Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Извлечение кофактора F420 для анализа длины хвоста полиглутамита из метаногенных чистых культур и образцов окружающей среды

2.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62737

⸱

14 октября 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Universität Innsbruck, 2Department of Hygiene and Medical Microbiology, Medical University of Innsbruck

В этой статье

Краткое содержание

Метод извлечения кофактора F420 из чистых культур оптимизирован для жидкостного хроматографического разделения и анализа длины хвоста F420 в чистых культурах и образцах окружающей среды.

Аннотация

Кофактор F420 играет центральную роль в качестве гидридного носителя в первичном и вторичном метаболизме многих бактериальных и архейных таксонов. Кофактор наиболее известен своей ролью в метаногенезе, где он облегчает термодинамически сложные реакции. Поскольку хвост полиглутамата варьируется по длине между различными организмами, анализ профиля длины может быть мощным инструментом для различения и характеристики различных групп и путей в различных местах обитания. Здесь протокол описывает экстракцию и оптимизацию обнаружения кофактора F420 путем применения твердофазной экстракции в сочетании с высокоэффективным жидким хроматографическим анализом, независимым от культурных или молекулярно-биологических подходов. Метод применялся для получения дополнительной информации о экспрессии кофактора F420 из микробных сообществ в почвах, анаэробном осадке и чистых культурах и оценивался путем пиковых экспериментов. Таким образом, исследование преуспело в создании различных профилей длины хвоста F420 для гидрогенотрофных и ацетокластических метаногенов в контролируемых метаногенных чистых культурах, а также из образцов окружающей среды, таких как анаэробный осадок реактора и почвы.

Введение

F420 является широко распространенным, но часто игнорируемым кофактором, который функционирует как облигатный двухэлектронный гидридный носитель в первичных и вторичных метаболических процессах как архей, так и бактерий1,2. F420 представляет собой 5-деазафлавин и структурно похож на флавины, благодаря чему его химические и биологические свойства более сопоставимы с свойствами NAD+ или NADP+. Благодаря замещению азота углеродом в положении 5 изоаллоксазинового кольца, он является сильным восстановителем, проявляя при этом низкий стандартный окислительно-восстановительный потенциал -340 мВ1,3. F420 содержит 5-деазафлавиновое кольцо и 2-фосфо-L-лактатный линкер (F420-0). Хвост олигоглутамата, содержащий мономеры глутамата n+1, может быть присоединен к молекуле (F420-n+1)4.

Долгое время кофактор F420 был связан исключительно с археями и актинобактериями. Это в значительной степени было отменено. Недавние анализы показали, что F420 распределен среди различных анаэробных и аэробных организмов типа Протеобактерий, Хлорофлекси и потенциально Фирмикутов, населяющих мириады мест обитания, таких как почвы, озера и кишечник человека1,5. В 2019 году Braga et al.6 показали, что протеобактерия Paraburkholderia rhizoxinica производит уникальное производное F420, содержащее 3-фосфоглицерат вместо 2-фосфолактатного хвоста, который может быть широко распространен в различных местах обитания. В пределах домена Archaea, F420 был обнаружен в нескольких линиях, включая метаногенный7, метанотрофический8,9 и сульфатредуцирующий порядки10, и предполагается, что он производится в Thaumarchaeota11. F420 наиболее известен как незаменимый окислительно-восстановительный коэнзим в гидрогенотрофном и метилотрофном метаногенезе. Восстановленная форма F420 (F420H2) функционирует как донор электронов для восстановления метилентетрагидрометаноптерина (метилен-H4MPT, Mer) и метенил-H4MPT12,13. Он также может быть использован в качестве носителя электронов в H2-независимых путях переноса электронов метаногенов, содержащих цитохромы12,14. Более того, окисленная форма F420 обладает характерной сине-зеленой флуоресценцией при возбуждении при 420 нм, что облегчает обнаружение метаногенов микроскопически (рис. 1). Благодаря низкому окислительно-восстановительному потенциалу F420 способствует (i) экзогенному восстановлению широкого спектра непокорных или токсичных органических соединений, (ii) синтезу тетрациклиновых и линкозамидных антибиотиков или фитотоксинов в стрептомицетах (тип актинобактерий) и (iii) устойчивости к окислительному или нитрозативному стрессу или другим неблагоприятным условиям у микобактерий (тип Актинобактерий)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Следовательно, F420-зависимые оксидоредуктазы являются перспективными биокатализаторами для промышленных и фармацевтических целей, а также для биоремедиации загрязненных сред1,23. Несмотря на эти недавние результаты, точные роли кофактора F420 все еще незначительно известны в актинобактериях или других бактериальных типах.

