Извлечение кофактора _F420 для анализа длины хвоста полиглутамита из метаногенных чистых культур и образцов окружающей среды

_F420 является широко распространенным, но часто игнорируемым кофактором, который функционирует как облигатный двухэлектронный гидридный носитель в первичных и вторичных метаболических процессах как архей, так и бактерий1,2. _F420 представляет собой 5-деазафлавин и структурно похож на флавины, благодаря чему его химические и биологические свойства более сопоставимы с свойствами NAD⁺ или NADP⁺. Благодаря замещению азота углеродом в положении 5 изоаллоксазинового кольца, он является сильным восстановителем, проявляя при этом низкий стандартный окислительно-восстановительный потенциал -340 ^мВ1,3. _F420 содержит 5-деазафлавиновое кольцо и 2-фосфо-L-лактатный линкер (_F420-0). Хвост олигоглутамата, содержащий мономеры глутамата n+1, может быть присоединен к молекуле (_F420-n+1)⁴.

Долгое время кофактор _F420 был связан исключительно с археями и актинобактериями. Это в значительной степени было отменено. Недавние анализы показали, что _F420 распределен среди различных анаэробных и аэробных организмов типа Протеобактерий, Хлорофлекси и потенциально Фирмикутов, населяющих мириады мест обитания, таких как почвы, озера и кишечник ^{человека1,5}. В 2019 году Braga et ^al.6 показали, что протеобактерия Paraburkholderia rhizoxinica производит уникальное производное _F420, содержащее 3-фосфоглицерат вместо 2-фосфолактатного хвоста, который может быть широко распространен в различных местах обитания. В пределах домена Archaea, _F420 был обнаружен в нескольких линиях, включая метаногенный7, метанотрофический8,9 и сульфатредуцирующий ^{порядки10}, и предполагается, что он производится в Thaumarchaeota11. _F420 наиболее известен как незаменимый окислительно-восстановительный коэнзим в гидрогенотрофном и метилотрофном метаногенезе. Восстановленная форма _F420 (_F420H2) функционирует как донор электронов для восстановления метилентетрагидрометаноптерина (метилен-H4MPT, Mer) и метенил-H4MPT12,13. Он также может быть использован в качестве носителя электронов в _{H2-независимых} путях переноса электронов метаногенов, содержащих цитохромы12,14. Более того, окисленная форма _F420 обладает характерной сине-зеленой флуоресценцией при возбуждении при 420 нм, что облегчает обнаружение метаногенов микроскопически (рис. 1). Благодаря низкому окислительно-восстановительному потенциалу _F420 способствует (i) экзогенному восстановлению широкого спектра непокорных или токсичных органических соединений, (ii) синтезу тетрациклиновых и линкозамидных антибиотиков или фитотоксинов в стрептомицетах (тип актинобактерий) и (iii) устойчивости к окислительному или нитрозативному стрессу или другим неблагоприятным условиям у микобактерий (тип Актинобактерий)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Следовательно, _{F420-зависимые} оксидоредуктазы являются перспективными биокатализаторами для промышленных и фармацевтических целей, а также для биоремедиации загрязненных ^сред1,23. Несмотря на эти недавние результаты, точные роли кофактора _F420 все еще незначительно известны в актинобактериях или других бактериальных типах.

Существует, по крайней мере, три пути биосинтеза _F4202,6,24. Вначале путь биосинтеза расщепляется на 5-деазафлавиновый биосинтез и 2-фосфолактатную ветвь метаболизма. Реакционноспособную часть молекулы _F420 синтезируют через _{FO-синтазу} с использованием субстратов тирозина и 5-амино-6-рибитиламино-2,4(1H, 3H)-пиримидиндиона. Результатом является уровень рибофлавина хромофора _FO. В пределах принятой в настоящее время ветви метаболизма лактата L-лактат фосфорилируется до 2-фосфо-L-лактата L-лактат-киназой (CofB); 2-фосфо-L-лактат, в свою очередь, гуанилируется до L-лактил-2-дифосфо-5'-гуанозина 2-фосфо-L-лактат гуанилилтрансферазой (CofC). На следующем этапе L-лактил-2-дифосфо-5'-гуанозин связывается с _FO 2-фосфо-L-лактат-трансферазой (CofD) с образованием _F420-02. Наконец, фермент _F420-0:ɣ-глутамиллигаза (CofE) связывает мономеры глутамата до _F420-0, образуя конечный кофактор6 в различных ^{количествах23,25}. Различные организмы демонстрируют разные закономерности в количестве прикрепленных остатков глутамата, причем более короткие хвосты обнаруживаются для метаногенов, чем у микобактерий2,25,26. Как правило, метаногены показывают длину хвоста от двух до трех, с пятью в ацетокластическом метаногене, Methanosarcina sp., в то время как длина хвоста, обнаруженная в Mycobacterium sp., варьировалась от пяти до семи остатков глутамата2,25,26,27. Однако недавние результаты показали, что длинноцепочечный _F420 связывается с _{F420-зависимыми} оксидоредуктазами с более высоким сродством, чем короткоцепочечный _F420; кроме того, связанный длинноцепочечный _F420 увеличивает сродство субстрата, но уменьшает скорость оборота соответствующих ^{ферментов23}.

