Выделение активного caenorhabditis elegans Nuclear Extract и восстановление для транскрипции in vitro

Краткое содержание

Здесь мы опишем подробный протокол выделения активного ядерного экстракта из личиночной стадии 4 C. elegans и визуализации транскрипционной активности в системе in vitro .

Аннотация

Caenorhabditis elegans является важной модельной системой для биологических исследований с тех пор, как она была введена в 1963 году. Однако C. elegans не был полностью использован в биохимическом исследовании биологических реакций с использованием его ядерных экстрактов, таких как транскрипция in vitro и репликация ДНК. Значительным препятствием для использования C. elegans в биохимических исследованиях является разрушение толстой внешней кутикулы нематоды без ущерба для активности ядерного экстракта. Хотя для разрушения кутикулы используется несколько методов, таких как гомогенизация Dounce или обработка ультразвуком, они часто приводят к нестабильности белка. Не существует установленных протоколов выделения активных ядерных белков из личинок или взрослых C. elegans для реакций in vitro . Здесь протокол подробно описывает гомогенизацию личинок стадии 4 C. elegans с использованием гомогенизатора Balch. Гомогенизатор Balch использует давление, чтобы медленно проталкивать животных через узкую щель, разрывающую кутикулу в процессе. Однородная конструкция и точная обработка гомогенизатора Balch обеспечивают последовательное измельчение животных между экспериментами. Фракционирование гомогената, полученного из гомогенизатора Балха, дает функционально активный ядерный экстракт, который может быть использован в методе in vitro для анализа транскрипционной активности C. elegans.

Введение

Маленькая, свободно живущая нематода Caenorhabditis elegans является простым, но мощным модельным организмом для решения широкого круга биологических вопросов. С момента своего появления в 1963 году нематоды были бесценны для ответа на вопросы в нейробиологии, метаболизме, старении, развитии, иммунитете и ^{генетике1}. Некоторые из многих характеристик животного, которые делают его идеальным модельным организмом, включают короткое время генерации, эффективность РНК-интерференции, прозрачное тело и завершенные карты как его клеточной линии, так и нервной системы.

Хотя вклад нематод в науку огромен, они были недостаточно использованы для выяснения системы транскрипции эукариот, причем большая часть нашего понимания этих механизмов исходит из исследований с использованием ядерного экстракта дрожжей, плодовой мухи и культуры клеток ^{млекопитающих2}. Самым большим препятствием, которое отговаривает исследователей от извлечения функционального ядерного экстракта, является жесткая внешняя кутикула нематоды. Этот экзоскелет содержит сшитые коллагены, кутиклины, гликопротеины и липиды, что делает C. elegans от личиночной стадии до взрослой жизни устойчивыми к экстракции белка с помощью химических или механических ^сил3. Система транскрипции in vitro с использованием ядерного экстракта C. elegans была когда-то разработана, но не получила широкого распространения из-за ограниченного объема системы, и использование гомогенизатора Dounce для приготовления экстракта может привести к нестабильности ^{белка4,5}.

В отличие от предыдущего протокола для изоляции ядерного экстракта, в котором использовался гомогенизатор Dounce для разрушения C. elegans, этот протокол использует гомогенизатор Balch. Гомогенизатор Balch состоит из двух основных компонентов: шарика из карбида вольфрама и блока из нержавеющей стали с каналом, просверленным от одного конца до другого. Гомогенизатор Balch загружается шариком из карбида вольфрама и закрывается с обеих сторон для герметизации шлифовальной камеры. Шприцы могут быть загружены на два вертикальных порта, ведущих в шлифовальную камеру. Когда материал передается от одного шприца к другому через шлифовальную камеру, давление от шприцев заставляет материал проходить через узкий зазор между шаром и стенкой камеры. Это медленное и постоянное давление разрушает материал, пока он не достигнет постоянного размера, который способен легко проходить через узкий зазор. Заставляя C. elegans проходить через узкую щель с помощью постоянного, но мягкого давления, животные открываются, выпуская их содержимое в окружающий буфер. Переключение размеров шарика еще больше затягивает зазор, разрывая вновь высвобождаемые клетки и освобождая ядра в буфер. Многочисленные случаи центрифугирования отделяют ядра от остального клеточного мусора, что позволяет собирать чистый ядерный экстракт. Гомогенизатор Balch предпочтительнее гомогенизатора Dounce по нескольким причинам: система может обрабатывать большое количество животных, что позволяет извлекать большое количество активных белков за одну попытку; точная обработка шариков и стального блока обеспечивает последовательное шлифование между несколькими образцами; тяжелый стальной блок действует как радиатор, равномерно отводя тепло от шлифовальной камеры, предотвращая денатурацию.

После выделения транскрипционная активность ядерного экстракта должна быть проверена перед использованием в любых биохимических экспериментах. Традиционно активность транскрипции измеряли с использованием меченых радиоактивными нуклеотидами для отслеживания и визуализации вновь синтезированной РНК. Однако радиоактивная маркировка может быть обременительной, поскольку она требует предосторожности во время использования и ^{удаления6}. Технологические достижения позволяют исследователям сегодня использовать гораздо менее вредные или неприятные методы для измерения даже небольших количеств РНК с использованием таких методов, как количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)⁷. Здесь протокол описывает метод выделения активного ядерного экстракта из личиночной стадии 4 (L4) C. elegans и визуализации транскрипционной активности в системе in vitro.

Протокол

1. Подготовка СМИ

1. Приготовьте стерильный лизогенный бульон (LB) агаровые пластины и жидкие среды, следуя инструкциям производителя.
2. Полоса кишечной палочки (E. coli) штамм OP50 на агаровой пластине LB. Инкубируйте полосу бактерий при 37 °C в течение ночи.
3. Храните пластину E. coli OP50 при температуре 4 °C после инкубации. Пластину E. coli OP50 можно безопасно хранить при 4 °C в течение 2 недель, если завернуть в парапленку для предотвращения потери влаги.
4. Приготовьте 2 л среды для роста нематод (NGM), используя рецепт, приведенный в таблице 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нистатин является необязательным. Нистатин помогает предотвратить рост плесени и других грибковых загрязнений на пластинах NGM. Большие пластины диаметром 150 мм имеют более высокую вероятность улавливания грибковых спор при снятии крышки для заливки и посева E. coli OP50. Нистатин можно приобрести предварительно смешанным в стерильном растворе у поставщиков по цене 10 000 единиц / мл или можно приобрести в виде стерильного порошка и смешать со стерильной водой. Нистатин не может быть автоклавирован, и он не может быть эффективно стерилизован. Внимание к асептической технике имеет решающее значение при смешивании раствора нистатина в лаборатории. Автоклав 1 M _CaCl2, 1 M _KPO4 pH 6,0 и 1 M _MgSO4 при 121 °C в течение 15 мин. Фильтр стерилизует холестерин через фильтр 0,22 мкм после растворения в 95% этаноле.
5. После добавления реагентов в среду разлейте НГМ в сорок 150 мм чашки Петри. Для заполнения каждой тарелки размером 150 мм требуется 50 мл. Дайте пластинам NGM остыть в течение ночи при комнатной температуре.
6. Инокулируют две конические трубки по 50 мл, содержащие 25 мл стерильного LB, e. coli OP50 из предыдущей пластины полосы. Инкубируют бульон при 37 °C в течение 24 ч в встряхивающемся инкубаторе, поддерживаемом при 200 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для консистенции инокулируйте обе трубки одной и той же одной колонией из пластины полосы. Если это окажется затруднительным, привите 5 мл стерильного LB одной колонией в конической трубке объемом 50 мл и инкубируйте культуру в течение 16 ч при 37 °C в встряхивающем инкубаторе, поддерживаемом при 200 об/мин за день до приготовления пластин NGM. Хранить свежую жидкую культуру при температуре 4 °C до двух дней. Инокулируют два 25 мл бульона 25 мкл жидкой культуры и инкубируют в тех же условиях, что и упомянутые выше.
7. Засыпьте свежие пластины NGM 1 мл свежей жидкой культуры E. coli OP50 и равномерно распределите пламенно стерилизованным распределителем по поверхности пластины, чтобы создать большой газон бактерий, который покрывает большую часть пластины, заботясь о том, чтобы не распространять бактерии от края до края. Дайте кишечной палочке OP50 расти при комнатной температуре в течение 72-96 ч или до появления заметно толстого газона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Через 24 часа переместите свежепосеянные пластины NGM в закрытый контейнер, чтобы уменьшить потерю влаги и продлить срок службы пластин.

