Методическая статья

Создание электрофизиологической платформы для моделирования БАС с регионально-специфическими человеческими плюрипотентными астроцитами и нейронами, полученными из стволовых клеток

DOI:

10.3791/62726

⸱

26 августа 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Johns Hopkins University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описан метод дифференциации индуцированных человеком плюрипотентных астроцитов и нейронов спинного мозга и их кокультуры для электрофизиологической записи.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческие плюрипотентные астроциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-A) и нейроны (hiPSC-N), обеспечивают мощный инструмент для моделирования патофизиологии бокового амиотрофического склероза (БАС) in vitro. Записи многоэлектродной решетки (MEA) являются средством регистрации потенциалов электрического поля от больших популяций нейронов и анализа сетевой активности с течением времени. Ранее было продемонстрировано, что наличие hiPSC-A, которые дифференцируются с использованием методов продвижения фенотипа астроцитов спинного мозга, улучшает созревание и электрофизиологическую активность регионально специфических hiPSC-моторных нейронов спинного мозга (MN) по сравнению с теми, которые культивируются без hiPSC-A или в присутствии астроцитов грызунов. Здесь описан метод совместного культивирования спинного мозга hiPSC-A с hiPSC-MN и регистрации электрофизиологической активности с использованием записей MEA. В то время как протоколы дифференцировки, описанные здесь, характерны для астроцитов и нейронов, которые регионально специфичны для спинного мозга, платформа кокультурирования может быть применена к астроцитам и нейронам, дифференцированным с помощью методов, специфичных для других судеб, включая корковый hiPSC-A и hiPSC-N. Эти протоколы направлены на предоставление электрофизиологического анализа для информирования о взаимодействиях глиа-нейронов и обеспечения платформы для тестирования лекарств с терапевтическим потенциалом при БАС.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческие плюрипотентные астроциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-A) и нейроны (hiPSC-N), являются мощными инструментами для моделирования патофизиологии бокового амиотрофического склероза (БАС) in vitro и обеспечивают трансляционную парадигму для стратегий открытия лекарств1. Исследователи продемонстрировали, что кокультура hiPSC-A с hiPSC-N усиливает морфологическое, молекулярное, электрофизиологическое и фармакологическое созревание обоих типов клеток, генерируя сложные нейронные сети и взаимодействия астроцитов и нейронов, которые напоминают их аналоги in vivo 2,3. Подобные эксперименты с кокультурой могут повторить признаки патобиологии БАС, такие как астроцитарно-опосредованная нейротоксичность 4,5 и нейрональная гипервозбудимость6. Кроме того, благодаря достижениям в протоколах дифференцировки, индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) могут быть дифференцированы в регионально-специфические нервные подтипы, включая кортикальный и спинной мозг hiPSC-A и hiPSC-N 7,8. Эти стратегии обеспечивают потенциал для моделирования патологии кортикальных и спинальных двигательных нейронов при БАС, а также астроцитарного влияния на оба. Однако для этого требуется воспроизводимый функциональный анализ для определения этих эффектов.

Недавно было показано, что запись многоэлектродной решетки (МЭА) особенно подходит для электрофизиологической характеристики нейрон-астроцитарных кокультур2. В отличие от одноклеточных электрофизиологических анализов, эти электродные массивы высокой плотности пассивно регистрируют потенциалы внеклеточного поля от больших популяций нейронов, не нарушая условия культивирования и сохраняя целостность клеточных мембран. Эти платформы особенно полезны для записи клеточной и сетевой активности культур с течением времени и в ответ на фармакологические манипуляции. Наконец, когда присутствие астроцитов является переменной культуры, записи MEA могут обеспечить функциональное понимание двунаправленных взаимодействий астроцитов и нейронов 2,9.

Здесь представлен оптимизированный протокол для дифференциации hiPSC в hiPSC-A спинного мозга и hiPSC-моторные нейроны (MN), который был ранее проверен2. Протокол дифференцировки hiPSC-A спинного мозга последовательно приводит к культурам астроцитов, которые являются положительными для S100 кальций-связывающего белка B (S100β), глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и гомеобокса B4 (HOXB4) в 80%, 50% и 90% клеток соответственно, что указывает на созревание глиального и спинного мозга 2,10 . Протокол дифференцировки hiPSC-MN генерирует нейроны, которые >90% положительны для холина ацетилтрансферазы (ChAT), что наводит на мысль о зрелой идентичности альфа-моторных нейронов2. Кроме того, протокол описывает методы генерации кокультур hiPSC-A/MN, которые, как было ранее продемонстрировано, приводят к появлению нейронов с повышенной морфологической сложностью с помощью анализа Шолля и иммунофлуоресцентной микроскопии по сравнению с нейронными культурами без астроцитов или с астроцитами грызунов2. Хотя эти описания специфичны для спинного мозга hiPSC-A и hiPSC-N, уникальное преимущество заключается в том, что первоначальная независимая культура астроцитов и нейронов, за которой следуют шаги по совместной культивированию в более поздние моменты времени, может быть переведена для изучения эффектов взаимодействия нейронов-астроцитов из других конкретных областей, а также специфических для заболевания клеток 7,8 . Наконец, протокол описывает, как выращивать эти культуры на пластинах MEA, чтобы функциональная активность как фактор состава кокультуры могла быть изучена с течением времени с возможностью манипулировать клеточным составом, а также условиями культуры.

Целью этих протоколов является предоставление функционального анализа для исследования взаимодействий астроцитов и нейронов, изучения специфических для заболевания изменений и тестирования лекарств с терапевтическим потенциалом в области БАС. Видеоинструкции приведены для наиболее сложных шагов этого протокола.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка среды для клеточных культур

  1. Подготавливают отдельные клеточные питательные среды, используя композиции, указанные в таблице 1.
  2. Смешайте и стерильно фильтруйте среду в бутылках с фильтром по 500 мл и храните защищенными от света при 4 °C в течение 2 недель.

