому5, синхронному и эффективному образованию кишечноподобных органоидов6 и толстойкишки7 из hPSCs. В этих протоколах используется процедура ступенчатой дифференцировки, которая имитирует развитие кишечника и толстой кишки плода (Рисунок 1). Во-первых, дефинитивная энтодерма создается из плюрипотентных стволовых клеток человека путем лечения активином А, узловым миметиком. Воздействие на дефинитивную энтодерму высоких уровней WNT и фактора роста фибробластов (FGF) индуцирует морфогенез в сфероиды средней/задней кишки CDX2+. Затем сфероиды средней и задней кишки встраиваются во внеклеточный матрикс (ВКМ) и встраиваются либо в HIO, либо в HCO посредством транзиторных манипуляций с передачей сигналов BMP. Ингибирование передачи сигналов BMP с помощью NOGGIN или добавление питательной среды приводит к образованию HIO, которые напоминают проксимальный отдел тонкой кишки человека.

Активируя передачу сигналов BMP с помощью BMP2, сфероиды средней/задней кишки превращаются в HCO, которые сохраняют структурированность в эпителии и мезенхиме7. ГКО содержат обогащенные толстой кишкой, экспрессирующие MUC5B бокаловидные клетки и способны генерировать специфичные для толстой кишки инсулиноподобные 5 (INSL5) энтероэндокринные клетки. Выделенный мезенхим из ГКО экспрессирует гомеобокс A13 (HOXA13) и HOXD13, которые также экспрессируются в первичной мезенхиме толстой кишкичеловека 8. Важно помнить, что этап формирования паттерна происходит в течение 7-10 дней протокола дифференцировки. Этого трехдневного периода достаточно, чтобы вызвать формирование толстой кишки, которое сохраняется после расширенного культивирования in vitro .

Описанные ниже протоколы предназначены для исследователей, которые знакомы с культурой hPSC без питательных веществ. Для исследователей, которые не знакомы с этим типом культуры ПССК, рекомендуется пройти обучающий курс по ПССК, например, предлагаемый Stem Cell Technologies или Pluripotent Stem Cell Facility (PSCF) в Детской больнице Цинциннати. Качество начальных hPSC имеет решающее значение и может повлиять на все последующие этапы. Следующий протокол будет начинаться с hPSCs, которые выращивались в течение 4 дней и готовы к расщеплению.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Генерация органоидов кишечника и толстой кишки человека

  1. Подготовка пластин с покрытием ECM
    1. Добавьте 50 мл холодной среды DMEM в коническую пробирку объемом 50 мл.
    2. Извлеките из морозильной камеры при температуре -80 °C ЭБУ с 4-кратным содержанием ЭБУ (см. Таблицу материалов) и разморозьте на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к сертификату анализа продукта, чтобы определить объем ЭБУ, сертифицированного ESC, необходимый для подготовки 4-кратного запаса.
    3. Если ВКМ, сертифицированный по стандарту hESC, не полностью разморожен, возьмите 750 мкл DMEM из конической пробирки объемом 50 мл и смешайте его с ECM.
    4. Переложите смесь ECM, сертифицированную по стандарту DMEM/hESC, в коническую пробирку объемом 50 мл с DMEM и хорошо перемешайте. Добавьте по 0,5 мл на лунку в каждый из 4 x 24-луночных планшетов для культивирования клеток.
    5. Встряхните пластины, чтобы равномерно распределить ECM по всей лунке, чтобы убедиться, что вся поверхность покрыта. С помощью парапленки запечатайте пластины с покрытием ECM и оставьте их при комнатной температуре в шкафу биобезопасности не менее чем на 1 ч. Храните пластины с покрытием ECM при температуре 4 °C в течение 2 недель или до тех пор, пока они не понадобятся.
  2. ГПСК одноклеточное покрытие
    1. Поместите 24-луночный планшет с покрытием ECM в шкаф биобезопасности на 30 минут, чтобы он нагрелся до комнатной температуры.
    2. Поместите полную среду mTeSR1, раствор для отслойки клеток и усовершенствованный DMEM в водяную баню при температуре 37 °C и дайте им прогреться в течение 30 минут.
    3. Убедитесь, что hPSCs конфлюентны не менее чем на 85% с минимальной дифференцировкой. При необходимости удалите все дифференцированные клетки.
    4. Среду для гальванического покрытия готовят в конической пробирке объемом 50 мл следующим образом: 13 мл mTeSR1 и 13 мкл 10 мл ингибитора Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK) Y-27632.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Y-27632 ингибирует анойкис и увеличивает выживаемость одиночных клеток.
    5. Чтобы собрать клетки из 6-луночного планшета, аспирируйте среду из 3-4 лунок и промойте один раз 2 мл усовершенствованного DMEM на лунку.