2. Синхронизация препаратов животных и отбеливателей

1. Перенесите 5 сытых, диких, гравидных взрослых C. elegans на каждую из 10 свежих пластин NGM, засеянных кишечной палочкой OP50, в общей сложности 50 животных.
2. Дайте животным отложить яйца. Пусть потомство растет при 20 °C, пока оно не достигнет стадии взрослой особи.
3. Используйте 15 мл буфера M9 (таблица 2) для сбора новых хорошо откормленных взрослых особей дикого типа с десяти опорных пластин и перенесите животных в меченую коническую трубку объемом 15 мл.
4. Центрифугировать животных по 1000 х г в течение 3 мин, чтобы гранулировать всех животных на дне трубки.
5. В отдельной, меченной конической трубкой объемом 15 мл смешайте 2 мл отбеливателя с 5 мл 1 N NaOH для синхронизации отбеливателя. Вихрь раствор тщательно перемешать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте отбеливатель + раствор NaOH в тот же день, когда он подготовлен, чтобы быть эффективным.
6. Осторожно удалите супернатант из центрифугированных животных, используя стерильную пипетку объемом 10 мл. Попытайтесь удалить как можно больше буфера M9, чтобы улучшить разрушение животных.
7. Добавьте 500 мкл раствора отбеливателя + NaOH в гранулу животного и запустите таймер на 4 мин.
8. Либо вручную, либо с помощью коромысла аккуратно раскачивайте трубку, чтобы полностью сломать гранулу животного и позволить животным свободно двигаться в растворе отбеливателя + NaOH. Продолжайте раскачивать трубку в течение 4 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимое количество отбеливателя + раствора NaOH может варьироваться в зависимости от размера синхронизируемой гранулы животного. Оптимизируйте эту технику заранее с помощью различных количеств животных и отбеливателя + раствора NaOH.
9. Через 4 мин проверьте эффективность разрушения под рассеченным микроскопом. Убедитесь, что большинство взрослых животных разбиты, а их внутреннее содержимое высвобождается, включая яйца.
10. Если животные не расколоты, ненадолго вихрьте трубку на максимальной скорости, затем проверьте еще раз под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя яйца устойчивы к отбеливателю + раствору NaOH, они не являются непроницаемыми. Яйца не должны подвергаться воздействию отбеливателя + раствора NaOH дольше, чем это необходимо. Слишком долгое сваливание во время этапа разрушения животного может привести к проблемам развития потомства.
11. Добавьте 10 мл буфера M9 в разбитый раствор животного.
12. Центрифугируйте яйца и остатки по 1000 х г в течение 3 мин.
13. Пипетка супернатанта прочь, следя за тем, чтобы не коснуться новой гранулы, содержащей все яйца на дне трубки.
14. Добавьте еще 10 мл буфера M9 и центрифугу снова в течение 3 минут при 1000 x g.
15. Повторите шаги 2.13-2.14 еще два раза, чтобы убедиться, что ни один из растворов отбеливателя + NaOH не останется.
16. После третьей промывки буфера M9 удалите надосадочный агент и добавьте 10 мл S-базального буфера (таблица 2).
17. Переверните трубку, чтобы разбить гранулу на дне, чтобы равномерно приостановить яйца в буфере.
18. Поместите трубку на коромысло и осторожно раскачивайте трубку в течение 22 ч при 20 °C, чтобы яйца вылупились и достигли личиночной стадии 1 (L1).
19. Через 22 ч центрифугируют трубку, содержащую синхронизированных животных L1, в течение 3 мин при 1000 х г.
20. Пипетку и выбросьте супернатант, оставив примерно 1 мл буфера в пробирке.
21. Используя микропипетку, потревожите гранулу животного, чтобы сделать однородную суспензию L1 животных в оставшемся буфере.
22. Переложите одну каплю однородной суспензии животных L1 на меченую 150 мм пластину NGM, засеянную кишечной палочкой OP50.
23. Рассчитайте плотность животных на каплю, визуально подсчитывая количество животных L1 на каплю с помощью рассеченного микроскопа. Плита NGM толщиной 150 мм с полностью выросшим газоном из кишечной палочки OP50 может поддерживать до 500 животных стадии L1, чтобы достичь взрослой стадии.
24. Перенесите животных L1 на шесть 150-мм пластин NGM с E. coli OP50. Следите за тем, чтобы не перегружать пластину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если неясно, будет ли у животных достаточно пищи для развития между L1 и взрослой особью, добавьте меньше животных в каждую тарелку и используйте больше тарелок.
25. Дайте животным расти в течение 72 ч при 20 °C, пока они не достигнут стадии взрослой особи и не начнут откладывать яйца.
26. Выполните второй раунд синхронизации отбеливателя на синхронизированных, хорошо сытых взрослых животных дикого типа.
27. Поместите синхронизированных животных L1 на десять 150-мм пластин NGM, засеянных E. coli OP50, с примерно 1000 животными на пластину.
28. Позвольте новым синхронизированным животным L1 расти в течение 48 ч при 20 °C, пока они не достигнут стадии L4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы получить приблизительно 700 - 800 мкл гранулы L4 животных. Слишком много животных может затруднить использование гомогенизатора Balch; это может привести к напряжению мышц при работе гомогенизатора и возможной утечке из шприцев из-за повышенного давления.