2. Поддержание и передача несмешивающихся человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC)

  1. Разморозить матрицу базальной мембраны (хранить в аликвотах при -80 °C) в холодильнике с температурой 2-8 °C на ночь.
  2. Разбавьте матрицу базальной мембраны при 1:100 (v/v) в холодном фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) или модифицированной среде Dulbecco Eagles Medium (DMEM).
  3. Добавьте достаточное количество матрицы базальной мембраны для покрытия нижней части пластины культуры ткани (5 мл для пластины размером 10 см, 2 мл для одиночных лунок из 6-луночной пластины) и инкубируйте при 37 °C в течение минимум 30 мин в течение ночи или при комнатной температуре в течение минимум 1 ч.
  4. Аспирируйте разбавленную матрицу базальной мембраны и промывайте пластину один раз PBS перед добавлением культуральной среды и посевных клеток.
  5. Ежедневно осматривайте пластины, чтобы определить и предвидеть, когда они будут готовы к прохождению. Проходные пластины hiPSC когда-то большинство колоний стали достаточно плотными, так что в центре колоний отображаются разбросанные белые участки. Не позволяйте пластинам созревать после этой точки. Это вызовет избыточную дифференцировку, приводящую к появлению желтой области в центре колоний из-за многослойности клеток, переизбытка удлиненных клеток по краям, рыхлой компактности внутри колоний или повышенной гибели клеток.
  6. В день прохождения проведите линии сетки на нижней наружной поверхности плит маркером, чтобы облегчить точное покрытие всей плиты.
  7. Отсоедините дифференцированные колонии в культуральной вытяжке с помощью фазоконтрастного микроскопа (10-кратное увеличение), вручную соскребая наконечник пипетки объемом 200 мкл.
  8. Дважды промойте пластины PBS (5 мл на стирку на 10 см пластины).
  9. Добавьте 5 мл предварительно подогретой тканевой диссоциационной протеазы (Таблица материалов) и инкубируйте клетки при 37 °C до тех пор, пока края колоний не начнут округляться (4-7 мин), но до того, как колонии выйдут из пластины.
  10. Осторожно аспирируйте диссоциационную протеазу. Осторожно промойте тарелку дважды PBS, стараясь не выбить колонии.
  11. Добавьте 5 мл предварительно нагретой среды hiPSC (таблица 1) в культуральную пластину.
  12. Поднимите колонии, разбив их на более мелкие клеточные агрегаты, поцарапав всю пластину кончиком пипетки объемом 5 мл, используя движение вперед-назад сверху вниз.
  13. Поверните пластину на 90° и повторите описанный выше шаг.
  14. Аккуратно тритурируйте клеточные агрегаты путем пипетки вверх и вниз пипеткой 5 мл и периодически проверяйте размер агрегатов под микроскопом, пока большинство клеточных агрегатов не составят приблизительно 50-100 клеток.
  15. Засейте клеточные агрегаты в предварительно покрытые матричные пластины базальной мембраны, используя дополнительную среду hiPSC для промывки исходной пластины. Соберите и переложите большую часть клеточных агрегатов на новые пластины с помощью пипетки объемом 5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если протокол применяется последовательно, оригинальная пластина должна содержать колонии iPSC, покрывающие приблизительно 50% поверхности культуры до прохождения. При этом соотношение расщепления должно составлять от одной пластины до пяти новых пластин. Однако это, возможно, потребуется скорректировать в зависимости от условий роста и темпов роста, специфичных для клеточной линии.
  16. Встряхните только что посеянные пластины вперед и назад, чтобы равномерно распределить агрегаты.
  17. Перенесите пластины в инкубатор (37 °C и 5% CO2) и оставьте их нетронутыми на ночь, чтобы обеспечить надлежащую адгезию клеток.
  18. Выполняйте полную смену среды каждый день с 10 мл среды hiPSC. При наличии избытка клеточного мусора на следующий день после прохождения промыть один раз 5 мл среды перед сменой среды.
  19. Планируйте прохождение следующим, когда белые области появятся в центре большинства колоний iPSC (шаг 2.5). Это будет происходить через 4-6 дней после каждого прохождения.

3. Замораживание hiPSC

  1. Выполните начальные шаги, как показано в шагах 2.5-2.14 для прохождения hiPSC.
  2. Соберите клеточные агрегаты в пробирку объемом 15 мл и вращайте при 200 х г в течение 2 мин.
  3. Аспирировать супернатант, повторно суспендировать гранулу в морозильной среде и перенести в криотрубы с помощью пипетки объемом 5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подобно шагам прохождения, обычное соотношение расщепления составляет одну пластину iPSC на пять криотрубок, в зависимости от плотности колоний. Используйте общий объем 1 мл морозильной среды для каждой криотрубы.
  4. Поместите криотрубы в охлажденный криоконсервационный контейнер и переложите его до -80 °C на ночь.
  5. Переведите клетки на жидкий азот через 24 ч.

4. Размораживание hiPSC

  1. Покрыть пластину размером 10 см матрицей базальной мембраны (см. 2.1-2.3).
  2. Извлеките криотрубу iPSC из жидкого азота и немедленно поместите ее на водяную баню с температурой 37 °C на срок до 2 мин, чтобы быстро оттаять. Встряхните флакон в ванне до тех пор, пока он частично не разморозится и не будет содержать небольшой кусочек льда, окруженный жидкостью.
  3. Перенесите клеточные агрегаты из криотрубы в коническую трубку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 1000 мкл. Добавьте до 15 мл предварительно нагретой среды hiPSC для разбавления диметилсульфоксида (ДМСО) в морозильной среде.
  4. Центрифугировать коническую трубку объемом 15 мл при 200 х г в течение 2 мин.
  5. Аспирировать надосадочный агент и использовать пипетку 5 мл для повторного суспендирования клеточной гранулы в среде hiPSC, содержащей 20 мкМ Rho-ассоциированного спирально-образующего ингибитора серина/треонинкиназы (ROCK-I, соединение Y-27632), чтобы избежать дальнейшего тритурации клеточных агрегатов.
  6. Переложите клеточные агрегаты на пластину с матричным покрытием базальной мембраны размером 10 см с помощью пипетки объемом 5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если протокол применяется последовательно, ячейки в одной криотрубе могут быть перенесены на одну пластину размером 10 см.
  7. Встряхните тарелку, чтобы распределить агрегаты равномерно.
  8. Переложите пластинку в инкубатор и оставьте ее ненарушенной на ночь, чтобы обеспечить надлежащую адгезию клеток.
  9. Выполните полную смену среды на следующий день после оттаивания с 10 мл среды hiPSC без ROCK-I.

