Method Article

Микроэлектродная запись скорости срабатывания синоатриального узла для выявления внутренних дефектов кардиостимуляции у мышей

DOI:

10.3791/62735

⸱

July 5th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол направлен на описание новой методологии измерения внутренней скорости сердечного возбуждения с использованием микроэлектродной записи всей ткани синоатриального узла для выявления дефектов кардиостимуляции у мышей. Фармакологические агенты также могут быть введены в этот метод для изучения их влияния на внутреннее кардиостимуляторы.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синоатриальный узел (САН), расположенный в правом предсердии, содержит кардиостимуляторы клетки сердца, и дисфункция этой области может вызвать тахикардию или брадикардию. Надежная идентификация дефектов кардиостимуляжа требует измерения внутренней частоты сердечных сокращений, в значительной степени предотвращая влияние вегетативной нервной системы, которая может маскировать дефицит частоты. Традиционные методы анализа внутренней функции кардиостимулятора включают вегетативную блокаду, вызванную лекарственными средствами, для измерения частоты сердечных ритмов in vivo, изолированные записи сердца для измерения внутренней частоты сердечных ритмов и синоатриальную полосу или одноклеточные записи зажимов синоатриальных клеток кардиостимулятора для измерения скорости спонтанного действия потенциального возбуждения. Тем не менее, эти более традиционные методы могут быть технически сложными и трудными для выполнения. Здесь мы представляем новую методологию измерения внутренней частоты сердечных возбуждений путем выполнения записей микроэлектродной решетки (MEA) препаратов синоатриального узла с цельным креплением у мышей. MEA состоят из нескольких микроэлектродов, расположенных в виде сетки для регистрации потенциалов внеклеточного поля in vitro. Способ, описанный в настоящем описании, имеет комбинированное преимущество в том, что он относительно быстрее, проще и точнее, чем предыдущие подходы к регистрации внутренней частоты сердечных частот, а также позволяет легко проводить фармакологический опрос.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сердце является сложным органом, управляемым как сердечными, так и внешними влияниями, такими как те, которые происходят в мозге. Синоатриальный узел (SAN) представляет собой определенную область в сердце, в которой находятся клетки кардиостимулятора (также называемые синоатриальными клетками или клетками SA), ответственные за инициирование и увековечение сердцебиения млекопитающих1,2. Внутренняя частота сердечных сокращений - это частота, управляемая клетками кардиостимулятора без влияния других сердечных или нервно-гуморальных влияний, но традиционные показатели частоты сердечных сокращений у людей и живых животных, такие как электрокардиограммы, отражают как кардиостимулятор, так и нейронные влияния на сердце. Наиболее заметное нейронное влияние на клетки SA происходит от вегетативной нервной системы, которая постоянно модулирует паттерны возбуждения для удовлетворения физиологических потребностей организма3. Поддерживая эту идею, как симпатические, так и парасимпатические проекции можно найти рядом с SAN4. Внутренняя сердечная нервная система (ICNS) является еще одним важным нейронным воздействием, где ганглионированные плексии, особенно в правых предсердиях, иннервируют и регулируют активность SAN5,6.

Понимание дефицита кардиостимуляциона клинически важно, так как дисфункция может лежать в основе многих сердечных расстройств, а также способствовать риску других осложнений. Синдром больного синуса (ССС) – это категория заболеваний, характеризующаяся дисфункцией синоатриального узла, которая препятствует правильному кардиостимуляции7,8. ССС может присутствовать при синусовой брадикардии, синусовых паузах, синусовой остановке, синоатриальном выходном блоке и чередующихся брадиаритмиях и тахиаритмиях9 и может привести к осложнениям, включая повышенный риск эмболического инсульта и внезапной смерти8,10. Люди с синдромом Бругада, сердечным расстройством, отмеченным фибрилляцией желудочков с повышенным риском внезапной сердечной смерти, подвергаются большему риску аритмогенных событий, если у них также есть коморбидная дисфункция SAN11,12. Синоатриальная дисфункция также может иметь физиологические последствия за пределами сердца. Например, было замечено, что SSS вызывает судороги у пациента из-за гипоперфузии головного мозга13.

Чтобы выявить синоатриальный дефицит кардиостимуляции, внутреннюю частоту сердечных сокращений необходимо определить путем измерения активности SAN без влияния вегетативной нервной системы или гуморальных факторов. Клинически это может быть аппроксимировано фармакологической вегетативной блокадой14,но этот же метод также может быть применен в моделях млекопитающих для изучения внутренней сердечной функции15,16. Хотя этот подход блокирует большую часть вносящих вклад нейронных влияний и позволяет проводить исследование сердца in vivo, он не полностью устраняет все внешние воздействия на сердце. Другим методом исследования, используемым для изучения внутренней сердечной функции на животных моделях, являются изолированные записи сердца с использованием перфузированных Лангендорфом сердец, которые обычно включают измерения с использованием электрограмм, кардиостимуляции или эпикардиальных многоэлектродных массивов17,18,19,20. Хотя этот метод более специфичн для сердечной функции, поскольку он включает в себя удаление сердца из организма, на измерения все еще могут влиять механоэлектрические механизмы авторегуляции, которые могут влиять на внутренние измерения частоты сердечных сокращений21. Изолированные записи сердца также могут по-прежнему подвергаться влиянию вегетативной регуляции через ICNS5,6,22,23. Кроме того, поддержание физиологически значимой температуры сердца, которая имеет решающее значение для измерения сердечной функции, может быть затруднено при изолированных сердечных приближенияхк 20. Более прямым методом изучения функции SAN является специальное выделение ткани SAN и измерение ее активности. Это может быть достигнуто с помощью полосок SAN (изолированная ткань SAN) или изолированных клеток кардиостимулятора SAN24,25. Оба требуют высокой степени технической подготовки, так как SAN является очень маленькой и четко определенной областью, и изоляция клеток представляет собой еще большую проблему, поскольку диссоциация может повредить общему здоровью клетки, если она не выполняется правильно. Кроме того, эти методы требуют экспертных электрофизиологических навыков для успешной записи из ткани или клеток с использованием отдельных регистрируя микроэлектроды.