3. Подготовка гомогенизатора Балха

1. Подготовьте как гипотонические, так и гипертонические буферы, как указано в таблице 3 и таблице 4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гипотонические и гипертонические буферы могут быть приготовлены заранее и безопасно храниться при температуре 4 °C.
2. Очистите гомогенизатор Balch, затопив камеру измельчения 70% этанолом, затем промойте камеру деионизированной водой, чтобы удалить избыток этанола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования любых едких агентов для очистки гомогенизатора Balch. Тщательного ополаскивания этанолом и деионизированной водой должно быть достаточно для его очистки.
3. Вставьте шарик из карбида вольфрама диаметром 7,9820 мм (зазор 18 мкм) в шлифовальную камеру.
4. Закройте каждый конец ствола гомогенизатора Balch и закрепите колпачки с помощью прилагаемых винтов.
5. Приготовьте 5 мл «полного гипотонического буфера» на образец: добавьте 5 мкл 1 М DTT (конечная концентрация: 1 мМ DTT) и 100 мкл 100-кратного ингибитора протеазы, одноразовый коктейль (конечная концентрация: 2x). Держите буфер на льду.
6. Приготовьте 5 мл «полного гипертонического буфера» на образец: добавьте 5 мкл 1 М DTT (конечная концентрация: 1 мМ DTT) и 100 мкл 100-кратного ингибитора протеазы, одноразовый коктейль (конечная концентрация: 2x). Держите буфер на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте полный гипотонический и гипертонический буфер в один и тот же день приготовления. Не храните его для последующего использования. Хранить 1 M DTT в виде одноразовых аликвот при -20 °C. Хранить ингибитор протеазы одноразовый коктейль при 4 °C.
7. Наполните стерильный шприц объемом 2 мл 1 мл «полного гипотонического буфера» и осторожно промывайте шлифовальную камеру гомогенизатора Balch. Оставьте примерно 500 мкл «полного гипотонического буфера» в камере.
8. Вымойте промытый гомогенизатор на льду и дайте ему остыть в течение 30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гомогенизатор должен быть ледяным перед измельчением животных. Процесс измельчения может производить тепло из-за трения и денатурировать ядерные белки. Убедитесь, что гомогенизатор металла ледяной, чтобы предотвратить это. Обязательно избегайте попадания воды из окружающего льда в гомогенизатор. Используйте два стерильных шприца, чтобы заткнуть отверстия в гомогенизаторе и заблокировать попадание любых непреднамеренных жидкостей в шлифовальную камеру.

4. Коллекция животных

ПРИМЕЧАНИЕ: Приводится краткое справочное руководство, в котором обозначены основные этапы сбора, разрушения и фракционирования животных (рисунок 1).

1. Соберите сытых животных L4 с буфером M9 в коническую трубку объемом 15 мл и центрифугируйте животных при 1000 х г в течение 3 мин. Удалите супернатант и продолжайте мыть гранулу животного до тех пор, пока супернатант не станет прозрачным.
2. Промыть животных 3 мл гипотонического буфера 4 °C и снова центрифугировать при 1000 х г в течение 3 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время заключительной промывки с гипотоническим буфером 4 °C животные могут прилипать к боковой части трубки. Это нормально и может привести к небольшой потере животных во время удаления супернатанта.
3. Удалите гипотонический буфер и добавьте 1 мл «полного гипотонического буфера» к грануле животного. Переведите суспензию животного на новый стерильный шприц объемом 2 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При переносе животных в шприц с помощью микропипетки аккуратно пипетку аккуратно нанесите стерильный 0,1% раствор Tween20, чтобы покрыть внутреннюю часть кончика пипетки, чтобы уменьшить количество животных, потерянных из-за прилипания к стенкам наконечника пипетки.