5. Дифференцировка hiPSC в нейронные клетки-предшественники спинного мозга (NPC)

  1. Убедитесь, что 6-луночные пластины с покрытием фундаментной мембраны с покрытием из 6 скважин готовы к использованию до начала дифференцировки.
  2. Начните с iPSC, которые были пройдены по меньшей мере один раз, а предпочтительно два раза после размораживания и с по меньшей мере четырех пластин размером 10 см (см. объяснение на этапе 5.11).
  3. Выполните начальные шаги, как показано в шагах 2.5-2.14 для прохождения hiPSC.
  4. Переложите ячейки заполнителей с по меньшей мере двух пластин размером 10 см в трубку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 5 мл.
  5. Центрифуга при 200 х г в течение 2 мин.
  6. Аспирируйте надосадочный агент и повторно суспендируйте клеточную гранулу 10 мл среды hiPSC с помощью пипетки объемом 10 мл, а затем снова центрифугируйте при 200 х г в течение 2 мин, чтобы ослабить клеточные спайки в каждом агрегате.
  7. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клеточную гранулу в 1 мл среды hiPSC, содержащей 20 мкМ ROCK-I, используя пипетку объемом 1000 мкл.
  8. Пипетка вверх и вниз с пипеткой 1000 мкл для тритурации клеточных агрегатов. Периодически проверяйте размер агрегатов под микроскопом, пока большая часть клеточной суспензии не состоит из одиночных клеток или небольших агрегатов из <10 клеток.
  9. Подсчитайте ячейки с помощью гемоцитометра (предпочтительно) или автоматизированного счетчика клеток и рассчитайте плотность клеток в клеточной суспензии.
  10. Пластина 3,0 х 106 ячеек в каждой скважине из 6-луночной пластины предварительно покрытой базальной мембранной матрицей. Используйте пипетку объемом 1000 мкл для переноса клеточной суспензии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если протокол применяется последовательно, это соответствует соотношению двух пластин по 10 см в одну скважину из 6 скважин/плит.
  11. Повторите этапы 5.3-5.10 со второй партией из двух 10-сантиметровых пластин и нанесите конечный продукт на основную мембранную матрицу, покрытую скважиной второй 6-луночной пластины. Используйте пипетку объемом 1000 мкл для переноса клеточной суспензии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальное завершение протокола NPC спинного мозга требует двух лунок, равных четырем пластинам по 10 см. Для удобства рабочего процесса выполните этапы 5.3- 5.10 с двумя партиями по две пластины, каждая из которых представляет собой два отдельных 6-луночных листа и каждую с одной скважиной, содержащей 3,0 х 106 ячеек в ней.
  12. Поддерживайте полученный монослой iPSC человека в среде hiPSC, содержащей 20 мкМ ROCK-I, до тех пор, пока слияние не достигнет >90%, как правило, на следующий день, но не более чем через 3 дня после первоначального покрытия, чтобы избежать спонтанной (неконтролируемой) дифференцировки.
  13. Если дифференцировка не может быть начата на следующий день после покрытия клеток, промывайте клетки один раз PBS и ежедневно меняйте среду на свежую среду hiPSC, содержащую 20 мкМ ROCK-I. Если он не сливается >90% в течение 3 дней после покрытия, выбросьте клетки и начните протокол заново.
  14. Как только >90% слияния достигнут, начните дифференциацию. Это день in vitro 1 (DIV1) протокола дифференциации.
  15. На DIV 1 отбросьте среду hiPSC, содержащую 20 мкМ ROCK-I, и дважды промойте PBS, чтобы удалить фактор роста плода (FGF) и трансформирующий фактор роста-бета (TGFβ), присутствующий в среде стволовых клеток.
  16. Замените среду на среду WiCell (таблица 1), дополненную 0,2 мкМ LDN193189 (LDN) и 10 мкМ SB431542 (SB) в течение 48 ч.
  17. На DIV 3 промыть один раз PBS и поменять среду на среду WiCell, дополненную LDN (0,5 мкМ) + SB (10 мкМ) + ретиноевой кислотой (РА; 1 мкМ) в течение 48 ч.
  18. На DIV 5 промыть один раз PBS и поменять носитель на WiCell: основание нейронной индукционной среды (NIM) (таблица 1) (50%:50%, v/v) с добавлением LDN (0,5 мкМ) + SB (10 мкМ) + RA (1 мкМ) в течение 48 ч.
  19. На DIV 7 выполните обмен средой с той же средой, что и на шаге 5.18.
  20. На DIV 8 промыть один раз PBS и изменить среду на основание WiCell: NIM (50%:50%) с добавлением РА (1 мкМ) + пуроморфамина (PMN) (1 мкМ) + рекомбинантного нейротрофического фактора человеческого мозга (BDNF) (10 нг / мл) + аскорбиновой кислоты (ASAC) (0,4 мкг / мл) в течение 48 ч.
  21. На DIV 10 промыть один раз PBS и заменить среду на основание NIM (100%), дополненное, как указано в шаге 5.20 в течение 48 ч.
  22. На DIV 11 или 12 покройте стерильную культуральную колбу размером25 см2 базальной мембранной матрицей при подготовке к прохождению.
  23. Аспирируйте среду из каждой лунки 6-луночной пластины l и промывайте клетки один раз PBS.
  24. Добавить в каждую лунку 2 мл 0,05% трипсина и инкубировать при 37 °С в течение 5-15 мин; периодическое встряхивание пластин может помочь в отслоении клеток.
  25. Если ячейки все еще не находятся в суспензии, отсоедините механически, выталкивая среду NIM из наконечника пипетки объемом 1000 мкл на ячейки круговым движением (обязательно покрывайте всю поверхность) или соскребая с помощью скребка для ячеек (не предпочтительно).
  26. Перенесите клетки из 2 лунок в трубку объемом 15 мл и добавьте ингибитор трипсина в соответствующей пропорции к количеству трипсина, используемого с использованием пипетки 5 мл.
  27. Центрифуга при 200 х г в течение 2 мин, аспирируют супернатант, а затем повторно суспендируют 10 мл основания NIM с помощью пипетки 10 мл.
  28. Центрифугу снова при 200 х г в течение 2 мин, чтобы ослабить межклеточные спайки.
  29. После второй стадии центрифугирования удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу с 1 мл среды NIM (100%), дополненной РА (1 мкМ) + ПМН (1 мкМ) + BDNF (10 нг/мл) + ASAC (0,4 мкг/мл) и ROCK-I (20 мкМ). Используя наконечник пипетки объемом 1000 мкл, тритурируйте клетки вверх и вниз примерно пять раз, пока не получится мутная суспензия.
  30. Повторно засевают агрегаты в этой среде в матрицу базальной мембраны, покрытую 25см2 стерильной колбой для культивирования таким образом, что конечным результатом является объединение клеток из двух скважин из 6-луночной пластины в одну основную мембрану, покрытую матрицей 25см2 стерильной колбы для культивирования (проход 2:1). Используйте пипетку объемом 1000 мкл для переноса клеточной суспензии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки должны быть >90% сливающимися на DIV 13, и никаких дальнейших шагов не требуется до 14-го дня. Если клетки не сливаются, держите ROCK-I в среде еще 1 или 2 дня.
  31. На DIV 14 измените среду на свежую среду NIM + RA (1 мкМ) + PMN (1 мкМ) + BDNF (10 нг/мл) + ASAC (0,4 мкг/мл).
  32. На DIV 15 измените среду на NIM: основание нейронной дифференцировки (NDM) (таблица 1) (50%:50%) с РА (1 мкМ) + PMN (1 мкМ) + ASAC (0,4 мкг/мл) + добавка B (50x) + BDNF (10 нг/мл) + нейротрофический глиально-клеточный линейный (GDNF) (10 нг/мл) + инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) (10 нг/мл) + цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) (10 нг/мл). Меняйтесь свежими медиа через день.
  33. На DIV 21 измените среду на основание NDM (100%), дополненное как на шаге 5.32, и измените на свежую среду через день.
  34. На DIV 25-30 соберите NPC и либо заморозьте их, либо переместите на пластину размером 10 см для дифференциации терминалов.
  35. Промыть колбу Т-25 PBS и добавить 0,05% трипсина.
  36. Инкубировать в течение 5 мин при 37 °C.
  37. Промыть трипсин и клетки основанием NDM и перенести в коническую трубку объемом 15 мл. Добавляют ингибитор трипсина в соответствующей пропорции к трипсину и центрифуге по 300 х г в течение 5 мин.
  38. Повторно суспендируют клеточную гранулу с помощью моторного нейрона или среды дифференцировки астроцитов (таблица 1) и используют пипетку объемом 1000 мкл для тритурации вверх и вниз с получением одноклеточной суспензии (обычно до 5 раз).
  39. Подсчитайте клетки и переведите на пластину размером 10 см, покрытую, как описано в разделе 6, используя либо дифференцирующую среду + Rock-I, чтобы дифференцировать hiPSC-MN и hiPSC-A.
  40. Альтернативно, заморозить культуры путем повторного использования в морозильной среде, состоящей из 90% среды NDM с факторами роста (как на этапах 5,32-5,33) и 10% DMSO, тритурировать аналогичным образом, а затем перенести в криотрубу. Aliquot 6 x 106 NPC на криотрубу.