    6. Аспирируйте усовершенствованный DMEM и диспродуцируйте по 1 мл раствора для диссоциации клеток в каждую лунку. Инкубируйте планшет в течение 5-7 минут в инкубаторе с 5%CO2, 37 °C. Проверьте под микроскопом, что клетки находятся во взвешенном состоянии.
    7. Диссоциируйте оставшиеся скопления клеток, пипетируя вверх и вниз 4-5 раз с помощью пипетки объемом 5 мл.
    8. Добавьте по 2 мл усовершенствованного DMEM в каждую лунку, аккуратно пипетируйте вверх и вниз 4-5 раз и переложите в коническую пробирку объемом 15 мл. Раскрутите ячейки при 300 × г в течение 3 мин при комнатной температуре.
    9. Отсадите среду из пробирки, не отсасывая клеточную гранулу, и добавьте 6 мл подготовленной среды mTeSR1 плюс ингибитор ROCK. Аккуратно ресуспендируйте клетки пипетированием вверх и вниз 3-4 раза, а затем перенесите суспензию в оставшуюся среду ингибитора mTeSR1/ROCK внутри пробирки объемом 50 мл. Энергично суспензируйте 4-5 раз и подсчитайте клетки с помощью гемацитометра.
    10. Отсасывайте ВКМ из 24-луночного планшета непосредственно перед нанесением покрытия на клетки. Снова суспендируйте клетки пипетированием вверх и вниз 2-3 раза и дозируйте 0,5 мл клеточной суспензии в каждую лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная плотность покрытия должна быть определена экспериментатором. Здесь оптимальное количество ячеек составляет 80 000-200 000 ячеек на лунку.
    11. Аккуратно покачивайте пластину 3 раза по часовой стрелке, 3 раза против часовой стрелки, 3 раза вперед и назад и 3 раза из стороны в сторону, чтобы равномерно разогнать ячейки.
    12. Перенесите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 и инкубируйте в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не тревожьте планшет в течение первых нескольких часов, чтобы обеспечить надлежащее рассеивание ячеек внутри лунок.
    13. Через 24 ч (рис. 2А) аспирируйте отработанную среду, добавьте 0,5 мл в лунку mTeSR1, снова инкубируйте при 37 °С, 5%СО2 в течение 24 ч (рис. 2В), а затем перейдите к следующему этапу.
  3. Дифференциация дефинитивной энтодермы (ДЭ) от ПСК
    1. В коническую пробирку объемом 15 мл добавьте 13 мл среды Activin Day 1 (см. Таблицу материалов), 13 мкл 100 мкг/мл Activin A и 1,95 мкл 100 мкг/мл BMP4. Прогрейте среду на водяной бане при температуре 37 °C.
    2. Отсадите среду mTeSR1 из 24-луночного планшета и добавьте 0,5 мл среды Activin Day 1 на лунку. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, 5%CO2 и инкубируйте в течение 24 часов. Проверьте клетки через 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обширная гибель клеток должна быть очевидной, как показано на рисунке 2C. Хотя монослой будет казаться разреженным, колонии клеток увеличатся.
    3. Приготовьте готовую среду Activin Day 2, добавив 12,5 мкл 100 мкг/мл Activin A в 12,5 мл среды Activin Day 2 в коническую пробирку объемом 15 мл. Поместите трубку на водяную баню при температуре 37 °C.
    4. Извлеките 24-луночную дифференцировочную пластину из инкубатора CO2 и удалите отработанную среду. Выдайте 0,5 мл предварительно подогретой среды Activin Day 2 на лунку и поместите планшет обратно в инкубатор сCO2 на 24 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность при дозировании среды. Не стоит дозировать среду непосредственно в центре лунки, так как это приведет к отрыву ячеек в монослое. Осторожно выдавите жидкость вниз по стенке лунки. На следующий день образуется монослой клеток с незначительной гибелью клеток. Теперь клетки должны быть слиты на ~90-95% (Рисунок 2D).
    5. Приготовьте готовую среду Activin Day 3, добавив 12,5 мкл 100 мкг/мл Activin A в 12,5 мл среды Activin Day 3 в коническую пробирку объемом 15 мл. Поместите трубку на водяную баню при температуре 37 °C.
    6. Удалите отработанную среду и выдайте 0,5 мл среды Activin Day 3 на лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность при дозировании среды. Не распыляйте среду непосредственно в центр лунки, так как это приведет к отрыву ячеек в монослое. Осторожно выдавите жидкость вниз по стенке лунки. На следующий день монослой должен достичь полного слияния с минимальной гибелью клеток или без нее на этой стадии. Не пытайтесь получить сфероиды средней части задней кишки, если монослой не сливается через 24 ч после добавления среды Activin Day 3. Обратитесь к рисунку 2E для получения идеальной морфологии монослоя DE, прежде чем переходить к генерации сфероидов средней части задней кишки.
    7. Выполняйте иммунофлуоресцентное (ЕСЛИ) окрашивание монослоя для экспрессии белка A2 (FOXA2) и определяющего пол региона Y (SRY) фактора транскрипции 17 (SOX17) при оптимизации дифференцировки DE.