В этом протоколе мы описываем метод записи SAN in vitro с использованием микроэлектродной матрицы (MEA) для получения внутренних измерений сердечного ритма. Преимущество этого подхода в том, что он делает высокоспецифичные электрофизиологические записи доступными для исследователей, не обладающих интенсивными электрофизиологическими навыками. MEAs ранее использовались для изучения функции кардиомиоцитов в первичных культурах кардиомиоцитов26,27,28,29,30,31,32,сердечных листах33,34,35,36,37,38,39и целых тканевых креплениях40, 41,42,43,44,45,46,47. Предыдущая работа также была выполнена для изучения полевых потенциалов в ткани SAN41,42. Здесь мы предоставляем методологию использования MEA для регистрации и анализа скорости стрельбы по SAN, присущей муринам. Мы также описываем, как этот метод может быть использован для проверки фармакологического воздействия лекарств на внутреннюю скорость срабатывания SAN, предоставив выборочный эксперимент, показывающий эффекты 4-аминопиридина (4-AP), блокатора каналов K+ с напряжением. Используя определенные анатомические ориентиры, мы можем точно записать SAN без необходимости выполнять обширные рассечения тканей или изоляцию клеток, необходимые в других методах. В то время как MEA может быть непомерно дорогим, записи обеспечивают очень специфические и надежные показатели кардиостимуляции, которые могут использоваться в широком спектре клинических и физиологических исследований.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры, описанные здесь, были проведены в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения (NIH), утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Южном методистском университете.

1. Покрытие многоэлектродной матрицы (MEA) для записи

  1. Сделайте 25 мМ боратного буфера.
    1. Растворить 0,953 г Na2B4O7·10 H2O в 80 мл дистиллированной воды.
    2. Отрегулируйте рН до 8,4 с HCl, а затем добавьте дистиллированную воду до конечного объема 100 мл.
  2. Сделайте 0,1% раствор полиэтиленимина (PEI).
    1. Добавьте 100 мкл 50% (мас./об.) PEI к 4,9 мл дистиллированной воды, чтобы получить 1% раствор PEI.
    2. Разбавляют 1% раствор PEI до 0,1% в боратном буфере, добавляя 1 мл 1% раствора PEI к 9 мл буфера бората 25 мМ.
  3. Пипетка ~1 мл 0,1% раствора PEI в тарелку микроэлектродного массива (MEA) таким образом, чтобы электроды были полностью покрыты(рисунок 1A и 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микроэлектроды МЭА обычно состоят из платиновой черной или углеродной нанотрубки и изолированы полиимидом (или акрилом); оба материала являются гидрофобными. Покрывая MEA катионным полимером, таким как PEI, гидрофобная поверхность MEA становится более гидрофильной, что позволяет образцам тканей лучше контактировать с поверхностью MEA(рисунок 1A1).
  4. Накройте посуду MEA термопластичной пленкой для уменьшения испарения и оставьте MEA на ночь при комнатной температуре(рисунок 1C).
  5. Аспирировать раствор PEI из чашки MEA с помощью пипетки, стараясь не коснуться электродной сетки, которая может повредить электроды, а затем промыть ≥4 раза дистиллированной водой(рисунок 1D).
  6. Храните MEA с покрытием PEI под 1-2 мл сверхчистой воды и запечатанным термопластичной пленкой при 4 °C до тех пор, пока это не понадобится. В качестве альтернативы можно хранить MEA с покрытием, погружая его в замок, наполненный сверхчистой водой(рисунок 1E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс нанесения покрытия PEI необходимо выполнять только один раз для MEA перед его первым использованием, и после каждого сеанса записи MEA следует хранить погруженным в сверхчистую воду.

2. Приготовление полного раствора Tyrode для рассечения тканей

  1. Сделайте 1 000 мл полного раствора Tyrode для рассечения; Сначала добавьте 8,1816 г NaCl к 800 мл сверхчистой воды.
  2. Добавьте в раствор следующее количество химических веществ: 0,4025 г KCl; 0,1633 г KH2PO4; 1,1915 г HEPES; 0,9999 г глюкозы; 0,0952 гMgCl2; 0,2646 г CaCl2·2H2O.
  3. Отрегулируйте pH до 7,4 с NaOH, а затем добавьте сверхчистую воду, пока общий объем не составит 1000 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный состав полного раствора тирода будет следующим (в мМ): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 KH2PO4,5 HEPES, 5,55 глюкозы, 1 MgCl2,1,8 CaCl2.