6. Оттаивание NPC культур

  1. Обложите 10 см пластины полиорнитином (PLO) и ламинином за день до размораживания клеток.
    1. Добавьте к пластинам 5 мл ООП, разбавленной до 100 мкг/мл в ПБС или дистиллированной воде (dH2O). Инкубировать при 37 °C в течение минимум 1 ч до ночи.
    2. Аспирируйте раствор PLO и трижды промойте пластины PBS. (PLO токсичен, если его неправильно промыть.)
    3. Добавьте ламинин, разбавленный в PBS, до концентрации 10 мкг/мл к пластинам, покрытым PLO. Инкубировать при 37 °C в течение минимум 1 ч, предпочтительно в течение ночи. После инкубации аспирируют раствор ламинина без промывки для усиления клеточной адгезии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины могут быть покрыты PLO заранее, вымыты три раза водой, высушены в стерильном капюшоне и сохранены при температуре 4 °C.
  2. Разморозьте один флакон NPC (т.е. DIV 25 или 30), содержащий 6 x 106 клеток/флакон для каждой 10 см клеточной культуральной пластины.
  3. Извлеките криотрубу NPC из жидкого азота и поместите сразу же на водяную баню с температурой 37 °C на срок до 2 мин. Быстро оттаивайте, встряхивая флакон, пока не появится небольшой кусочек льда, окруженный жидкостью.
  4. Переместите клеточные агрегаты в коническую форму объемом 15 мл с использованием пипетки 1000 мкл и добавьте до 15 мл предварительно нагретого NDM или добавки Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) / Ham F21 F12 для разбавления DMSO.
  5. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
  6. Аспирируйте надосадочный агент, повторно суспендируйте клеточную гранулу либо астроцитарной, либо МН-дифференцировочной средой (таблица 1) + ROCK-I (20 мкМ) и используйте пипетку объемом 1000 мкл для тритурации вверх и вниз до получения одноклеточной суспензии (до 5 раз).
  7. Перенесите одноэлементную суспензию на пластину с покрытием PLO-Laminin размером 10 см.
  8. Перенесите пластину в инкубатор и оставьте ее ненарушенной на ночь, чтобы обеспечить надлежащую адгезию клеток.

7. Дифференциация NPC спинного мозга в двигательные нейроны

  1. Выполните начальные этапы, как указано в шагах 6.1-6.8, при этом конечной средой является среда дифференциации MN + ROCK-I (20 мкМ).
  2. На следующий день после нанесения покрытия выполняют полный обмен среды с средой дифференцировки MN без ROCK-I, а затем меняют носитель через день. В выходные дни кормите клетки в пятницу, а затем снова в понедельник. Промывайте клетки PBS, когда это необходимо, чтобы удалить клеточный мусор.
  3. Изменять среду с помощью среды дифференцировки MN + цитозина арабинозида (ARA-C) (0,02 мкМ) и инкубировать в течение 48 ч, когда глиальные преданные предшественники появляются в виде одиночных пролиферирующих плоских клеток под постмитотическими предшественниками MN, агрегированными в клеточных кластерах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно это происходит в течение первых 7 дней после первоначального покрытия, хотя может быть изменчивость в зависимости от клеточной линии.
  4. Через 48 ч аспирировать среду, содержащую ARA-C, аккуратно промыть культуры PBS три раза и изменить среду на свежую среду MN без ARA-C.
  5. После лечения ARA-C выполняйте обмен средой через день (или в понедельник, среду и пятницу), удаляя старую среду с помощью ручной пипетки, а не вакуумного аспиратора, чтобы предотвратить преждевременное отсоединение кластеров нейронов. Кроме того, обогащайте среду MN ламинином 1 мкг/мл один раз в неделю для дальнейшего усиления прикрепления нейронов к культуральным пластинам.