  4. Дифференциация ДЭ в сфероиды средней задней кишки
    1. В коническую пробирку объемом 50 мл добавьте 25 мл индукционной среды средней задней кишки с FGF4 (без CHIR99021) и поместите в водяную баню при температуре 37 °C на 30 минут.
    2. Чтобы приготовить полную среду для индукции средней задней кишки, добавьте 7,5 мкл CHIR99021 после того, как среда нагреется.
    3. Удалите отработанную среду, выдайте 0,5 мл индукционной среды средней задней кишки на лунку и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2 в течение 24 ч.
    4. После того, как на следующий день произойдет конденсация клеток внутри монослоя (рис. 3А), замените отработанную среду свежей средой для индукции средней части задней кишки и поместите планшет обратно в инкубатор с температурой 37 °C и 5%CO2 на 24 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трубчатые структуры будут заметны через 48 ч после индукции средней задней кишки, как показано на рисунке 3B. Сфероиды средней задней кишки начнут отпочковываться от монослоя на 3-й день, как показано на рисунке 3C.
    5. Чтобы избежать выброса плавающих сфероидов при смене среды, переложите старую среду в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при давлении 300 × г в течение 1 минуты. Ресуспендируйте сфероиды в 12,5 мл свежей среды для индукции средней части задней кишки, добавьте 0,5 мл на лунку в ту же 24-луночную лунку и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2 в течение 24 ч.
    6. На 4-й день индукции задней кишки (рис. 3D) соберите плавающие сфероиды из пластинчатых лунок, собрав среду в пробирку объемом 15 мл, с последующим центрифугированием при 300 × г в течение 1 минуты. Перейдите к следующему этапу по встраиванию сфероидов средней задней кишки в ВКМ.
  5. Гальванизация и структурирование сфероидов средней/задней кишки в ВКМ
    1. Разморозьте матрицу базальной мембраны ECM при 4 °C в течение ночи перед внедрением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот ECM отличается от ECM, сертифицированного hESC. ЭХМ следует положить на лед, и соответствующий объем ЭХМ можно зализовать в предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл на льду. Таблица 1 содержит информацию об объеме ECM. Убедитесь, что объем ВКМ составляет не менее 75% в капле, в которую будут внедрены сфероиды.
    2. Прогрейте планшет на 24 лунки в инкубаторе при температуре 37 °C.
    3. Соберите плавающие сфероиды из всех 24 лунок с помощью пипетки объемом 1000 мкл и перенесите их в коническую трубку объемом 15 мл. Раскрутите сфероиды при 300 × г в течение 1 минуты при комнатной температуре. Отсасывайте большую часть среды, но оставляйте объем, необходимый для нанесения покрытия (табл. 1).
    4. Подготовьте наконечники для пипеток объемом 1000 мкл и 200 мкл, обрезав их концы. Выньте предварительно подогретую 24-луночную пластину.
    5. Смешайте плавающие сфероиды, перенесите соответствующий объем в трубку ВКМ, помещенную на лед, а затем повторно суспендируйте сфероиды и ЭКМ с помощью пипетирования, чтобы хорошо их перемешать.
    6. Возьмите 65 мкл смеси сфероидов и ЭХМ с отрезанными 200 мкл наконечниками пипеток и загрузите в центр каждой лунки в 24-луночный планшет. Чтобы убедиться в образовании хорошей капли ECM, осторожно и медленно поднимайте пипетку, пока смесь дозируется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина 30-100 сфероидов на лунку.
    7. Аккуратно перенесите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 и инкубируйте в течение 5 минут.
    8. Переверните тарелку вверх дном и выдерживайте в течение 15-25 минут, что поможет каплям ECM сохранить куполообразную структуру.
    9. Во время инкубации подготовьте необходимую среду и прогрейте ее. После того как ECM затвердеет, добавьте 0,5 мл среды с HIO или HCO-структурой в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2. На рисунке 3E показано изображение сфероидов в ECM.
    10. Культивируйте сфероиды в моделирующей среде в течение 3 дней.
    11. Через 3 дня смените среду с HIO- или HCO-структурой на нормальную среду роста и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды в этот момент времени (День 10) являются органоидами на ранних стадиях. В зависимости от цели проекта, некоторые органоиды ранних стадий могут быть использованы для анализа паттернов на ранних стадиях, как подробно описано в разделе 2.
  6. Отрастание и пассирование органоидов кишечника и толстой кишки человека
    1. После 10 дня меняйте питательную среду каждые 3 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от плотности покрытия и роста органоидов может потребоваться более частая смена среды. Изменения среды следует проводить до того, как фенольный красный (показатель pH) в среде станет желтым.
    2. Инкубируйте органоиды до 21-го дня (рисунок 3F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка BMP2 приведет к уменьшению количества органоидов (в ~3 раза меньше, чем у HIO), которые растут из сфероидов. Таким образом, для производства HCO необходимо покрыть большее количество сфероидов.