3. Подготовка насыщенного кислородом раствора Тирода для записи

  1. Сделать 500 мл раствора Тирода; добавьте 4,003 г NaCl к 400 мл сверхчистой воды.
  2. Добавьте в раствор следующие количества химических веществ: 0,651 г NaHCO3; 0,042 г2PO4; 0,132 г CaCl2·2H2O; 0,149 г KCl; 0,0476 гMgCl2; 0,999 г глюкозы.
  3. Отрегулируйте pH до 7,4 с HCl, а затем добавьте сверхчистую воду до тех пор, пока общий объем не составит 500 мл.
  4. Насытить раствор карбогеном кислородом не менее 30 мин при комнатной температуре перед началом записи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный состав раствора тирода будет следующим (в мМ): 137 NaCl, 15,5 NaHCO3,0,72PO4,1,8 CaCl2,4 KCl, 1 MgCl2,11,1 глюкозы. Этот раствор Тирода имеет немного отличный состав от раствора Полного Тирода, используемого для рассечения.

4. Приготовление раствора 4-аминопиридина (4-AP) для фармакологической модуляции

  1. Сделать 1 мМ рабочий раствор 4-AP; добавьте 18,82 мг 4-AP к 200 мл раствора Тирода с этапа 3.
  2. Насытить раствор 4-АП кислородом не менее чем за 30 мин до начала эксперимента.

5. Подготовка чашки Петри к рассечению

  1. Смешайте компоненты силиконового эластомера в соотношении 10:1 (по весу) основания к отверждателю.
  2. Налейте ~15 мл силиконовой эластомерной смеси в чашку Петри диаметром 60 мм.
  3. Дайте эластомеру отверждаться при комнатной температуре в течение 48 ч перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Силиконизированная чашка Петри может быть повторно удоблена для будущих вскрытий.

6. Рассечение синоатриального узла (SAN)

  1. Приготовьте гепаринизированный раствор Complete Tyrode для рассечения SAN.
    1. Добавьте 400 мкл гепарина (1000 USP/мл) к 40 мл раствора Complete Tyrode и нагрейте на водяной бане с 37 °C.
  2. Вводят мыше внутрибрюшинно 200-300 мкл гепарина (1000 USP/мл) и дайте животному посидеть в течение 10 минут.
  3. Усыпить гепаринизированную мышь при передозировке изофлурана.
    1. Поместите мышь в небольшую стеклянную камеру, которая содержит пары изофлунана, образующиеся при добавлении 200-300 мкл жидкого изофлурана в фильтровальную бумагу внутри перфорированной пластиковой трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку изофлуран может вызвать раздражение кожи, а также может всасываться через кожу, жидкость не должна напрямую контактировать с мышью. Поэтому пропитанную изофлураном салфетку помещают в перфорированную трубку для введения.
    2. Убедитесь в смерти прекращением движения и дыхательного усилия, а также отсутствием рефлекса защемления на носе. Смерть обычно занимает около 1-2 мин после помещения в камеру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смерть обычно сопровождается мочеиспусканием.
  4. Поместите мышь в лежачее положение на доске для рассечения с вытянутыми лапами и прикрепите лапы к доске с помощью игл для шприца длиной 1 дюйм 23-го калибра. Затем удалите мех в непосредственной близости от дна грудной клетки хирургическими ножницами и срезав мех у корней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для рассечения можно использовать крышки полистирольного охладителя.
  5. Удерживая кожу гемостатом, используйте хирургические ножницы, чтобы сделать поперечный разрез в коже прямо под нижней частью грудной клетки примерно от левой реберной дуги до правой реберной дуги(рисунок 3A).
  6. Разрезайте брюшину хирургическими ножницами и аккуратно отделите печень от диафрагмы, стараясь не проколоть печень, что вызовет чрезмерное кровотечение(рисунок 3B). Разрезайте диафрагму вдоль грудной клетки, чтобы обнажить грудную полость(рисунок 3C-D).
  7. Используя хирургические ножницы, отрежьте боковые стенки грудной клетки от краев реберных дуг до клавиц, чтобы обнажить сердце, стараясь избежать повреждения сердца(рисунок 3D). Затем используйте иглу шприца 23-го калибра, чтобы закрепить грудную клетку через плечо, удерживая ее на месте и вне пути хирургического поля.
  8. Используйте переносную пипетку, чтобы капать теплый (37 °C) гепаринизированный раствор Complete Tyrode на сердце, чтобы сохранить его влажным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте сердцу высохнуть.
  9. Удалите легкие, удерживая их с помощью дополнительных тонких щипцов Graefe и разрывая трахею хирургическими ножницами(рисунок 3E).
  10. Удерживайте верхушку сердца с помощью дополнительных тонких щипцов Graefe и удалите ее, разрезав аорту и вену с помощью хирургических ножниц. Переложите сердце в чашку Петри, содержащую отвержденный силиконовый эластомер(рисунок 4А)и используйте переносную пипетку для купания сердца 2-3 мл теплого (37 °C) гепаринизированного раствора Complete Tyrode.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить нежную заднюю стенку правого предсердия, которая содержит SAN, и соединенные правые предсердные вены. Купание сердца раствором Complete Tyrode удерживает сердце от высыхания, но не полностью погружает сердце в раствор, так как это ухудшит видимость во время рассечения.
  11. Ориентируйте сердце правым предсердием справа от экспериментатора и левым предсердием слева от экспериментатора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассечение ткани SAN должно быть сделано быстро, чтобы предотвратить травму, связанную с ишемией.
  12. Прикрепите верхушку сердца к блюду с помощью рассеченной булавки. Затем, удерживая нижнюю полую вену с помощью щипцов дюмона #2 ламинэктомии, вставьте иглу шприца 22 Г через нижнюю и верхнюю полую вену, чтобы найти их положение в правом предсердии, что также определяет приблизительное положение SAN (расположенное в пятне ткани между нижней и верхней полой веной(рисунок 4B).
  13. Используя небольшие рассеченные булавки, прикрепляйте к блюду левые и правые предсердные придатки.
    1. Удерживая левый предсердный придаток Дюмоном #2 щипцами для ламинэктомии, вставьте рассеченный штифт через придаток левого предсердия, чтобы удержать его на месте.
    2. Удерживая правый предсердный придаток Дюмоном #55 щипцах, проложите рассеченный штифт через правый предсердный придаток, чтобы удержать его на месте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При желании один и тот же тип щипцов можно использовать для удержания левых и правых предсердных придатков.
  14. Удалите шприцевую иглу, которая охватывает venae cavae.
  15. Чтобы освободить кровь из сердца, используйте ножницы Castroviejo для удаления верхушки сердца (то есть нижней половины), сделав поперечный разрез через желудочки(рисунок 4C). Затем промыть сердце, добавив теплый (37 °C) гепаринизированный раствор Complete Tyrode с передаточной пипеткой.
  16. Используйте ножницы Castroviejo, чтобы разрезать вдоль атриовентрикулярной перегородки, сохраняя разрез ближе к желудочку, чем к предсердиям. Продолжайте разрезать вдоль атриовентрикулярной перегородки до тех пор, пока предсердия не отделятся от желудочков.
  17. Разрезать вдоль межпредсердной перегородки, чтобы удалить левое предсердие.
  18. Поместите рассеченные штифты на периферии правого предсердия, чтобы он лежал плоским(рисунок 4D). Удалите оставшийся жир, сосуды или ткани из предсердия с помощью ножниц Castroviejo.
  19. Расположить SAN в правом предсердии, которое в этой ориентации приблизительно граничит с верхней полой веной (сверху), нижней полой веной (снизу) и cristae terminalis(слева) (рисунок 4D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Crista terminalis выглядит как темный мышечный гребень между правым предсердным придатком и SAN. Часто артерию SAN также можно увидеть пронизывающим через SAN(рисунок 4D).