5. Фракционирование

1. На льду гомогенизируйте животных, осторожно проталкивая животных через шлифовальную камеру гомогенизатора Balch, загруженного шаром 7,9820 мм, и в новый стерильный шприц. Повторите проталкивание животных через шлифовальную камеру в течение 30 полных циклов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: "Полный цикл" определяется как полное движение плунжера шприца вверх и вниз.
   На этом этапе шлифования используется шарик 7,9820 мм (шарикоподшипник 18 мкм).
2. После 30 циклов удалите как можно больше суспензии животного из гомогенизатора Balch и сохраните шприц, опрокинув его в микропробирке объемом 1,7 мл.
3. Извлеките шарик размером 7,9820 мм из шлифовальной камеры и очистите его деионизированной водой. Высушите и верните шарик в маркированную трубку.
4. Вставьте шарик диаметром 7,9880 мм (зазор 12 мкм) в шлифовальную камеру и повторно запечатайте гомогенизатор.
5. Снова промыть камеру измельчения 1 мл ледяного «полного гипотонического буфера».
6. Шлифуйте суспензию в течение 25 полных циклов.
7. После 25 циклов извлеките суспензию животного из гомогенизатора Balch, перенесите суспензию в чистую микропробирку объемом 1,7 мл и храните ее на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разберите и очистите гомогенизатор Balch с 70% этанолом и деионизированной водой. Обязательно верните шарик диаметром 7,9880 мм в соответствующую трубку.
8. Гранулируют тела животных и мусор путем центрифугирования суспензии при 500 х г, 4 °C в течение 5 мин.
9. Пипетка 40 мкл супернатанта в трубку с надписью «входная фракция» и храните ее на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Запишите все этикетки спиртостойкой ручкой, чтобы не размазывать их позже.
10. Перенесите оставшийся супернатант в новую трубку объемом 1,7 мл, стараясь не касаться гранулы в нижней части трубки, а затем выбросьте гранулу.
11. Центрифугируйте супернатант для гранулирования ядер при 4000 х г, 4 °C в течение 5 мин.
12. Перенесите надосадочный агент, чтобы не нарушить гранулированные ядра, в новую трубку объемом 1,7 мл и пометьте трубку как «цитозольную фракцию».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугируйте цитозольную фракцию дополнительно при 17 000 х г, 4 °C в течение 30 мин, чтобы удалить любой оставшийся нерастворимый материал, и используйте его в качестве отрицательного контроля для западных блотов (особенно для ядерных белков).
13. Вымойте гранулу ядер 500 мкл «полного гипотонического буфера» и переложите гранулу в новую трубку объемом 1,7 мл. Центрифугировать суспендированную гранулу при 4,000 х г, 4 °C в течение 5 мин.
14. Выбросьте супернатант и добавьте 500 мкл свежего «полного гипотонического буфера» в ядерную гранулу и перенесите суспензию в новую трубку объемом 1,7 мл. Снова центрифугируйте образец при 4 000 х г, 4 °C в течение 5 мин.
15. Удалите супернатант и растворите гранулу в 40 мкл «полного гипертонического буфера». Перенесите новую ядерную суспензию в новую трубку объемом 1,7 мл, пометьте трубку как «ядерную фракцию» и храните ее на льду.
16. Определите концентрацию белка в трех фракциях с помощью флуоресцентного набора для количественной оценки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ядерного белка, полученного с помощью этого метода, может составлять от 1 до 2 мкг/мкл.
17. Аликвотирование ядерных фракций в одноразовые трубки, содержащие 6 мкг ядерного белка, и мгновенная заморозка в ванне с сухим льдом и этанолом. Хранить при температуре -80 °C до дальнейшего использования.

6. Транскрипционный анализ

1. Включите и разогрейте тепловой блок до 30 °C.
2. Удалите из системы транскрипции Nulcear Extract in vitro следующее: 50 мМ _MgCl2, ядерный экстракт 1x транскрипционный буфер, 100 мМ rATP, 100 мМ rCTP, 100 мМ rGTP, 100 мМ rUTP и шаблон положительного контроля промотора CMV. Оттаивание на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Амплифицируйте шаблон ДНК с положительным контролем с помощью высокоточной полимеразы и храните его в виде нормализованных одноразовых аликвот.
3. Смешайте и центрифугируйте размороженные РНКТП перед приготовлением рабочего раствора емкостью 10 мМ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 2 мкл каждого rATP, rCTP, rGTP и rUTP к 12 мкл _H2O для достижения 10 мМ каждого rNTP. При необходимости этот состав можно масштабировать.
4. Aliquot смесь rNTP к маркированным одноразовым трубкам и храните при -20 °C для будущего использования.
5. В свежую пробирку объемом 1,5 мл с маркировкой «Mastermix» добавляют реагенты для каждой реакции, как указано в таблице 5
6. Перенос 14 мкл Mastermix в каждую реакционную трубку
7. Добавьте 11 мкл минус (объем на 5 мкг ядерного экстракта) 1x транскрипционного буфера к каждой реакционной трубке.
8. Добавьте 5 мкг ядерного экстракта в каждую реакционную трубку.
9. Осторожно постучите по реакционной трубке, чтобы перемешать содержимое внутри и импульсно центрифугировать трубки после смешивания, чтобы убедиться, что реакционный материал не прилипает к стенке трубок.
10. Инкубируют реакции при 30 °C в течение 30 мин.
11. Немедленно остановите реакцию, добавив 400 мкл буфера RLT, обеспечиваемого набором для экстракции РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе безопасно остановиться. Образцы могут храниться при -80 °C до дальнейшей очистки с помощью набора для экстракции РНК.

7. Очистка РНК

1. Подготовьте раствор DNNase I, используя набор DNAse без РНКазы, поставляемый в комплекте для экстракции РНК. Растворить лиофилизированную ДНКазу I в 550 мкл воды, не содержащей РНКазы. Аккуратно перемешайте раствор. Не вихрь. Аликвотировать раствор ДНКазы I в одноразовые пробирки по 10 мкл и хранить аликвоты при -20 °С.
2. Приготовьте 70% и 80% этанола, используя молекулярный этанол и воду без РНКазы.
3. Перед началом очистки переместите образцы и реагенты в рабочее пространство, свободное от RNase.
4. Добавьте 400 мкл 70% этанола к каждому образцу и аккуратно перемешайте пипетку, чтобы хорошо перемешать.
5. Перенесите 400 мкл образца в меченую спиновую колонну экстракции РНК с трубкой для сбора 2 мл и центрифугируйте образец при 8 500 х г в течение 30 с. Отбросьте сквозной поток.
6. Повторите шаг 7.5 с оставшимся образцом и отбросьте поток.
7. Добавьте 350 мкл буфера RW1 (набор для экстракции РНК) в каждую колонку. Центрифугирование колонн при 8 500 х г в течение 30 с. Отбросьте сквозной поток.
8. Добавьте 70 мкл буфера RDD (набор для экстракции РНК) к одной аликвоте 10 мкл раствора ДНКазы I и аккуратно перемешайте. Не вихрь.
9. Добавьте инкубационную смесь ДНКазы I (80 мкл) непосредственно к мембране спиновой колонки. Инкубировать колонны при комнатной температуре в течение 15 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно добавьте раствор ДНКазы I к мембране. Избегайте потери части раствора на стенке колонны или уплотнительном кольце.
10. Через 15 минут добавьте 350 мкл буфера RW1 в столбцы. Центрифуга на 30 с при 8 500 х г. Отбросьте сквозной поток.
11. Поместите колонны в новые коллекторные трубки по 2 мл. Добавьте 500 мкл буфера RPE (комплект для экстракции РНК) в спиновую колонку. Центрифугируйте колонны при 8 500 х г в течение 30 с для промывки мембраны. Отбросьте сквозной поток.
12. Добавьте 500 мкл 80% этанола в каждую колонку и центрифугируйте колонки при 8 500 х г в течение 30 с. Отбросьте сквозной поток.
13. Поместите колонны в новые коллекторные трубки по 2 мл. Оставив крышки колонн открытыми, центрифугируйте колонны при 17 900 х г в течение 5 мин. Отбросьте сквозной поток.
14. Поместите колонны в маркированные трубки объемом 1,7 мл. Добавьте 17 мкл рваной воды непосредственно в центр мембраны спиновой колонны. Дайте колонкам отдохнуть при комнатной температуре в течение 1 мин. Центрифугирование колонн при 17 900 х г в течение 1 мин.
15. Отбросьте колонку и сохраните пробирку объемом 1,7 мл со свежеочищенным образцом РНК.

8. Переваривание ДНК

1. Разогрейте два тепловых блока при 37 °C и 65 °C.
2. Добавьте 2 мкл 10-кратного реакционного буфера к каждому образцу.
3. Добавьте 1 мкл (1 MBU) ДНКазы к каждому образцу.
4. Установите пипетку на 10 мкл и пипеткой новый раствор вверх и вниз аккуратно перемешайте. Не вихрь.
5. Инкубируйте образцы РНК при 37 °C в течение 30 минут, чтобы переварить оставшуюся ДНК.
6. Инактивируют ДНКазу путем инкубации образцов на тепловом блоке при 65 °C в течение 10 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасно остановиться на этом этапе и сохранить РНК при -80 °C, чтобы выполнить обратную транскрипцию позже.

9. Обратная транскрипция

1. При программировании термоциклера добавьте дополнительный шаг 1 ч, 37 °C перед инкубацией, чтобы предварительно нагреть термоциклер. Запустите программу с «шагом предварительного нагрева» во время подготовки образцов и дайте термоциклеру достичь 37 °C. Когда образцы для обратной транскрипции будут готовы, пропустите стадию предварительного нагрева 37 °C и перейдите к фактической стадии инкубации (таблица 6). Если термоциклер не имеет функции пропуска, добавьте шаг 1 мин 37 °C перед инкубацией. Дайте термоциклеру нагреться до надлежащей температуры, прежде чем приостанавливать систему и добавлять подготовленные образцы.
2. Подготовьте рабочий раствор транскрипционного реверсивного праймера 10 мкМ в _H2O без РНКазы и храните его на льду.
3. Оттаивание на льду, 10-кратный буфер из набора обратной транскрипции, смесь dNTP (5 мМ каждый dNTP), ингибитор РНКазы и обратная транскриптаза.
4. Приготовьте Mastermix (на реакцию), добавив компоненты, указанные в таблице 7 , в чистую ПЦР-трубку объемом 0,2 мл.
5. Aliquot 18 мкл Mastermix в новые 0,2 мл ПЦР-пробирки для каждого образца.
6. Добавьте 2 мкл обработанной ДНКазой РНК для каждого образца в их соответственно меченые пробирки.
7. Инкубируйте образцы при 37 °C в течение 1 ч в предварительно нагретом термоциклере.
8. Переместите образцы до -20 °C для хранения после обратной транскрипции или перейдите непосредственно к следующему шагу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом шаге безопасно остановиться; хранить кДНК при -20 °C для последующего использования.

10. Удельное усиление продукта

1. Оттаивание на льду: кДНК, транскрипция 10 мкМ вперед и 10 мкМ транскрипция обратных праймеров, а также ПЦР 2x премикс А.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Aliquot PCR 2x Premix A в меньшие объемы, чтобы уменьшить время оттаивания.
2. Создайте Mastermix (на реакцию), добавив компоненты, упомянутые в таблице 8 , в чистую ПЦР-трубку объемом 0,2 мл.
3. Aliquot 24 мкл Mastermix для каждого образца в чистые маркированные 0,2 мл ПЦР-пробирки.
4. Добавьте 1 мкл кДНК каждого образца в соответствующие пробирки.
5. Инкубация образцов в термоциклере с использованием программных условий, указанных в таблице 9
6. После инкубации храните продукты ПЦР при 4 °C или -20 °C для более длительного хранения.

11. Анализ геля

1. Используйте 1x TAE буфер для приготовления геля, который содержит 2% мас./об.агарозы и 1x гелевое пятно.
2. Запускайте продукты ПЦР при 50 В и 300 мА в течение 1 ч или до тех пор, пока не произойдет четкое разделение полос.
3. Визуализируйте гель с помощью автоматизированной программы экспозиции, предварительно загруженной в гель-тепловизор.

Результаты

Следуя описанным шагам, следует получить функциональный ядерный экстракт (рисунок 1), отклонение на этапах измельчения или промывки может привести к плохой активности или низкому выходу. Если получен функциональный ядерный экстракт C. elegans , он будет транскрибировать область ниже по течению от промотора ЦМВ на шаблоне ДНК при добавлении к ранее описанному анализу in vitro . Полученный транскрипт РНК может быть очищен от ядерных белков и ...