8. Дифференциация NPC в астроциты спинного мозга

  1. Размораживать NPC-культуры, как в разделе 6, используя среду дифференцировки астроцитов (таблица 1) с добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS) с объемом объемной концентрации 1% (NS + 1% FBS), а также ROCK-I (20 мкМ) для покрытия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступная замена сыворотки (таблица 1) может быть заменена на FBS с использованием тех же коэффициентов разбавления.
  2. На следующий день после нанесения покрытия меняют культуральную среду на NS+1% FBS среду без ROCK-ингибитора, а затем меняют среду через день. В выходные дни кормите клетки в пятницу, а затем снова в понедельник. Промывайте клетки PBS, когда это необходимо, чтобы удалить клеточный мусор. Если клетки продолжают умирать, дополните среду ROCK-I (10 мкМ), чтобы способствовать выживанию клеток. Будьте осторожны, чтобы не использовать ROCK-I слишком часто или слишком долго, учитывая потенциал для выбора бессмертных клеток.
  3. Позвольте астроцитам стать сливающимися, прежде чем пропускать их.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер ячейки будет увеличиваться с течением времени, поэтому нет установленного числа для прохождения. Типичный коэффициент пропускания составляет 1:2 или 1:3. В случае плохой выживаемости или перехода к слишком большому количеству пластин, объедините две (или более, по мере необходимости) пластины 10 см в одну пластину 10 см для поддержания слияния.
  4. Для прохождения культур-предшественников астроцитов промыть пластины один раз PBS (для удаления FBS), инкубировать с 0,05% трипсином в течение 5 мин, собрать клетки в NS-среде + 1% FBS (FBS инактивирует трипсин), а затем центрифугировать при 300 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант, повторно суспендируйте клетки в среде NS + 1% FBS, а затем тритурируйте до одноклеточной суспензии. Распределите ячейки в NS + 1% FBS на новые 10 см пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к расширению культур астроцитов, повторное прохождение пластин служит цели уничтожения любых оставшихся клеток-предшественников, которые выбрали судьбу нейронов. Поэтому, даже если существует не очень высокая митотическая скорость, пластины могут проходить в соотношении 1:1, если кажется, что есть нейронное загрязнение.
  5. Меняйте покрытие в ходе дифференциации для повышения выхода следующим образом.
    1. Нанесите первоначально размороженные культуры NPC и первые проходы после первоначального покрытия на PLO/Laminin.
    2. Пластинчатость незрелых астроцитов на базальной мембране матрицы покрыта пластинами.
    3. Пластинчатые более зрелые астроциты (т.е. после 90-го дня) либо на матрице базальной мембраны, либо на пластинах, покрытых PLO/Laminin (обычно для совместной культивации с нейронами), либо на пластинах без покрытия.
  6. Заморозьте предшественников астроцитов в любой момент времени в течение 60-дневного периода созревания, чтобы синхронизировать культуры или сохранить для последующих экспериментов. При оттаивании за пределами стадии NPC разморозьте предшественников астроцитов на пластинах, покрытых матрицей базальной мембраны, а не НА PLO / Laminin.
  7. При DIV 90 и после этого переключите среду с NS + 1% FBS на NS + 5% FBS, чтобы способствовать выживаемости астроцитов и уменьшить их пролиферацию.

9. Совместное культивирование MN и астроцитов спинного мозга в многоэлектродных пластинах