7. Подготовка системы MEA к записи

  1. Добавьте раствор Тирода (из шага 3) во входной баллон с раствором(рисунок 5C)и насыплите его кислородом, включив поток карбогенного газа(рисунок 5A)в систему.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор Тирода, используемый для записи, немного отличается по составу от раствора Полного Тирода, используемого для вскрытия.
  2. Проверяют поток карбогена, наблюдая пузырьки в конической колбе, которая используется для увлажнения газа(рисунок 5В),и входном растворе баллона(рисунок 5С).
  3. Вставьте трубку притока перистальтического насоса(рисунок 5D)в регистрирующий раствор Tyrode(рисунок 5C). Затем вставьте трубку оттока перистальтического насоса в бутылку для сбора(рисунок 5I).
  4. Установите перистальтический насос на 25 об/мин, что дает скорость потока 2 мл/мин и запустите насос. Проверьте систему на наличие утечки или переполнения буфера.
  5. Установите регулятор температуры на 37 °C, физиологическую температуру мышей(рисунок 5E).

8. Размещение сердечной ткани на сетке MEA

  1. Перенесите рассеченную ткань SAN с помощью кисти(рисунок 6A)из рассекающей чашки Петри на сетку MEA(рисунок 1A1).
    1. Глядя под перевернутый микроскоп, аккуратно расположите ткань мягкой кистью так, чтобы область SAN накладывалась на электродную сетку.
    2. Перепозиционировать ткань по мере необходимости, чтобы убедиться, что она лежит ровно на электродной сетке, обеспечивая хороший контакт с электродами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкая кисть для перемещения ткани необходима, чтобы избежать повреждения электродной сетки.
  2. Как только ткань будет правильно позиционирована, используйте костные щипцы (или любые изогнутые щипцы), чтобы поместить сетку поверхткани (рисунок 6A). Затем используйте костные щипцы, чтобы поместить анкен дляарфы (рисунок 6A)на сетку, чтобы удерживать все на месте(рисунок 6B).
  3. Сделайте снимок позиционирования ткани на МЭА так, чтобы активность отдельных электродов могла быть коррелирована с их анатомическим расположением во время записи. Это можно сделать, поднеся смартфон к объективу перевернутого микроскопа или используя прикрепленную камеру микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ориентация MEA не изменяется после съемки, верхний левый электрод будет отображаться как первый канал (Ch1) во время записи.
  4. Поместите тарелку MEA на соединительную пластину(рис. 5F и 6C)и аккуратно поместите перфузионный колпачок(рисунок 6C)на тарелку MEA, не нарушая анкеля для ломтика арфы. Перфузионный колпачок может быть дополнительно закреплен с помощью куска лабораторнойленты (рисунок 6C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к регулируемым приточным и оттоковым трубам раствора, колпачок также имеет порт для подачи газа(рисунок 6C). Кроме того, кольцо опорного электрода проходит через колпачок(рисунок 6C).
  5. Дайте ткани восстановиться после обработки и акклиматизироваться в камере за 15-20 минут до записи.

9. Настройка протокола сбора данных для записи

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги описывают открытие программного протокола для спонтанной записи битов и определение условий записи. Специфика этих шагов может варьироваться в зависимости от конкретного используемого программного обеспечения, но общий план должен оставаться неизменным.

  1. Включите усилитель(рисунок 5G)и настройте рабочий процесс для записи в программном обеспечении на компьютере(рисунок 5H).
    1. Откройте программное обеспечение и нажмите на Рабочий процесс.
    2. Выберите Открыть новую папку.
    3. Откройте папку «Из шаблонов».
    4. Выберите 64MD1-1920X1080 (в зависимости от разрешения рабочего стола).
    5. Откройте папку QT.
    6. Откройте папку Спонтанной записи.
    7. Выберите шаблон Beat_recording.moflo и откройте его(рисунок 7A).
  2. Установите параметры записи, чтобы указать количество трассировок, длительность трассировки, интервал трассировки, входное напряжение, частоту дискретизации и т. Д., В соответствии с желаемыми условиями записи(рисунок 7B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения данных о частоте биения и межвыводящем ритме обычно используют входной диапазон напряжения 2,9 мВ, фильтр высоких частот 1 Гц, фильтр нижних частот 1000 Гц и частоту дискретизации 20 кГц.
  3. Чтобы отметить различные фазы или условия эксперимента, например, до и после введения препарата, нажмите на вкладку Аннотации, чтобы добавить желаемые обозначения(рисунок 7C).
  4. Чтобы указать назначение файла для собираемых данных, установите флажок Включить хранилище и введите требуемое имя файла в поле Модификатор имени файла.

10. Выполнение записи и сбор данных

  1. Нажмите кнопку «Запись и воспроизведение» в самой верхней строке меню программного обеспечения для сбора данных, чтобы начать запись. Получение данных по 10 следам длительностью 1 мин с интервалами 2 мин между следами.
  2. Из этих начальных следов убедитесь, что записанные формы сигналов согласуются со здоровой и высококачественной тканевой подготовкой, подтвердив, что большинство каналов записи демонстрируют амплитуды сигнала ≥ 0,5 мВ и идентичные межсковочные интервалы(рисунок 8).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальная оценка активности и формы сигналов отдельных микроэлектродов, соответствующих их анатомическим расположениям, может быть выполнена путем ссылки на картину, полученную после позиционирования ткани на МЭА.
  3. Чтобы измерить влияние лекарств на ткани, приостановите запись после получения исходных исходных данных, нажав кнопку паузы в самой верхней строке меню.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фазу лекарственного ответа эксперимента можно записать в записи, щелкнув вкладку Аннотации и добавив желаемую нотацию, как описано выше(рисунок 7C).
  4. Приостановите насос и переключите втулку насоса с обычного регистрируемого раствора на раствор Тирода, содержащий желаемый препарат по выбору.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В примере эксперимента раствор Тирода использовали с 1 мМ 4-аминопиридином (4-AP).
  5. Перезапустите насос и спустите паузу, чтобы снова начать сбор данных.
  6. После того, как раствор Тирода, наполненный лекарственным средством, достиг ткани, запишите 10 следов таким же образом, как это было сделано ранее для исходных записей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для стабилизации следов потребуется некоторое время, когда препарат вливается в камеру записи. Механизм действия препарата также может влиять на стабильность записи. Для препаратов, имеющих обратимые механизмы действия, также должен быть зафиксирован период вымывания для подтверждения восстановления активности до исходных уровней, что является показателем здоровой ткани.
  7. Нажмите кнопку Стоп, чтобы завершить запись.
  8. Сделайте окончательный снимок позиционирования ткани на MEA под микроскопом в случае, если ткань сместилась после первоначальной процедуры настройки записи.

11. Очистка настроек после записи

  1. Очистите MEA.
    1. После завершения записи аккуратно извлеките записывающий раствор из чашки MEA с помощью микропипетки 1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не контактировать с электродами MEA, которые могут повредить их.
    2. Снимите якорь сетки и арфы костными щипцами (или любыми изогнутыми щипцами). Затем используйте кисть для вытеснирования ткани с поверхности MEA, всегда стараясь не касаться отдельных микроэлектродов.
    3. Используя бутылку для мытья, осторожно промойте посуду MEA сверхчистой водой примерно 3-4 раза.
    4. Храните очищенный MEA, погруженный в сверхчистую воду при 4 °C.
  2. Промывайте системную трубку, пропуская через нее сверхчистую воду не менее 5 минут, используя настройку максимальной скорости на перистальтическом насосе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения грибкового роста не следует оставлять воду или буферный раствор внутри трубки после очистки.

12. Анализ записей MEA для измерения частоты ударов SAN

  1. Откройте сохраненный файл записанных данных в шаблоне "Beat_frequency_analysis" аналитического программного обеспечения(рисунок 9).
  2. Нажмите кнопку «Воспроизвести» и позвольте запустить всю запись, чтобы визуализировать набор данных и назначить соответствующие параметры анализа.
    1. Выберите окно биннинга для требуемого формата отображения данных, независимо от того, отображается ли оно как среднее значение за трассировку или среднее за время(рисунок 10A).
    2. Выберите каналы, которые будут включены в анализ, и установите требуемые максимальные значения амплитуды или пороговые значения амплитуды для автоматической идентификации пика формы сигнала(рисунок 10B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе для анализа может быть выбран отдельный канал, комбинация каналов или все 64 канала(рисунок 9). Если выбранные пороговые значения слишком близки к максимальным и минимальным значениям формы сигнала, некоторые пики формы сигнала могут быть не идентифицированы аналитическим программным обеспечением.
    3. Задайте количество времени до и после всплеска, которое будет включено в анализ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки 50 мс до всплеска и 100 мс после всплеска обычно работают хорошо(рисунок 10B).
  3. После установки условий анализа снова нажмите кнопку «Воспроизвести», чтобы повторно запустить набор данных и подтвердить, что параметры анализа подходят для извлечения шипов.
  4. Для анализа определите три наиболее стабильных последовательных следа, которые демонстрируют стабильную скорость биения для каждого следа по большинству каналов как в течение исходного периода эксперимента, так и еще трех последовательных стабильных следов в течение периода воздействия наркотиков(рисунок 10A).
  5. Укажите начальную и конечную трассировки для анализа и введите продолжительность каждой трассировки, которая будет анализироваться(рисунок 9).
  6. Перед началом анализа установите флажки включения для Интервал сохранения ритма в минуту и Интервал сохранения интервала между ударами (рисунок 10B).
  7. Введите желаемое имя файла в поле Модификатор File name (рисунок 10B). Проанализированные данные по частоте биения и интервалу интерспайка будут сохранены в виде ASCII (текстового) формата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа различных состояний (таких как исходный уровень и реакция на лекарства) анализ должен проводиться отдельно для каждого состояния.
  8. Нажмите кнопку Воспроизведение и запись на верхней панели вкладок, чтобы начать анализ.
  9. Чтобы экспортировать данные для других приложений, установите флажки Сохранить ритм в минуту и Сохранить интервал между ударами (рисунок 10B). Введите нужное имя файла в поле Модификатор File name (рисунок 10B)и нажмите кнопку Save, чтобы сохранить проанализированные данные в текстовом формате ASCII в выбранной папке.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После того, как ткань акклиматизируется в блюде в течение 15 мин, регистрируется 10 одномиминные следы. Наш текущий протокол регистрирует активность более часа, но мы зафиксировали стабильные паттерны стрельбы в течение ≥4 ч в неопубликованных данных, не показанных здесь. Если экспериментальная подготовка хороша для сбора данных, каждый канал записи должен демонстрировать последовательные и равномерно расположенные повторяющиеся формы сигналов (т.е. шипы) однородной формы для данного канала(рисунок 1...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Практика и освоение процесса рассечения SAN является обязательным, поскольку ткань хрупкая, а здоровая ткань необходима для успешной записи. Во время рассечения SAN правильная ориентация имеет важное значение для получения правильной области ткани. Однако первоначальная ориентация сердца может быть легко потеряна во время процесса рассечения, что усложняет это начинание. Поэтому, чтобы обеспечить правильную ориентацию влево-вправо, предсердия должны быть визуально осмотрено. Как правило, правое предсердие имеет тенденцию...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения, номера грантов R01NS100954 и R01NS099188.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-АминопиридинSigmaA78403-25G
игла для шприца 22 калибраFisher Scientific14-826-5AИспользуется для вскрытия
игла шприца 23 калибраFisher Scientific14-826-6CИспользуется для вскрытия
60 мм Чашки ПетриGenesee Scientific32-105G
500 мл Бутылка PyrexFisher Scientific06-414-1CИспользуется для хранения растворов
1000 мл Pyrex BottleFisher Scientific06-414-1DИспользуется для хранения
растворов Костные щипцыFine Science Tools16060-11
Дигидрат хлорида кальция (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC5080-500G
Carbogen (95% O2, 5% CO2)
Ножницы Castroviejo, 4"Fine Science Tools15024-10
D-(+)-глюкозаSigma-AldrichG7021-1KG
ПКдля сбора данныхПроцессор: Intel Xeon или Intel Core i7, Память: 8 ГБ, Жесткий диск: 1 ТБ, Видеокарта: NVIDIA или встроенная, Экран: 1920x1080
Диссекционный микроскопJenco
Препарирующие штифтыFine Science Tools26002-20
Dumont #2 Щипцы для ламинэктомииFine Science Tools11223-20
Dumont #55Щипцы Fine Science Tools11295-51
  Сверхтонкие щипцы GraefeFine Science Tools11152-10
Стеклянная камераGrainger49WF30Используется для эвтаназии мышей
Набор якорей для арфыWarner Instruments  SHD-22CL/15 WI 64-0247
HClFisher ChemicalsSA48-4Используется для балансировки pH
ГемостатFine Science Tools13013-14
ГепаринAurobindo Pharma Limited IDA, PashamylaramNDC 63739-953-25
HEPESSigma-AldrichH3375-250G
Инвертированный микроскопMoticAE2000
ИзофлуранПаттерсон ветеринарный07-893-1389
Лабораторная лентаFisher Scientific15-950
Свет для диссекционного микроскопа Долан-ДженнерMI150DG 660000391014
Магезия хлорид (MgCl<суб>2)Sigma-Aldrich208337-100G
MED64 Усилитель головкиMED64 MED-A64HE1S
MED64 Главный усилительMED64 MED-A64MD1A
MED64 Перфузионный колпачокMED64MED-KCAP01
MED64 Комплект держателей перфузионной трубкиMED64MED-KPK02
MED64 ТермоконнекторMED64MED-CP04
мешnbsp; Warner Instruments640246
Микроэлектродная матрица (MEA)Alpha Med ScientificMED-R515A
Mobius SoftwareWitWerx Inc.Специальное программное обеспечение для MED64
NaOHFisher ChemicalsS320-500Используется для балансировки pH
Нормальный физиологическийUltigieneNDC 50989-885-17
Кисть для рисованияFisher ScientificNC1751733
ПарапленкаGenesee ScientificPM-996
Перистальтический насосGilsonF155009
Трубка перистальтического насосаFisher Scientific14-171-2981/8'' Внутренний диаметр
полиэтилениминаSigmaP3143
Хлорид калия (KCl)Sigma-AldrichP9333-500G
Одноосновной фосфат калия (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655-500G
Sodium БикарбонатSigmaS6297
Хлорид натрия (NaCl)Fisher ScientificS671-3
Sylgruard Набор эластомеровDow Corning184 SIL ELAST KIT 0,5 кг
Одноосновной фосфат натрияSigmaS6566
Тетраборат натрияSigmaS9640
Хирургические ножницыFine Science Tools14074-09
Передаточные пипетки (3 мл градуированные)Samco Scientific225
& раствор

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
  2. Josea, A. D., Collison, D. The normal range and determinants of the intrinsic heart rate in man. Cardiovascular Research. (4), 160-167 (1970).
  3. Peters, C. H., Sharpe, E. J., Proenza, C. Annual Review of Physiology Cardiac Pacemaker Activity and Aging. Annual Review of Physiology. 82, 21-43 (2019).
  4. Keith, A., Flack, M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. Journal of Anatomy and Physiology. 41 (3), 172-189 (1907).
  5. Wake, E., Brack, K. Characterization of the intrinsic cardiac nervous system. Autonomic Neuroscience. 199, (2016).
  6. Fedele, L., Brand, T. The intrinsic cardiac nervous system and its role in cardiac pacemaking and conduction. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 7 (4), 1-33 (2020).
  7. Mangrum, J. M., DiMarco, J. P. The evaluation and management of bradycardia. New England Journal of Medicine. 342 (10), 703-709 (2000).
  8. Adan, V., Crown, L. A. Diagnosis and treatment of Sick Sinus Syndrome. American Family Physician. 67 (8), 1725-1732 (2003).
  9. Semelka, M., Gera, J., Usman, S. Sick Sinus Syndrome: A Review. American Family Physician. 87 (10), 691-696 (2013).
  10. Zaragoza, M. V., et al. Exome sequencing identifies a novel LMNA splice-site mutation and multigenic heterozygosity of potential modifiers in a family with Sick Sinus Syndrome, dilated cardiomyopathy, and sudden cardiac death. PLoS ONE. 11 (5), 0155421(2016).
  11. Brugada, J., Campuzano, O., Arbelo, E., Sarquella-Brugada, G., Brugada, R. Present status of Brugada Syndrome: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (9), 1046-1059 (2018).
  12. Rollin, A., et al. Prevalence, characteristics, and prognosis role of type 1 ST elevation in the peripheral ECG leads in patients with Brugada syndrome. Heart Rhythm. 10 (7), 1012-1018 (2013).
  13. Patel, N., Majeed, F., Sule, A. A. Seizure triggered by Sick Sinus Syndrome. BMJ case reports. 4, 2017222011(2017).
  14. Knecht, S., et al. Impact of pharmacological autonomic blockade on complex fractionated atrial electrograms. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (7), 766-772 (2010).
  15. Saba, S., London, B., Ganz, L. Autonomic blockade unmasks maturational differences in rate-dependent atrioventricular nodal conduction and facilitation in the mouse. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 14 (2), 191-195 (2003).
  16. Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 51-56 (2002).
  17. Tse, G., Tse, V., Yeo, J. M., Sun, B. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts. PLoS ONE. 11 (2), 0148858(2016).
  18. Tse, G., et al. Quantification of beat-to-beat variability of action potential durations in Langendorff-perfused mouse hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1578), 01578(2018).
  19. Avula, U. M. R., et al. Heterogeneity of the action potential duration is required for sustained atrial fibrillation. JCI Insight. 5 (11), 128765(2019).
  20. Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. (135), e57617(2018).
  21. Quinn, A. T., Kohl, P. Cardiac mechano-electric coupling: Acute effects of mechanical stimulation on heart rate and rhythm. Physiological Reviews. 101 (1), 37-92 (2021).
  22. Ripplinger, C. M., Noujaim, S. F., Linz, D. The nervous heart. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 199-209 (2016).
  23. Pauza, D. H., Pauziene, N., Pakeltyte, G., Stropus, R. Comparative quantitative study of the intrinsic cardiac ganglia and neurons in the rat, guinea pig, dog and human as revealed by histochemical staining for acetylcholinesterase. Annals of Anatomy. 184, 125-136 (2002).
  24. Golovko, V., Gonotkov, M., Lebedeva, E. Effects of 4-aminopyridine on action potentials generation in mouse sinoauricular node strips. Physiological Reports. 3 (7), 12447(2015).
  25. Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), e54555(2016).
  26. Doi, M., Ogawa, E., Arai, T. Effect of a photosensitization reaction performed during the first 3 min after exposure of rat myocardial cells to talaporfin sodium in vitro. Lasers in Medical Science. 32 (8), 1873-1878 (2017).
  27. Takanari, H., et al. A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology. Journal of Cellular Physiology. 231 (10), 2249-2256 (2016).
  28. Nakashima, T., et al. Rapid electrical stimulation causes alterations in cardiac intercellular junction proteins of cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1324-1333 (2014).
  29. Suzuki, S., et al. Effects of aldosterone on Cx43 gap junction expression in neonatal rat cultured cardiomyocytes. Circulation Journal. 73 (8), (2009).
  30. Horiba, M., et al. T-type Ca2+ channel blockers prevent cardiac cell hypertrophy through an inhibition of calcineurin-NFAT3 activation as well as L-type Ca2+ channel blockers. Life Sciences. 82 (11-12), 554-560 (2008).
  31. Inoue, N., et al. Rapid electrical stimulation of contraction modulates gap junction protein in neonatal rat cultured cardiomyocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases and effects of angiotensin II receptor agonist. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 914-922 (2004).
  32. Aalders, J., et al. Effects of fibrillin mutations on the behavior of heart muscle cells in Marfan syndrome. Scientific Reports. 10 (16756), (2020).
  33. Matsuura, K., et al. Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets. Biomaterials. 32 (30), 7355-7362 (2011).
  34. Fujita, H., Shimizu, K., Nagamori, E. Application of a cell sheet-polymer film complex with temperature sensitivity for increased mechanical strength and cell alignment capability. Biotechnology and Bioengineering. 103 (2), 370-377 (2009).
  35. Baba, S., et al. Generation of cardiac and endothelial cells from neonatal mouse testis-derived multipotent germline stem cells. Stem Cells. 25 (6), 1375-1383 (2007).
  36. Baba, S., et al. Flk1+ cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model. Cardiovascular Research. 76 (1), 119-131 (2007).
  37. Shimizu, K., et al. Construction of multi-layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 803-809 (2007).
  38. Haraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. Electrical coupling of cardiomyocyte sheets occurs rapidly via functional gap junction formation. Biomaterials. 27 (27), 4765-4774 (2006).
  39. Miyagawa, S., et al. Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: Their integration with recipient myocardium. Transplantation. 80 (11), 1586-1595 (2005).
  40. Watts, M., et al. Decreased bioavailability of hydrogen sulfide links vascular endothelium and atrial remodeling in atrial fibrillation. Redox Biology. 38, 101817(2021).
  41. Feng, Y., Cao, H., Zhang, Y. Prediction model of sinoatrial node field potential using high order partial least squares. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 1805-1811 (2015).
  42. Feng, Y., Cao, H., Wang, Y., Zhang, Y. Fuzzy linguistic prediction model for sinoatrial node field potential analysis in acute hyperglycemia environment. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, Suppl 1 881-887 (2015).
  43. Suzuki, K., Matsumoto, A., Nishida, H., Reien, Y., Maruyama, H., Nakaya, H. Termination of aconitine-induced atrial fibrillation by the KACh-channel blocker tertiapin: underlying electrophysiological mechanism. Journal of Pharmacological Sciences. 125 (4), 406-414 (2014).
  44. Chang, S. -L., et al. Heart failure enhances arrhythmogenesis in pulmonary veins. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 38 (10), 666-674 (2011).
  45. Wang, Y. -J., et al. Time-dependent block of ultrarapid-delayed rectifier K+ currents by aconitine, a potent cardiotoxin, in heart-derived H9c2 myoblasts and in neonatal rat ventricular myocytes. Toxicological Sciences. 106 (2), 454-463 (2008).
  46. Lai, Y. -J., Huang, E. Y. -K., Yeh, H. -I., Chen, Y. -L., Lin, J. J. -C., Lin, C. -I. On the mechanisms of arrhythmias in the myocardium of mXinα-deficient murine left atrial-pulmonary veins. Life Sciences. 83 (7-8), 272-283 (2008).
  47. Gustafson-Wagner, E. A., et al. Loss of mXinα, an intercalated disk protein, results in cardiac hypertrophy and cardiomyopathy with conduction defects. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (5), 2680-2692 (2007).
  48. Clark, R. B., et al. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, 1757-1766 (2004).
  49. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
  50. Nikmaram, M. R., et al. Characterization of the effects of Ryanodine, TTX, E-4031 and 4-AP on the sinoatrial and atrioventricular nodes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 96 (1-3), 452-464 (2008).
  51. Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
  52. Masé, M., Glass, L., Ravelli, F. A model for mechano-electrical feedback effects on atrial flutter interval variability. Bulletin of Mathematical Biology. 70 (5), 1326-1347 (2008).
  53. Franz, M. R., Bode, F. Mechano-electrical feedback underlying arrhythmias: The atrial fibrillation case. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 82 (1-3), 163-174 (2003).
  54. Bucchi, A., Tognati, A., Milanesi, R., Baruscotti, M., DiFrancesco, D. Properties of ivabradine-induced block of HCN1 and HCN4 pacemaker channels. Journal of Physiology. 572 (2), 335-346 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microelectrode Array RecordingSinoatrial NodeCardiac PacemakingIntrinsic Heart RateMouse Heart PreparationPacemaker CellsExtracellular Field PotentialsPharmacological InterrogationBeat Frequency AnalysisElectrophysiology Techniques

Related Articles