Методическая статья

Извлечение кофактора F420 для анализа длины хвоста полиглутамита из метаногенных чистых культур и образцов окружающей среды

DOI:

10.3791/62737

⸱

14 октября 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Universität Innsbruck, 2Department of Hygiene and Medical Microbiology, Medical University of Innsbruck

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод извлечения кофактора F420 из чистых культур оптимизирован для жидкостного хроматографического разделения и анализа длины хвоста F420 в чистых культурах и образцах окружающей среды.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кофактор F420 играет центральную роль в качестве гидридного носителя в первичном и вторичном метаболизме многих бактериальных и архейных таксонов. Кофактор наиболее известен своей ролью в метаногенезе, где он облегчает термодинамически сложные реакции. Поскольку хвост полиглутамата варьируется по длине между различными организмами, анализ профиля длины может быть мощным инструментом для различения и характеристики различных групп и путей в различных местах обитания. Здесь протокол описывает экстракцию и оптимизацию обнаружения кофактора F420 путем применения твердофазной экстракции в сочетании с высокоэффективным жидким хроматографическим анализом, независимым от культурных или молекулярно-биологических подходов. Метод применялся для получения дополнительной информации о экспрессии кофактора F420 из микробных сообществ в почвах, анаэробном осадке и чистых культурах и оценивался путем пиковых экспериментов. Таким образом, исследование преуспело в создании различных профилей длины хвоста F420 для гидрогенотрофных и ацетокластических метаногенов в контролируемых метаногенных чистых культурах, а также из образцов окружающей среды, таких как анаэробный осадок реактора и почвы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

F420 является широко распространенным, но часто игнорируемым кофактором, который функционирует как облигатный двухэлектронный гидридный носитель в первичных и вторичных метаболических процессах как архей, так и бактерий1,2. F420 представляет собой 5-деазафлавин и структурно похож на флавины, благодаря чему его химические и биологические свойства более сопоставимы с свойствами NAD+ или NADP+. Благодаря замещению азота углеродом в положении 5 изоаллоксазинового кольца, он является сильным восстановителем, проявляя при этом низкий стандартный окислител....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция и анализ кофактора F420 представляет собой трехэтапный процесс, включающий лизис образца, предварительную очистку кофактора с помощью твердофазной экстракции (SPE) и обнаружение кофакторов с помощью ионно-парного RP-ВЭЖХ (IP-RP-HPLC) с флуоресцентным обнаружением. Перед началом работы подготовьте материалы и реагенты, как указано в таблице 1.

1. Лизис образца

  1. Добавьте до 5 г образца в соответствующие пробирки (например, конические пробирки по 50 мл).
  2. Добавьте к образцам 5 мл лизисного буфера (2x запасной раствор, таблица 1).
  3. Довести до конечног....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чистые культуры Methanosarcina thermophila и Methanoculleus thermophilus, оба термофильные метаногенные археи, выращивались в подходящей среде, как описано ранее29,30. Для Methanosarcina thermophila метанол использовался в качестве источника энергии, тогда как Methanoculleus thermophilus выращивался на H2 / CO2. Рост был проверен с помощью микроскопической оценки, в то время как активность была из.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для оценки кофактора F420 из метаногенных чистых культур может быть выполнена микроскопическая оценка для визуализации роста и активности (флуоресцентная микроскопия) вовлеченных микроорганизмов (фиг.1). Для образцов, полученных из природной среды, использование микроскопии для обнаружения или количественной оценки F420 ограничено из-за помех другим флуоресцентным микроорганизмам, органическим и неорганическим частицам. В этом контексте извлечение F420 и посл.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы с благодарностью благодарим профессора Колина Джексона за поддержку очищенного кофактора F420. Это исследование было поддержано Тирольским научным фондом (TWF) и Университетом Инсбрука (Publikationsfonds). Мы высоко ценим поддержку GPS, HK, SB, GG и HB.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Автоклав
Биосовместимая система ВЭЖХ оснащена градиентным модулем, печью и флуоресцентным детекторомВЭЖХShimadzu
Центрифуга и ротор на 50 мл» Сокол» трубки (11.000 RCF) и соответствующие трубки
ВЭЖХ Колонка: Gemini NX C18, 5μ m, 150 x 3 ммPhenomenexHPLC колонна
фильтр из ПТФЭ (размер пор 0,22 &; m) для удаления твердых частиц перед анализом
Смола для SPE: Strata-X-AW 33 μ m как слабый анион смешанный модный полимерный сорбентPhenomenexслабый анион смешанный модный полимерный сорбент
Вакуумный коллектор для SPE и соответствующие сборные трубкиSPE оборудование
Вихревой смеситель
Система ВЭЖХ

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Greening, C., et al. Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).
  2. Bashiri, G., et al.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи