Описаны протоколы измерения рН, окислительных событий и переваривания белка в отдельных макропиносомах живых клеток. Акцент делается на двойной флуорофорной логометрической микроскопии и преимуществах, которые она предлагает по сравнению с популяционными методами.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение pH, окислительно-восстановительных химических веществ и деградативной способности макропиносом с помощью двухфлуорофорной ратиометрической микроскопии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В последние годы область макропиноцитоза стремительно росла. Макропиноцитоз возник как центральный механизм, с помощью которого врожденные иммунные клетки поддерживают гомеостаз организма и иммунитет. Одновременно и в отличие от своей гомеостатической роли, он также может управлять различными патологиями, включая рак и вирусные инфекции. В отличие от других способов эндоцитоза, средства, разработанные для изучения созревания макропиносом, остаются недостаточно развитыми. Здесь протокол описывает недавно разработанные инструменты для изучения окислительно-восстановительной среды в просвете ранних и созревающих макропиносом. Описаны методологии использования ратиометрической флуоресцентной микроскопии при оценке рН, производства активных форм кислорода и деградативной способности в просвете отдельных макропиносом живых клеток. Измерения одной органеллы дают преимущество выявления пространственно-временной гетерогенности, которая часто теряется при популяционных подходах. Акцент делается на основных принципах двойной флуорофорной ратиометрической микроскопии, включая выбор зонда, приборы, калибровку и одноклеточные и популяционные методы.
Введение
Макропиноцитоз относится к поглощению большого количества внеклеточной жидкости в мембранно-связанные цитоплазматические органеллы, называемые макропиносомами1,2. Это высоко консервативный процесс, выполняемый свободноживущие одноклеточными организмами, такими как амеба Dictyostelium spp. 3, а также антозоаны4 и метазоаны2. В большинстве клеток макропиноцитоз является индуцированным событием. Перевязка рецепторов клеточной поверхности индуцирует протрузию актин-управляемых расширений плазматической мембраны, называемых оборками. Ч....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка клеток
- Выращивайте raw264.7 клетки при 37 °C и 5% CO2 до 70% слияния в RPMI, дополненные 10% термоинфактивированной сывороткой.
- За сутки до анализа посеяли Raw264.7 клеток плотностью 5 х 104 клетки на скважину в 96-скважинную пластину. Убедитесь, что каждая скважина содержит 100 мкл питательной среды. Убедитесь, что пластина с 96 скважинами имеет черные стороны и стеклянное дно для визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для визуализации использовались пластины из 96 скважин. Пластины с 96 скважинами позволяют использовать меньшее количество клеток и реагентов по сравнению с более крупными камерами визуализации. Тем н....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
При измерении рН макропиносом существует период времени, за который нельзя измерить динамику подкисления. Этот период соответствует фазе загрузки декстрана (серый прямоугольный прямоугольный рисунок на рисунке 2C и рисунке 3C,D)и будет варьироваться в зависимости от типа используемой ячейки. Длина фазы нагрузки будет варьироваться в зависимости от (i) макропиноцитарной активности клеток и (ii) чувствительности используемого инструмента. Рекоменд.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хотя существует ряд протоколов как для низкопроизводительных, так и для высокопроизводительных измерений поглощения макропиноцитов в макрофагах, фибробластах и даже Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33,было предпринято очень мало попыток измерить люминальную биохимию этих динамических отсеков. Вероятно, это связано с нехваткой зондов, которые могут быть эф.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Благодарности
Мы благодарим Университет Калгари за его поддержку. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Робина Йейтса за доступ к реагентам, оборудованию и полезным дискуссиям.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Черностенный 96-луночный планшет | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS эфир | Cytiva | PA15401 | |
| декстран-амино 70 кДа | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-овальбумин | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-декстран 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Нигерицин | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 клетки | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI средний | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Конфокальный микроскоп | Leica | - | |
| TRITC-dextan 70 кДа | Invitrogen | D1819 | |
| u-Dish | ibidi | 81156 |
Ссылки
- Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766(2017).
- Williams....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