Обнаружение кофактора _F420 часто основывается на его флуоресценции. Таким образом, его производные олиго глутамата были разделены с использованием обратной фазы (RP)-^HPLC27,28. Недавно Ney et al. использовали гидроксид тетрабутиламмония в качестве реагента ионного спаривания для отрицательно заряженного хвоста глутамата для успешного улучшения разделения на RP-HLPC5. Здесь мы представляем способ подготовки образцов, последующего лизиса, экстракции, очистки, разделения и количественной оценки кофактора _F420 не только из чистых культур, но и из различных образцов окружающей среды (т.е. почв и осадка реактора).

ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция и анализ кофактора _F420 представляет собой трехэтапный процесс, включающий лизис образца, предварительную очистку кофактора с помощью твердофазной экстракции (SPE) и обнаружение кофакторов с помощью ионно-парного RP-ВЭЖХ (IP-RP-HPLC) с флуоресцентным обнаружением. Перед началом работы подготовьте материалы и реагенты, как указано в таблице 1.

1. Лизис образца

1. Добавьте до 5 г образца в соответствующие пробирки (например, конические пробирки по 50 мл).
2. Добавьте к образцам 5 мл лизисного буфера (2x запасной раствор, таблица 1).
3. Довести до конечного объема 10 мл с дистиллированной водой до достижения конечной концентрации 0,5 г·^мл-1.
4. Вихрь разбавленных образцов в течение 20 с.
5. Автоклав в течение 30 мин при 121 °C.
6. Для сухих образцов, таких как лесная почва, доведите до конечного объема 20 мл с дистиллированной водой после автоклавирования и вихрь разбавленного образца.
   ВНИМАНИЕ: Повышение температуры во время автоклавирования может привести к разрыву трубок.

2. Предварительная очистка кофактора F ₄₂₀ методом твердофазной экстракции (SPE)

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы SPE проводятся при комнатной температуре

1. Охладите образцы до комнатной температуры.
2. Центрифугировать автоклавные образцы в течение 5 мин при 11 000 х г.
3. Готовят 5 мл колонн SPE, заполненных 100 мг слабого анионного смешанного полимерного сорбента.
4. Кондиционируйте анионообменник 3 мл метанола (кондиционирующий раствор, табл. 1).
5. Уравновешивают анионообменник 3 мл дистиллированной воды (раствор равновесия, табл. 1).
6. Загрузите до 9,0 мл супернатанта из центрифугированного лизата на колонну SPE.
7. Смойте примеси 5 мл ацетата аммония 25 мМ (промывочный раствор SPE 1, таблица 1).
8. Смойте примеси 5 мл метанола (промывочный раствор SPE 2, таблица 1).
9. Элюируют кофактор _F420 в 1,0 мл буфера элюирования (табл. 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте свежий буфер элюирования. Из-за приложенного вакуума и высокого давления пара буфера элюирования объемы элюирования могут отличаться от образца к образцу. Чтобы обеспечить одинаковый конечный объем во всех образцах, рекомендуется взвесить сосуды для сбора до и после элюирования и рассчитать эффективный объем элюирования. Сбалансируйте различия путем добавления буфера элюирования.

3. Обнаружение кофактора _F420

1. Установите духовку на 40 °C и флуоресцентный детектор на 420 нм с длиной волны вымирания и длиной волны излучения 470 нм. Достижение разделения в режиме градиента с использованием подвижных фаз A и B (таблица 1): 0-3 мин: 26% B; 3-24 мин: 26%-50% B; 24-25 мин: 50% B; 25-27 мин: 50%-26% B; 27-35 мин: 26% В при расходе 0,75 мл·^мин-1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гарантировать уравновешивание условий колонны перед впрыском образцов путем промывки колонны по меньшей мере 3-х колонными объемами 74% подвижной фазы А и 26% подвижной фазы В (таблица 1).
   1. Фильтруйте элюированные образцы из SPE во флаконы ВЭЖХ с помощью фильтра из PTFE с размером пор 0,22 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать фильтры из PTFE с размером пор 0,22 мкм.
   2. Вводят 50 мкл элюированного образца в систему ВЭЖХ для анализа состава и концентрации кофактора _F420 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку в этом протоколе не используется количественный стандарт, образцы и варианты должны сравниваться по пиковой зоне.