  7. Расщепление органоидов на 21 день
    1. Осмотрите органоиды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды должны быть разделены на 21-й день, так как к 21-му дню ECM почти разрушается из-за роста и расширения органоидов.
    2. Подготовьте наконечники для пипеток объемом 1000 μл и 200 μл, обрезав их концы.
    3. Прогрейте 24-луночный планшет Nunc в инкубаторе при температуре 37 °C.
    4. Поместите соответствующий объем ЭКМ в предварительно охлажденные пробирки объемом 1,5 мл (Таблица 1).
    5. Аккуратно соскребите каплю ECM с органоидами с помощью наконечника дозатора объемом 1000 мкл и несколько раз попытайтесь разбить ECM.
    6. Переложите смесь в чашку Петри диаметром 60 мм и проверьте органоиды под микроскопом. При необходимости отделите органоиды друг от друга с помощью стерильных щипцов. Следите за тем, чтобы отделение не повредило эпителий органоидов.
    7. Перенесите органоиды в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при давлении 300 × г в течение 30 с. Аспирируйте надосадочную жидкость и оставьте в пробирке ~1 мл среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем среды может быть изменен в зависимости от цели эксперимента. Если требуется больше органоидов на одну каплю ECM, объем среды может быть уменьшен. Однако, если требуется меньше органоидов, объем среды можно увеличить.
    8. Хорошо перемешайте органоиды, перенесите соответствующий объем в трубку ECM, помещенную на лед, а затем повторно суспендируйте органоиды и ECM с помощью пипетирования, чтобы хорошо их перемешать.
    9. Добавьте 65 мкл смеси сфероидов и ECM в центр каждой лунки 24-луночного планшета с помощью отрезанных наконечников пипеток объемом 200 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время пипетирования очень важно сначала брать органоиды, а затем ECM. Таким образом, при дозировании смеси органоиды находятся в верхней части капли ECM.
    10. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, 5%CO2 на 5 минут.
    11. Переверните пластину вверх дном еще на 15-25 минут, чтобы капли ECM сохранили куполообразную структуру.
    12. Добавьте в каждую лунку по 0,5 мл среды для роста HIO/HCO и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда роста одинакова как для ОО, так и для ОГС после формирования паттерна.
    13. Меняйте среду каждые 2-3 дня до 35-го дня (Рисунок 3G).

2. Проверка структурирования органоидов методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР)

  1. Перед сбором РНК приготовьте 1x буфер для лизиса РНК, следуя инструкциям производителя.
  2. Выбросьте отработанную среду и добавьте 350 мкл буфера для лизиса в каждую лунку 24-луночного планшета. Лизируйте органоиды путем пипетирования вверх и вниз с помощью пипетки объемом 1 мл. Для лучшего лизиса кратковременно делайте вихрь на максимальной скорости в течение 5 с.
  3. Храните все образцы при температуре -80 °C до тех пор, пока они не будут готовы к экстракции РНК. Когда все будет готово, достаньте образцы РНК из морозильной камеры при температуре -80 °C и разморозьте их на льду в течение 10 минут. Энергично переведите пробирки при комнатной температуре в течение 10-15 минут, чтобы обеспечить полный лизис образцов.
  4. Снова поместите образцы на лед и приступайте к извлечению РНК в соответствии с инструкциями производителя. Перенесите образцы РНК в морозильную камеру при температуре -80 °C, если вы не готовы перейти к следующему шагу.
  5. Выполняйте экстракцию РНК, обработку ДНКазой, синтез кДНК и ОТ-кПЦР с использованием стандартной методологии. В таблице 2 приведен список названий и последовательностей праймеров.

3. Проверка структурирования органоидов методом иммунофлюоресценции

  1. Сбор и фиксация органоидов
    1. Асасируйте среду HIO или HCO из соответствующих лунок и добавьте в каждую лунку по 1 мл ледяного фосфатно-солевого буфера (PBS). Отделите органоиды от ЭХМ с помощью разрезанного наконечника для пипетки объемом 200 мкл. Проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы отделить большие куски ЭКМ от органоидов.
    2. Переложите органоиды в коническую пробирку объемом 15 мл и заполните остальную часть пробирки ледяным PBS и аккуратно перемешайте, перевернув пробирку. Дайте органоидам осесть под действием силы тяжести и аспирируйте PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если органоиды не оседают под действием силы тяжести, центрифугируйте при 300 × г в течение 1 минуты.
    3. Отсадите PBS и добавьте 1 мл ледяного раствора для разложения ЭХМ. Держите трубку на льду в течение 10-15 минут на вращающейся платформе, осторожно встряхивая.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наклоните трубку под углом 45°, чтобы обеспечить правильное смешивание органоидов и раствора для восстановления клеток. Через 10-15 мин органоиды должны осесть на дно пробирки, что свидетельствует о полном переваривании ВКМ.