  1. Дифференцируют и пластинчат двигательные нейроны и астроциты, когда они будут готовы к использованию в тот же день и состарятся до DIV 60 для двигательных нейронов и DIV 90 для астроцитов.
  2. Нанесите покрытие на пластины MEA за день до или в день нанесения покрытия следующим образом при работе с 24-луночными пластиковыми пластинами (Таблица материалов).
  3. Разбавить PLO в воде или PBS до 100 мкг/мл.
    1. Добавьте 15-20 мкл к каждой скважине (в зависимости от уровня комфорта пипетки), образуя каплю в центре скважины, покрывающую площадь электродов и прилегающую область, но не всю скважину.
    2. Следите за тем, чтобы не повредить электроды наконечником пипетки. Быть в соответствии с объемом от скважины до скважины, чтобы обеспечить покрытие одной и той же площади поверхности в каждой скважине.
    3. Инкубировать PLO при 37 °C в течение как минимум 1 ч (предпочтительно 2 ч).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие объемы будут высыхать, если в пластинах не будет достаточной влажности. Добавляйте воду в отсеки, окружающие колодцы, чтобы обеспечить достаточную влажность на протяжении всего процесса нанесения покрытия и регистрации.
  4. Аспирируйте как можно больше PLO, используя пластиковый наконечник микропипетки. Следите за тем, чтобы не прикасаться к электродам. Трижды промыть 250 мкл воды. Если вы используете вакуумный аспиратор для стирки, не допускайте наконечника рядом с электродной решеткой. После третьей стирки удалите как можно больше воды, используя наконечник пипетки по мере необходимости. Дайте поверхности высохнуть под вытяжкой культуры клеток со снятой крышкой.
  5. Как только поверхности пластин высохнут, добавьте ламинин, разбавленный до 10 мкг/мл в PBS. Используйте 15-20 мкл для покрытия каждого электродного массива. Добавьте воду в отсеки влажности, замените крышку и верните пластину к инкубации при температуре 37 °C в течение как минимум 2 ч до ночи.
  6. В день нанесения покрытия промыть культуры MN и астроцитов один раз PBS и добавить трипсин 0,05% при 37 °C для подъема клеток (5 мин). Соберите в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую ингибитор трипсина, и промойте пластины со средой или основанием, чтобы убедиться, что все клетки собраны. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин и повторное суспендирование пипеткой 1000 мкл для получения 1 мл одноклеточной суспензии. При повторной суспендации МН и астроцитов переходят на кокультурную среду (табл. 1), с добавлением 20 мкМ ROCK-I.
  7. Подсчитывайте МН и астроциты параллельно с помощью гемоцитометра. Во время подсчета и расчетов закройте суспензии ячейки и поместите их в стойку из пенополистирола при температуре 4 °C.
  8. Рассчитайте объем, необходимый для повторного суспендирования культур до концентрации 5 х 104 клеток на 5 мкл для двигательных нейронов и 2,5 х 104 клеток на 5 мкл для астроцитов. Центрифугируют 1 мл клеточных суспензий по 300 х г в течение 5 мин и повторно суспендируют в расчетном объеме.
  9. Рассчитайте количество желаемых скважин для посева и умножьте его на 5 мкл каждой клеточной суспензии. Объедините необходимый объем суспензий нейронов и астроцитов в соотношении 1:1 и перемешайте путем пипетирования до полного объединения (обычно дважды), но избегайте слишком агрессивности.
  10. Извлеките ламинин из каждого колодца пластины MEA с помощью наконечника пипетки. Перенесите 10 мкл конечной комбинированной клеточной суспензии в каждую лунку, образуя небольшую каплю, покрывающую электродный массив, чтобы обеспечить плотность клеток 5 х 104 МН и 2,5 х 104 астроцитов на лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая плотность клеток в комбинированной суспензии требует частого повторного суспендирования между скважинами на этапе посева для обеспечения точного и последовательного подсчета клеток.
  11. Верните тарелки в инкубатор на 20-30 мин. Позаботьтесь о том, чтобы не потревожить клеточную каплю и позволить клеткам образовывать первоначальные прикрепления на пластинах.
  12. Через 20-30 мин добавьте теплые кокультурные среды + ROCK-I в каждую скважину, пипетируя 250 мкл вниз на стенке каждой скважины, а затем еще 250 мкл вниз по стенке той же скважины на противоположной стороне. Верните тарелку в инкубатор.
  13. Осмотрите тарелки на следующий день после посева (Кокультура День 1). При наличии значительного количества клеточного мусора или мертвых клеток замените среду свежей кокультурной средой, содержащей ROCK-I. В противном случае измените среду на второй день после посева (День кокультуры 2) на среду совместной культуры без ROCK-I. Выполняйте полусредний обмен (аспират 50% и добавление 60% от конечного объема для учета испарения) два раза в неделю.
  14. При использовании МЭА-систем с однотонными стеклянными пластинами 30 мм (Таблица материалов) подготовка плиты может занять 2 и более дней. Для этого выполните следующие действия.
  15. Поднимите клетки и клеточный мусор из предыдущих культур MEA с 0,05% трипсина в течение 5-15 мин.
  16. Аспират трипсина и трижды промыть водой.
  17. Стерилизуют, добавляя 70% этанола и инкубируют в вытяжке в течение 10 мин. Аспирировать этанол, а затем трижды промыть водой.
  18. Наносите 1% анионное моющее средство с ферментом протеазой в воде. Накройте пластины крышкой и оберните термопластичной пленкой и алюминиевой фольгой, а затем оставьте их на коромысле при комнатной температуре на ночь.
  19. Аспирировать моющее средство, а затем трижды смыть водой.
  20. Если планируется хранение тарелок, добавьте достаточный объем воды. Накройте пластины крышкой и оберните их термопластичной пленкой и алюминиевой фольгой, а затем оставьте в холодильнике до следующего использования.
  21. Если планируется покрыть, дайте поверхности высохнуть под вытяжкой клеточной культуры.
  22. Если требуется дополнительная стерилизация (например, предыдущая инфекция или недавнее использование), только на этом этапе подвергайте пластины MEA ультрафиолетовому (УФ) свету под капотом в течение 30-60 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегание частого ультрафиолетового излучения предотвратит повреждение электродов. Использование ультрафиолетового света, когда пластины имеют сыворотку на них, приведет к нефункциональным электродам, поэтому его следует использовать только на очищенных пластинах.
  23. Когда пластины полностью высохнут, приступайте к плазменной очистке в течение 1 мин, чтобы зарядить стеклянную поверхность MEA-пластин и повысить эффективность покрытия. Плазменная очистка не реже одного раза в 4-5 циклов циклов очистки и покрытия пластин MEA.
    1. В качестве альтернативы, когда плазменная очистка невозможна или не оправдана, добавьте достаточный объем среды, содержащей FBS, чтобы покрыть поверхность пластин MEA и вернуть их в инкубатор на ночь.
  24. Используйте покрытие PLO/Laminin, как описано выше в разделе 6. Добавляют раствор PLO (100 мкг в PBS) сразу после плазменной очистки или аспирации и промывки FBS-содержащей среды.
  25. Обложите ячейки, как указано выше, в следующих плотностях: 1 x 105 hiPSC-A / пластина и 5 x 105 hiPSC-MN / пластина.

10. Запись многоэлектродной решетки

  1. Извлеките необработанные данные о напряжении с частотой дискретизации 12,5 кГц, используя фильтр Баттерворта с высокими частотами 200 Гц и фильтром нижних частот 3 кГц. Установите распознавание всплесков как мгновенные временные точки напряжений ≥6 стандартных отклонений от исходного уровня. Идентифицируйте всплески как активность с пиками >5 за 100 мс. Определите сетевую активность, когда более 35% от общего числа активных электродов срабатывают в течение 100 мс с минимум 50 всплесками на сетевой всплеск.
  2. Начните запись как можно скорее после Co-Culture (CC) Day 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Электрическая активность будет редко отмечаться до CC Day 3.
  3. Пластинчатые параллельные культуры с одинаковой плотностью и реплицируются в соответствующих культуральных пластинах или покровных листах для биохимических анализов, иммуноцитохимии (ICC) или qPCR.
  4. Выполняйте записи с температурой, установленной на уровне 37 °C и CO2 при 5%. Переложите пластины на машину и позвольте им уравновеситься в течение не менее 5 минут перед записью.
  5. Регистрируйте базовую активность либо через день, либо еженедельно, в течение 1-15 минут в зависимости от экспериментального проекта. Не записывайте в течение как минимум 1 ч после среднего обмена, а в идеале ждите 24 ч после каждого медиаобмена.
  6. Чтобы предотвратить загрязнение, измените среду (т.е. половинный обмен среды, как на этапе 9.14) после любой записи, при которой крышка стерильной пластины должна быть открыта за пределами стерильной вытяжки (т.е. применение лекарственных соединений). Выполняйте полные средние обмены и промывки, чтобы вымыть лекарства, если пластины будут продолжать использоваться после медикаментозного лечения.
  7. Для целей анализа используйте не менее трех технических и биологических реплик для каждого состояния. Экспресс-электрофизиологические данные как средство n ≥ 3 реплик.