Чистые культуры Methanosarcina thermophila и Methanoculleus thermophilus, оба термофильные метаногенные археи, выращивались в подходящей среде, как описано ранее29,30. Для Methanosarcina thermophila метанол использовался в качестве источника энергии, тогда как Methanoculleus thermophilus выращивался на H2 / CO2. Рост был проверен с помощью микроскопической оценки, в то время как активность была изучена путем измерения метана (CH4) с помощью газовой хроматографии, как описано ранее31. Чистые культуры использовали для извлечения кофактора F420 по представленному протоколу. Кроме того, осенью 2020 года для извлечения и анализа кофактора F420 были взяты пробы окружающей среды, включая образцы мезофильного биогазового реактора (станция очистки сточных вод, Цюрль, Австрия; для получения подробной информации о параметрах осадка см. 32), сельскохозяйственного луга (Инсбрук, Австрия) и лесного грунта (Ланс, Австрия).

Рост чистых культур был проверен с помощью микроскопии (рисунок 1), при этом полученный CH4 анализировался с помощью газовой хроматографии в течение 14 дней инкубации (данные не показаны). Эффективность экстракции кофактора F420 из чистых культур была проверена путем применения различных стратегий дезинтеграции: биение с использованием керамических ударов 0,5-1,0 мм, ультразвуковая обработка и распад давлением и температурой с использованием давления 121 ° C и давления 1,2 бар (автоклавирование). Максимальная эффективность экстракции стала очевидной при обработке давлением и температурой с применением буфера, как описано в разделе протокола, и, таким образом, была дополнительно применена для всех последующих экспериментов (рисунок 2). Испытания эффективности экстракции проводились путем стандартного добавления различных объемов хорошо растущей культуры Methanoculleus thermophilus . Кроме того, сравнение различных образцов и вариантов основывалось на пиковой площади из хроматограмм.

Впоследствии клеточные экстракты подвергали процедуре твердофазной экстракции (SPE). Для этого были испытаны различные ионообменники. Оказалось, что слабый анионный смешанный полимерный сорбент дал наибольшее количество кофактора F420 после элюирования. Кроме того, были протестированы различные элюционные буферы и промывочные растворы, которые показали наилучшие результаты для 25 мМ ацетата аммония в качестве промывочного буфера и смеси NH3 в метаноле в качестве буфера элюирования. Метанол со стадии элюирования может быть заменен после элюирования водой с помощью вакуумно-температурной обработки.

ВЭЖХ-анализ кофактора F420 был протестирован с различными колонками C18 с наилучшими результатами для конфигурации системы, достигнутыми в ходе представленного исследования с колонкой NX C18. Стандарт, содержащий известное распределение производных F420 с различной длиной хвоста глутамата, использовался для справочных целей. Этот стандарт был любезно предоставлен профессором Колином Джексоном из Австралийского национального университета. Анализ длины хвоста глутамата выявил различия в общей концентрации кофактора F420 и распределении хвоста F420 по длине метаногенных чистых культур и образцов окружающей среды (рисунок 3).

Таблица 1: Буферный и подвижный фазовый состав для твердофазного экстракции (SPE) и анализа ВЭЖХ. 

Рисунок 1: Флуоресцентная метаногенная чистая культура. Визуализация methanosarcina thermophila с помощью (A) фазово-контрастной микроскопии и с помощью (B) флуоресцентной микроскопии при возбуждении кофактора F420 ультрафиолетовым светом (возбуждение при 395-440 нм и излучение при 475-495 нм). Шкала: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Стандартное дополнение. Пиковая площадь восстановленного кофактора F420 после SPE из 1,0 г матрицы с различными объемами культур M. thermophilus . Матрица была дополнена 0 мкл, 250 мкл, 500 мкл, 750 мкл и 1000 мкл культуры и подвергнута различным стратегиям распада: биение, ультразвуковая обработка и распад давления и температуры (автоклавирование). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Распределение длины хвоста глутамата. Cofactor F420 распределение длин хвоста чистых культур и образцов окружающей среды. Сверху донизу: сельскохозяйственный луг (почва), лес (почва), мезофильный биогазовый реактор, чистая культура M. thermophilus и чистая культура M. thermophila. Относительная абсорбция была рассчитана путем нормализации на самом высоком пике в пределах показанной хроматограммы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторам нечего раскрывать.