    4. Добавить холодный PBS в пробирку до 15 мл; Хорошо перемешайте, несколько раз перевернув трубку. Когда органоиды осядут на дно пробирки, аспирируйте PBS и добавьте 1 мл предварительно охлажденного 4% параформальдегида для фиксации органоидов. Инкубируйте органоиды с 4% параформальдегидом на льду в течение 1 ч.
    5. Заполните остальную часть трубки ледяным PBS и поместите ее горизонтально на качающуюся платформу при температуре 4 °C на ночь. На следующий день утилизируйте параформальдегид/PBS в указанный контейнер для отходов и промойте один раз 15 мл ледяного PBS, как описано в шаге 3.1.2.
    6. Аспирируйте PBS и заполните пробирку 30% сахарозой в PBS. Поместите трубку горизонтально на качающуюся платформу при температуре 4 °C на ночь.
    7. На следующий день вживите органоиды в базовую модель размером 7 мм x 7 мм x 5 мм со средой OCT и мгновенно заморозьте с помощью ванны с сухим льдом и этанолом.
    8. Высушите блоки лабораторными салфетками, заверните в бумажное полотенце и оставьте на ночь в морозильной камере при температуре -80 °C. На следующий день вырежьте срезы размером 5 мкм на предметные стекла микроскопа с помощью криостата. Хранить предметные стекла при температуре -80 °C.
  2. Иммунофлуоресцентное окрашивание органоидов
    1. Обработайте предметные стекла из морозильной камеры при температуре -80 °C и выполните окрашивание ПЧ по стандартным протоколам.
    2. Наклейте покровные стекла на предметные стекла и высушите их при комнатной температуре, в защищенном от света месте не менее 2 часов или в течение ночи перед визуализацией.
    3. Визуализируйте слайды с помощью 25-кратного объектива конфокального микроскопа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успешное генерирование сфероидов на стадии индукции средней/задней кишки свидетельствует об успешном формировании паттернов. Выполните окрашивание IF для CDX2 на плавающих сфероидах и на монослое, чтобы убедиться в правильности нанесения рисунка. Хотя окрашивание на стадии окончательной энтодермы (ДЭ) может указывать на эффективность индукции ДЭ, генерация сфероидов невозможна без эффективной индукции ДЭ. Чтобы проверить эффективность индукции ДЭ, выполните окрашивание ПЧ и/или ОТ-кПЦР для FOXA2 и SOX17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дифференциация hPSC на HIO и HCO является сложным процессом, требующим контроля качества на каждом этапе. Исходные ПСК должны иметь минимальную дифференцировку, прежде чем начать дифференцировку в ДЭ. Оптимизация плотности hPSCs, покрытых для дифференцировки DE, имеет решающее значение для успеха протокола. Чтобы обеспечить качество дифференцировки DE, выполните IF для FOXA2 и SOX17, чтобы определить эффективность дифференцировки DE. Дифференцировка DE должна привести к положительному ок...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лаборатория Múnera финансируется NIH/NCI 5U54CA210962-02 Исследовательским центром неравенства при раке Южной Каролины (SC CADRE), NIH/NIGMS P20 GM130457-01A1 COBRE при заболеваниях пищеварительной системы и печени и NIH/NIDDK 1P30 DK123704-01 MUSC Core Research Disease Disease Core Center.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА)Н/ДН/ДН/Д
15 мл Трубка CorningСокол21008-918Н/Д
30% САХАРОЗАН/ДН/ДСделано в PBS.
5% Нормальная ослиная сывороткаИммуноисследовательская лаборатория Джексона017-000-121Н/Д
50 мл Трубка CorningСокол21008-951Н/Д
АккутазаТермо СайентиалA1110501Раствор для отслойки клеток; аликвоту 5 мл Аккутазы в 10 мл пробирок всего на 20 пробирок и хранить при температуре -20 °С; C на срок до 6 месяцев. Место на 4 ° C на ночь перед использованием.
Активин АСистемы управления клеткамиГФХ6-100х10Восстановите лиофилизированный порошок при 100 мк; г/мл в стерильном PBS, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Аликвот 38 &микро; L активина А в предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки и хранить при температуре -80°°; C (Срок годности пробирок истекает через 12 месяцев с даты получения).
Активин День 1 средний (RPMI 1640)КорнингMT10041CVИспользуйте заменимые аминокислоты (NEAA, Corning 11140050) и храните при температуре 4 °C. Основная среда 1-го дня: 500 мл RPMI 1640 и 500 мл NEAA. При приготовлении среды Activin Day 1 добавьте 13 мл базовой среды Day 1, 13 &; л активина А (100 &; г/мл) и 2 & микро; л БМП4 (100 & микро; г/мл). Базовая среда стабильна до 3 недель, но ее следует использовать сразу после добавления факторов роста.