Обсуждение

C. elegans является привлекательным модельным организмом для изучения системы эукариотической транскрипции из-за ее недорогого обслуживания и простоты генетических манипуляций. Здесь описан протокол последовательного выделения функционально активного ядерного экстракта из L4 C. elegans. Хотя этот протокол был сосредоточен на визуализации транскрипционной активности, кДНК, полученная посттранскрипционно, может быть количественно определена с использованием RT-qPCR для получения более точного измерения ак...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
<сильно>Расходные материалы и реагенты
0,2 мл 8-полосковые пробирки и Плоские полосатые колпачки, прозрачные Genesee	Scientific	24-706
0,2 мл Индивидуальные ПЦР-пробирки	Genesee Scientific	24-153G
1,7 мл стерильные микропробирки	Genesee Scientific	24-282S
100% абсолютный молекулярный этанол	Fisher Scientific	BP2818
100% этанол, Koptec	Decon Labs	V1001
10 мл серологическая пипетка	VWR international	89130-898
Пластины Петри 150 мм	Tritech Research	T3325
Конические центрифужные пробирки 15 мл	Genesee Scientific	28-103
Пластиковые шприцы 20 мл	Fisher Scientific	14955460
2 мл Шприцы Norm-Ject	Henke-Sass Wolf	GmbH 4020
500 мл вакуумный фильтрующий стакан 0,22 &; m PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 мл конические центрифужные пробирки	ThermoFisher Scientific	339652
50 мл серологические пипетки	VWR international	89130-902
Серологическая пипетка 5 мл	VWR international	89130-896
Агар, Criterion	VWR International	C7432
Агароза	Денвилл Научный	CA3510-6
Маркер для защиты от алкоголя	VWR International	52877-310
Бактопептон	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Дихлорид кальция	Millipore Sigma	C4901
Холестерин	многопоровый сигма	C8667
Контрольные праймеры для клонирования храма ДНК, Forward 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg tcg atc cgg gc -3'
Контрольные праймеры для клонирования храма ДНК, Forward 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3'
Деионизированная вода
Дитиотреитол	Инвитроген	15508-013
ДНК гелевая краска, безопасная для SYBR	Invitrogen	S33102
Лестничная смесь DNA, O' линейка генов	Fisher Scientific	SM1173
Краситель для загрузки ДНК, 6x TriTrack	Fisher Scientific
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen
Сухой лед
Escherichia coli штамм OP50	CGC	OP50
Ледяная уксусная кислота	Fisher Scientific	А38
Глицерин	Многопоровый Сигма	G6279
Система транскрипции ядерного экстракта HeLa in vitro, HeLaScribe	Promega	E3110
Раствор Hepes, 1 м Gibco	Millipore Sigma	15630080
соляной кислотой 37%	Millipore Sigma	P0662
Гипохлоритный отбеливатель	Clorox
LB Бульон	Millipore Sigma	L3022
Дихлорид магния	Millipore Sigma	M8266
Сульфат магния	с миллипорами Sigma	M7506
Тарелки среднего веса	Fisher Scientific	02-202-101
предметные стекла для микроскопа, Vista vision	VWR International	16004-368
молекулярная вода, Hypure	Hyclone Laboratories
Нистатин	Миллипор Сигма	N1638
ПЦР-система, FailSafe с премиксом A	Lucigen
Хлорид калия	Millipore Sigma	P39111
Двухосновной фосфат калия	Millipore Sigma	P3786
Фосфат калия одноосновной	Millipore Sigma	P0662
Ингибитор протеазы, Halt одноразовый коктейль 100x	ThermoFisher Scientific	78430
набор для анализа белка, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
набор для обратной транскрипции, Sensiscript	Qiagen	205211
набор для экстракции РНК RNeasy микронабор	Qiagen	74004
Ингибитор РНКазы	Applied Biosystems
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12 кг
Гидроксид натрия	Millipore Sigma	1-09137
Стерильный шприцевой фильтр с 0,2 мк; m Полиэфирсульфоновая мембрана	VWR international	28145-501
Сахароза	VWR International	200-334-9
транскрипционные праймеры, Forward 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'
праймеры для транскрипции, Reverse 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'
Трис-Бейс	Фишер Научный	BP152
Твин 20	миллипор Сигма	P2287
Оборудование
-20 ° C инкубатор	ThermoFisher Scientific
20° C инкубатор	ThermoFisher Scientific
37° C инкубатор	Forma Scientific
4 ° C холодильник	ThermoFisher Scientific-80
deg; C морозильная камера	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch гомогенизатор, гомогенизатор клеток isobiotec
Настольный вихревой аппарат	Fisher Scientific	2215365
центрифуга, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
центрифуга, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Диссекционный микроскоп, Leica M80	Флуориметр Leica Microsystems
, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Гелевая система визуализации, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Гелевая система	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Микроцентрифуги, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY ACU 2	Integra	155017
Пипетка L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
пипетка L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
пипетка L-200 XLS+, пипетка Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
пипетка L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
платформа-качалка	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010