11. Фармакологические анализы на многоэлектродной матрице

  1. Используют различную комбинацию кокультур в зависимости от экспериментального вопроса: нейроны БАС с контрольными астроцитами, контрольные нейроны с астроцитами БАС, нейроны БАС и астроциты, контрольные нейроны и астроциты.
  2. При исследовании переходных электрофизиологических эффектов соединений, нацеленных на нейроны или астроциты, регистрируйте исходную активность в течение как минимум 1 мин со снятой крышкой пластины, но закрытой крышкой машины.
  3. Вручную открывают крышку машины без остановки электрофизиологической регистрации и обменивают 25 мкл среды с соответствующим лекарственным средством (обычно свежей средой) с помощью многоканальной пипетки при обработке нескольких скважин. Закройте крышку вручную.
  4. Запись в течение дополнительного 1 мина (или более, если есть значительные изменения, вызванные транспортным средством, от которых культура должна восстановиться).
  5. Вручную снова откройте крышку и замените 25 мкл среды с интересующим препаратом в том же транспортном средстве. Закройте крышку устройства и продолжите запись.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность регистрации и объем вводимого лекарственного средства/транспортного средства могут варьироваться или должны быть оптимизированы в зависимости от экспериментального вопроса.
  6. Для целей анализа убедитесь, что добавление транспортного средства не провоцирует существенных изменений электрофизиологических параметров. Рассчитайте процентные изменения активности после приема препарата по сравнению с добавлением в транспортное средство и сравните между условиями.
  7. Для исследования продольных электрофизиологических эффектов, таких как препараты-кандидаты, модифицирующие заболевание, запишите исходную активность, описанную на этапе 11.2. Для этого используйте либо среду для совместной культивирования, содержащую лекарственное средство(и), представляющее(ые) интересующее (представляющие) лекарственный препарат(ы), либо среду, содержащую только транспортное средство.
  8. Для целей анализа сравните записи временных точек от БАС или контрольных кокультур, продольно обработанных препаратами, друг с другом и контрольными состояниями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол формирования паттернов спинного мозга для генерации hiPSC-MN и hiPSC-A спинного мозга описан на рисунке 1. В этом протоколе hiPSCs поддерживаются и проходят как несмешивающиеся колонии (рисунок 2A). Нейрогенез инициируется (нейронная индукция) путем двойного ингибирования SMAD путем добавления ПУТЕй LDN193189 и SB431542, инактивируя костной морфогенетический белок (BMP) и трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β) пути соответственно. Для этой стадии ис...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На сегодняшний день методы электрофизиологических записей кокультур астроцитарных нейронов на основе hiPSC и MEA нашли ограниченное применение в области ALS6 и до сих пор не полностью человеческие платформы, в отличие от их более широкого использования для моделирования эпилепсии in vitro 9. Эта платформа, однако, имеет потенциал для решения патофизиологически значимых вопросов в исследованиях БАС, таких как механизмы гипервозбудимости нейронов, вклад астроцитов в ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта рукопись была поддержана следующим: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Премия за развитие карьеры клинического ученого Благотворительного фонда Дорис Дьюк (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Мы благодарим д-ра Раху Дастгейба и д-ра Нормана Хоги за предоставление платформы MEA и программного обеспечения для анализа данных, которое мы использовали для проверки описанной электрофизиологической платформы. Мы хотели бы поблагодарить Халила Руста за помощь в демонстрации протокола и съемках.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10 см стерильные культуральные планшетыFalcon353003
25 см<суп>2 стерильные колбы для культурFalcon353136
2-меркаптоэтанол (β-ME)Thermofisher21985023рабочая концентрация 110 &микро; М
500 мл 0,2 &; m CA Фильтрующая системаCorning430769
5 мл пипеткаFalcon357543
6 хорошо стерильных культуральных планшетовFalcon3046
Амфотерицин BGibco15290018Рабочая концентрация 2,0 г/мл
Анионное моющее средство с ферментом протеазой - Terg-A-ZymeSigma-AldrichZ273287Рабочая концентрация 1% м/в
Аскорбиновая кислота (ASAC)SigmaA4403Растворите 100 мг в 250 мл dH2O, чтобы получить 0,4 мг/мл запаса. Стерильный фильтр через 0,22 & микро; m процедить, аликвотировать и заморозить при -80 °C. Разбавить до 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 0,4 & микро; г/мл).
Планшеты Axion CytoView MEA 24 (M384-tMEA-24W)AxionOPT-24
Axion Edge MEA платформаAxionMaestro Edge
Basement Membrane matrix - MatrigelCorning354277Подробности в протоколе
Настольный микроскоп (стерильный под колпаком для клеточных культур)Zeiss415510-1100-000Primo Vert
BicucullineSigma Aldrich14340Рабочая концентрация10 M
Цилиарный нейротрофический фактор (CNTF)Peprotech450-13Dissolve 100 &микро; г в 1 мл стерильного PBS, а затем добавить 9 мл стерильного 0,1% BSA-PBS к 10 & микро; г/мл. Аликвоту и заморозьте при -80 °C. Разведите при 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 10 нг/мл).
CO2 баки и регулятор для Axion EdgeAirGas/Harris9296NC
Compound EAbcamab142164Dissolve 250 µ g в 2,0387 мл ДМСО, чтобы получить 250 & микро; M stock. Аликвоту и заморозьте при -80 °C. Разбавьте 1:2000 для использования. (рабочая концентрация 125 нМ).
Цианкиксалин  (CNQX)Sigma AldrichC239Рабочая концентрация 50 μ M
Дигидрокаиновая кислота (DHK)Tocris111Рабочая концентрация 50 мкм; М и 300 μ M
DMEM/F12Thermofisher113300Рабочая концентрация 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 SupplementThermofisherA1517001Объедините 10 мл Essential 8 (10x)  добавка с 500 мл Essential 8 Growth Medium (1x)
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Thermofisher16140071Рабочая концентрация 1x
Нейротрофический глиальный клеточный (GDNF)Пепротех450-10Раствор 100 г в 1 мл PBS до 100 &; г/мл, а затем добавить 9 мл стерильного 0,1% BSA-PBS к 10 & микро; г/мл. Аликвоту и заморозьте при -80 °C. Разведите при 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 10 нг/мл).
ГемоцитометрИзбирательная микроскопия наук63510-20
ГепаринМиллипор-сигмаH3149-100KUРастворите 200 мг в 100 мл PBS для получения 2 мг/мл исходного раствора. Аликвотируйте заготовки в 15 мл и 500 & микро; L-образные трубки. Разбавьте 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 2 & микро; г/мл).
Инкубатор для клеточных культурThermoFisher370установлен на 37 градусов; C, 5 % CO2
Инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1)R& D системы291-G1-200Растворение 200 & микро; г в 2 мл PBS до 100 &; г/мл, затем добавьте 18 мл 0,1% БСА-PBS, чтобы получить 10 &микро; г/мл запастись и хранить при -80 ºC. Аликвоту и заморозить при -80 ºC. Разбавить 10 ºC. г/мл запаса в соотношении 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 10 нг/мл).
Каинковая кислотаAbcamab144490Рабочая концентрация 5 μ M
Knockout Serum Replacement (KSR)Thermofisher10828Рабочая концентрация 1x
LamininThermofisher23017-015Стоковый раствор 1 мг/мл, рабочая концентрация 10 &; г/мл (покрытие), 1 & микро; г/мл (клеточные среды)
LDN193189Stemgent04-0074Растворить 2 мг LDN в 500 микро; Л хлороформа, чтобы получить 10 мМ запаса. Приготовьте это и заморозьте при -80 ° ° C. Для использования сначала разведите исходное количество от 1 до 10 в ДМСО [до 1 мМ], затем разбавьте 1:5000 1 мМ в желаемой среде, чтобы получить 0,2 &. Рабочий раствор M
L-глутаминThermofisher25030Рабочая концентрация 100x
MEA стеклянные пластиныМногоканальные системы60MEA200/30iR-Ti-gr
Многоканальная пипетка P200GilsonPJ22224
NeurobasalThermofisher21103049Рабочая концентрация 1x
Заменимые аминокислоты (NEAA)Thermofisher11140050Рабочая концентрация 100x
Карандашлин/СтрептомицинThermofisher15140122Рабочая концентрация 100x
Полиорнитин (PLO)Sigma-AldrichP3655Растворите 100 мг в 1 мл ddW, чтобы получить 100 мг/мл исходного раствора. Квотируйте акции в 100 & микро; L-образные трубки. (рабочая концентрация 100 & микро; г/мл)
Хлорид калия (KCl)NA NAРабочая концентрация100 мМ
Пурморфамин (PMN)Millipore-Sigma540223Растворите 5 мг в 9,6 мл ДМСО, чтобы получить 1 мМ раствор. Аликвот и заморозьте при -80 °C. Разбавьте 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 1&микро; М).
Рекомбинантный нейротрофический фактор человеческого мозга (BDNF)Peprotech450-02незадолго до восстановления. Растворить 100 &микро; г в 1 мл PBS до 100 &; г/мл, а затем добавить 9 мл стерильного 0,1% BSA-PBS к 10 & микро; г/мл. Аликвоту и заморозьте при -80 °C. Разведите при 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 10 нг/мл).
Ретиноевая кислота (РА)SigmaR2625Растворите 100 мг в 3,3 мл ДМСО, чтобы получить 100 мл исходного раствора. Аликвот на сток 100 & микро; Л/тюбик и заморозить при -80 °С. Возьмем 200 & микро; L 100 mM stock и разбавьте в 10 раз (добавьте 1,8 мл DMSO), чтобы получить 10 mM stock. Аликвот 50 &микро; L/tube  и хранить при температуре -80 °C. Разбавьте до 1:10000 для использования. (рабочая концентрация 2 & микро; М).
Ингибитор ROCK-IPeprotech1293823растворить 5 мг в 1480 микро; L dH2O получить 10 мМ запаса, аликвоту и заморозить при -80 ºC. Разбавить на 1:500 для использования. (рабочая концентрация 20&м; М).
SB431542SigmaS4317Растворите 5 мг в 1,3 мл ДМСО, чтобы получить 10 мМ исходный раствор. Аликвоту и заморозьте при -80 °C. Разбавьте до 1:1000 для использования. (рабочий кон 10 и микро; M)
Стерильные колпаки для клеточных культурBaker CompanySG-600
Добавка B - B27 ДобавкаThermofisher21985023Рабочая концентрация 50x
Добавка N - N2 ДобавкаThermofisher17502048Рабочая концентрация 100x
Настольная центрифуга для клеточных культурThermoFisher75004261Sorvall Legend X1R
Термопласт  пленка - ПарапленкаPARAFILMP7793
Протеаза диссоциации тканей - DispaseStemCell Technologies7923Рабочая концентрация 1x
Ингибитор трипсинаSigmaT6522-1GРастворите 1 г в 100 мл ddH2O для получения запаса 10 мг/мл. Аликвоту и хранить при 4 °C. Разбавьте объем трипсина 1:10 для использования. (рабочая концентрация 1 мг/мл).
Трипсин-ЭДТА (0,05%)Термофишер2530054Рабочая концентрация 1x
Водяная баняThermoFisher2332Изотемп
с контролируемой влажностью Центрифуга

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911(2021).
  2. Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
  3. Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
  4. Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
  5. Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
  6. Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
  7. Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
  8. Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
  9. Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416(2018).
  10. Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
  11. Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
  12. Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79(2015).
  13. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
  14. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  15. Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
  16. Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
  17. Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
  18. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SMADJAK STAT

Похожие статьи