Активин День 2 средний (RPMI 1640, 0,2% FBS об./об.)ГиклонSH30070.03ТИспользуйте заменимые аминокислоты (Corning 11140050) и храните при температуре 4 °C. Основная среда 2-го дня: 500 мл RPMI 1640, 500 мл NEAA и 1 мл 0,2% сыворотки. При приготовлении среды Activin Day 2 добавьте 12,5 мл основного средства Day 2 medium и 12,5 мкм; L активина А (100 &; г/мл). Базовая среда стабильна до 3 недель, но ее следует использовать сразу после добавления факторов роста.
Активин День 3 средний (RPMI 1640, 2% FBS об./об.)ГиклонSH30070.03ТИспользуйте заменимые аминокислоты (Corning 11140050) и храните при температуре 4 °C. Основная среда 3-го дня: 500 мл RPMI 1640, 500 мл NEAA и 10 мл 2% сыворотки. При приготовлении медиума Activin Day 3 добавьте по 12,5 мл основного средства Day 3 и 12,5 L активина А (100 &; г/мл). Базовая среда стабильна до 3 недель, но ее следует использовать сразу после добавления факторов роста.
Alexa Fluor 488 Ослик против козТермо СайентиалА11055Разведение 1:500 (вторичное антитело)
Alexa Fluor 488 Ослик анти-КроликТермо СайентиалА21206Разведение 1:500 (вторичное антитело)
Alexa Fluor 546 Donkey анти-МышьТермо СайентиалА10036Разведение 1:500 (вторичное антитело)
Alexa Fluor 647 Donkey анти-МышьТермо СайентиалА31571Разведение 1:500 (вторичное антитело)
Базовая формаРыбак22-363-552Н/Д
Базовая кишечная среда (продвинутый DMEM)Gibco12491015  При приготовлении основной кишечной среды добавьте 500 мл DMEM, 500 мл N2 (Gibco 17-502-048), 500 мл B27 (Gibco), 500 мл L-глютамина, чтобы получить 2 мМ L-глютамина (Corning A2916801), 5 мл 100 ЕД/мл пенициллин-стрептомицина (Gibco 15-140-122) и 7,5 мл 1 М HEPES для получения 15 М HEPES. Базовая среда стабильна до 3 недель, но ее следует использовать сразу после добавления факторов роста.
Biorad CFX96 Сенсорная система обнаружения ПЦР в реальном времениБиорадН/ДМожно использовать и другие системы qRT-PCR.
Решение для восстановления клетокКорнинг354253Решение для деградации ECM
CHIR99021Репроцелл4000410Восстановите путем добавления 2,15 мл ДМСО в концентрации 10 мМ. Подготовьте 50 & микро; L aliquots и хранить при -20 °C. Храните порошок при 4°°; С, защищенный от света.
CTRL HIO для структурирования средыН/ДН/ДОсновная кишечная среда и 100 нг/мл EGF.
DAPIСигма-ОлдричД9542Разведение 1:100 (вторичное антитело)
Монослой DEН/ДН/ДМонослой был сгенерирован на предыдущих этапах (раздел 4.4).
ДиспайзGibco17105041Ресуспендируйте лиофилизированный порошок в Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) до конечной концентрации 1 мг/мл. Отфильтруйте раствор для стерилизации путем вакуумирования с помощью стерилизационной трубки с фильтром Millipore. Приготовьте 10 мл аликвот (1 мг/мл) и храните при температуре -20°С; C на срок до 6 месяцев. Место на 4 ° C на ночь перед использованием.
ЭФРТермо Сайентиал236-ЭГ-01МПри приготовлении 100 нг/мл EGF восстанавливают 500 &микро; г/мл в стерильном PBS. Затем добавьте 2 мл стерильного PBS к 1 мг EGF и сделайте 500 &микро; г/мл раствора EGF. Аликвот 100 & микро; Л EGF в 20 пробирках.
Чашки Петри Fisherbrand 6 см с прозрачной крышкойРыбакFB0875713AН/Д
Fisherbrand Cell LifterРыбак08-100-240Н/Д
Флаконы с резьбой из прозрачного стекла класса B Fisherbrand с прикрепленными крышкамиРыбак03-338ВН/Д
Fisherbrand Одноразовая пипетка Пастера из боросиликатного стеклаРыбак13-678-2D0Н/Д
Флюоромоунт G Скользящая Монтажная СредаВВР100241-874Н/Д
Gibco advanced DMEMGibco12-491-023Н/Д
Козий анти-E-кадгеринНИР Системы DАФ648Разведение 1:400 (первичное антитело)
Козий анти-SOX17НИР Системы DАФ1924Разведение 1:500 (первичное антитело)
Среда для моделирования HCOН/ДН/ДОсновная кишечная среда, 100 нг/мл EGF и 100 нг/мл BMP2. При приготовлении BMP2 добавьте 1 мл стерильного 4 мМ HCl 0,1% BSA во флаконы BMP2 (100 &; ж). Аликвот 25 и микро; Л раствора BMP4 в 4 пробирках. Базовая среда стабильна до 3 недель, но ее следует использовать сразу после добавления факторов роста.
ГемоцитометрСигма-ОлдричZ359629Н/Д
Плюрипотентные стволовые клетки человека (hPSC)Центр плюрипотентных стволовых клетокН/ДКлетки засеяны в 24-луночный планшет с покрытием Matrigel (Thermo Scientific 73520-906).
Ледяной 4% раствор параформальдегида (PFA)Н/ДН/ДН/Д
Ледяной фосфатный буферный раствор (PBS)Н/ДН/ДpH должен быть 7,4.
Гидрофобная барьерная ручка ImmEdgeЛаборатория «Вектор»101098-065Н/Д
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК)Центр плюрипотентных стволовых клеток (Медицинский центр детской больницы Цинциннати)Н/ДМожно использовать другие линии hESC или iPSC, но протокол должен быть оптимизирован для каждой клеточной линии.
Микротом LeicaН/ДН/ДН/Д
ЛСМ 880Конфокальный микроскоп
Матрица базальной мембраны MatrigelКорнинг354234Н/Д
Матрица, сертифицированная Matrigel hESCКорнинг354277Приготовьте 4 штуки Матригель, что соответствует объемам, достаточным для получения достаточного количества разбавленного Матригеля для 4 х 6-луночных блюд.
Среда для индукции средней части задней кишки (RPMI 1640)КорнингMT10041CVЗаменимые аминокислоты (Corning 11140050), 2% FBS об/об. (Hyclone SH30070.03T), 3 & микро; M CHIR99021 и 500 нг/мл FGF4. Базовая среда стабильна до 3 недель, но ее следует использовать сразу после добавления факторов роста.
Сфероиды средней задней кишкиН/ДН/ДН/Д
Стерильные одноразовые вакуумные фильтрующие установки MilliporeSigma SteriflipМиллипорСигмаSCGP00525Н/Д
Мышь анти-CDX2БиоГенексMU392-UCРазведение 1:300 (первичное антитело)
Мышь анти-FOXA2Абнова/НовусH00003170-М01Разведение 1:500
Полноценная среда для выращивания mTeSR1Технологии стволовых клеток85870Добавьте 100 мл добавки mTeSR (85870) в одну среду mTeSR объемом 400 мл (85870) и аликвоту в пробирки объемом 50 мл, избегая загрязнения. Хранить по адресу 4° C до использования.
Прозрачный раствор Мюррея (также известный как BABB)МюррейН/Д1:2 бензилбензоат и бензиловый спирт.
Среда для моделирования NOG HIOН/ДН/ДОсновная кишечная среда, 100 нг/мл EGF и 100 нг/мл NOGGIN (Диспенс 25 & микро; г НОГГИНА в 250 &; l стерильный PBS с 0,1% BSA).
NucleoSpin РНКТакара740955.25Можно использовать другие наборы для выделения РНК.
Чашка для культивирования поверхности тканей Nunclon delta 24-луночного (Nunc)Термо Сайентиал73521-004Н/Д
Чашка для культивирования поверхностных тканей Nunclon delta, 24 лунки, покрытая МатригелемТермо Сайентиал73521-004Н/Д
Чашка для культивирования поверхности тканей Nunclon delta 6-луночный (Nunc)Термо Сайентиал73520-906Н/Д
Чашка для поверхностной культуры тканей Nunclon delta 6-луночная, покрытая  Матригель.Термо Сайентиал73520-906Н/Д
Среда роста для ОО, CTRL ОО и ОХСН/ДН/ДОсновная кишечная среда и 100 нг/мл EGF (конечная концентрация)
Фосфатный буферный солевой раствор, 0,5% Triton X (PBS-T)Н/ДН/ДН/Д
ГрунтовкиIntegrated DNA Technologies, Inc. (IDT)Н/ДПраймеры перечислены в таблице 2 протокола.
Кролик анти-CDX2Марка ячейкиEPR22764YРазведение 1:100 (первичное антитело)
Кролик анти-SATB2Марка ячейкиЭП281Разведение 1:100 (первичное антитело)
Рекомбинантный человеческий белок BMP-4НИР Системы D314-ВР-010Восстановите лиофилизированный порошок при 100 мк; г/мл в стерильном 4 мМ HCl, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА). Добавьте 4,17 мл раствора HCl к 45,83 мл молекулярной воды, что в сумме составит 50 мл 1 М HCl. Затем добавляем 200 &микро; L от 1 M HCl до 49,8 мл молекулярной воды, что в сумме составляет 50 мл 4 mM HCl. Далее добавьте 0,05 г БСА в 50 мл 4 мл HCl и профильтруйте до стерильности. Аликвота стерильная 4 мМ HCl 0,1% БСА на 33 микроцентрифужную пробирку всего и хранить при -20 °С. Добавить 100 & л стерильных 4 мМ HCl 0,1% БСА к флаконам BMP4 (10 & микро; ж) сделать решение БМП4 на 100 мкм; г/мл.
Рекомбинантный человеческий белок FGF-4НИР Системы D235-Ф4-01МВосстановиться на 100 & микро; г/мл в стерильном PBS, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Добавьте 0,05 г BSA в 50 мл PBS, чтобы получить 0,1% BSA. Фильтр 0.22 & микро; M BSA для стерилизации BSA. Аликвота 10 мл 0,1% BSA в 5 пробирках. Добавьте 1 мг FGF-4 в 10 мл стерильного 0,1% BSA. Аликвот 250 & микро; L в предварительно охлажденные 40 микроцентрифужных пробирок и хранить при температуре -80°С.
Ингибитор ROCK Y-27632Токрис1254Конечная концентрация составляет 10 мМ (10 ммоль/л). Повторно суспендировать в ДМСО при давлении 10 мМ и стерилизовать фильтр. Добавьте 3 мл стерильного PBS в каждый флакон. Aliqout 100 µ L ингибитора ROCK в 30 пробирках и хранить при -20°С.
Набор для синтеза кДНК SuperScript VILOТермо Сайентиал11-754-250Н/Д
Предметные стекла для микроскопа SuperFrost Plus
Салфетка Tek O.C.T CompoundВВР25608-930Н/Д

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Montgomery, R. K., Mulberg, A. E., Grand, R. J. Development of the human gastrointestinal tract: twenty years of progress. Gastroenterology. 116 (3), 702-731 (1999).
  2. Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 181 (6), 1291-1306 (2020).
  3. van Klinken, B. J., et al. MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a subset of colonic goblet cells. American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 871-878 (1998).
  4. Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P., Buisine, M. P. The mouse Muc5b mucin gene: cDNA and genomic structures, chromosomal localization and expression. Biochemical Journal. 363, Pt 3 589-598 (2002).
  5. Lau, S. T., et al. Activation of hedgehog signaling promotes development of mouse and human enteric neural crest cells, based on single-cell transcriptome analyses. Gastroenterology. 157 (6), 1556-1571 (2019).
  6. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  7. Munera, J. O., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoids via transient activation of BMP signaling. Cell Stem Cell. 21 (1), 51-64 (2017).
  8. Higuchi, Y., et al. Gastrointestinal fibroblasts have specialized, diverse transcriptional phenotypes: a comprehensive gene expression analysis of human fibroblasts. PLoS One. 10 (6), 0129241(2015).
  9. Yahagi, N., et al. Position-specific expression of Hox genes along the gastrointestinal tract. Congenital Anomalies. 44 (1), 18-26 (2004).
  10. Sarvestani, S. K., et al. Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity. Nature Communications. 12 (1), 262(2021).
  11. Holloway, E. M., et al. Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells. Developmental Cell. 54 (4), 516-528 (2020).
  12. Britanova, O., et al. Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex. Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).
  13. Jaitner, C., et al. Satb2 determines miRNA expression and long-term memory in the adult central nervous system. Elife. 5, 17361(2016).
  14. Teo, A. K., et al. Activin and BMP4 synergistically promote formation of definitive endoderm in human embryonic stem cells. Stem Cells. 30 (4), 631-642 (2012).
  15. Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
  16. Tamminen, K., et al. Intestinal commitment and maturation of human pluripotent stem cells is independent of exogenous FGF4 and R-spondin1. PloS One. 10 (7), 0134551(2015).
  17. Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nature Medicine. 23 (7), 878-884 (2017).
  18. Lees, E. A., et al. Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against Salmonella and other pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).
  19. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
  20. Jung, K. B., et al. Interleukin-2 induces the in vitro maturation of human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids. Nature Communications. 9 (1), 3039(2018).
  21. Woo, D. H., et al. Enhancing a Wnt-telomere feedback loop restores intestinal stem cell function in a human organotypic model of dyskeratosis congenita. Cell Stem Cell. 19 (3), 397-405 (2016).
  22. Sommer, C. A., et al. Modeling APC mutagenesis and familial adenomatous polyposis using human iPS cells. PLoS One. 13 (7), 0200657(2018).
  23. McCauley, H. A., et al. Enteroendocrine cells couple nutrient sensing to nutrient absorption by regulating ion transport. Nature Communications. 11 (1), 4791(2020).
  24. Zhang, X., et al. A comprehensive structure-function study of neurogenin3 disease-causing alleles during human pancreas and intestinal organoid development. Developmental Cell. 50 (3), 367-380 (2019).
  25. Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pluripotent Stem CellsIntestinal OrganoidsColonic OrganoidsHuman Intestinal OrganoidsHuman Colonic OrganoidsBMP SignalingRegional SpecificationSATB2 ExpressionEpithelial Cell TypesMesenchymal Cells

Related Articles