Существует, по крайней мере, три пути биосинтеза F4202,6,24. Вначале путь биосинтеза расщепляется на 5-деазафлавиновый биосинтез и 2-фосфолактатную ветвь метаболизма. Реакционноспособную часть молекулы F420 синтезируют через FO-синтазу с использованием субстратов тирозина и 5-амино-6-рибитиламино-2,4(1H, 3H)-пиримидиндиона. Результатом является уровень рибофлавина хромофора FO. В пределах принятой в настоящее время ветви метаболизма лактата L-лактат фосфорилируется до 2-фосфо-L-лактата L-лактат-киназой (CofB); 2-фосфо-L-лактат, в свою очередь, гуанилируется до L-лактил-2-дифосфо-5'-гуанозина 2-фосфо-L-лактат гуанилилтрансферазой (CofC). На следующем этапе L-лактил-2-дифосфо-5'-гуанозин связывается с FO 2-фосфо-L-лактат-трансферазой (CofD) с образованием F420-02. Наконец, фермент F420-0:ɣ-глутамиллигаза (CofE) связывает мономеры глутамата до F420-0, образуя конечный кофактор6 в различных количествах23,25. Различные организмы демонстрируют разные закономерности в количестве прикрепленных остатков глутамата, причем более короткие хвосты обнаруживаются для метаногенов, чем у микобактерий2,25,26. Как правило, метаногены показывают длину хвоста от двух до трех, с пятью в ацетокластическом метаногене, Methanosarcina sp., в то время как длина хвоста, обнаруженная в Mycobacterium sp., варьировалась от пяти до семи остатков глутамата2,25,26,27. Однако недавние результаты показали, что длинноцепочечный F420 связывается с F420-зависимыми оксидоредуктазами с более высоким сродством, чем короткоцепочечный F420; кроме того, связанный длинноцепочечный F420 увеличивает сродство субстрата, но уменьшает скорость оборота соответствующих ферментов23.

Обнаружение кофактора F420 часто основывается на его флуоресценции. Таким образом, его производные олиго глутамата были разделены с использованием обратной фазы (RP)-HPLC27,28. Недавно Ney et al. использовали гидроксид тетрабутиламмония в качестве реагента ионного спаривания для отрицательно заряженного хвоста глутамата для успешного улучшения разделения на RP-HLPC5. Здесь мы представляем способ подготовки образцов, последующего лизиса, экстракции, очистки, разделения и количественной оценки кофактора F420 не только из чистых культур, но и из различных образцов окружающей среды (т.е. почв и осадка реактора).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция и анализ кофактора F420 представляет собой трехэтапный процесс, включающий лизис образца, предварительную очистку кофактора с помощью твердофазной экстракции (SPE) и обнаружение кофакторов с помощью ионно-парного RP-ВЭЖХ (IP-RP-HPLC) с флуоресцентным обнаружением. Перед началом работы подготовьте материалы и реагенты, как указано в таблице 1.

1. Лизис образца

  1. Добавьте до 5 г образца в соответствующие пробирки (например, конические пробирки по 50 мл).
  2. Добавьте к образцам 5 мл лизисного буфера (2x запасной раствор, таблица 1).
  3. Довести до конечного объема 10 мл с дистиллированной водой до достижения конечной концентрации 0,5 г·мл-1.
  4. Вихрь разбавленных образцов в течение 20 с.
  5. Автоклав в течение 30 мин при 121 °C.
  6. Для сухих образцов, таких как лесная почва, доведите до конечного объема 20 мл с дистиллированной водой после автоклавирования и вихрь разбавленного образца.
    ВНИМАНИЕ: Повышение температуры во время автоклавирования может привести к разрыву трубок.

2. Предварительная очистка кофактора F 420 методом твердофазной экстракции (SPE)

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы SPE проводятся при комнатной температуре

  1. Охладите образцы до комнатной температуры.
  2. Центрифугировать автоклавные образцы в течение 5 мин при 11 000 х г.
  3. Готовят 5 мл колонн SPE, заполненных 100 мг слабого анионного смешанного полимерного сорбента.
  4. Кондиционируйте анионообменник 3 мл метанола (кондиционирующий раствор, табл. 1).
  5. Уравновешивают анионообменник 3 мл дистиллированной воды (раствор равновесия, табл. 1).
  6. Загрузите до 9,0 мл супернатанта из центрифугированного лизата на колонну SPE.
  7. Смойте примеси 5 мл ацетата аммония 25 мМ (промывочный раствор SPE 1, таблица 1).
  8. Смойте примеси 5 мл метанола (промывочный раствор SPE 2, таблица 1).
  9. Элюируют кофактор F420 в 1,0 мл буфера элюирования (табл. 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте свежий буфер элюирования. Из-за приложенного вакуума и высокого давления пара буфера элюирования объемы элюирования могут отличаться от образца к образцу. Чтобы обеспечить одинаковый конечный объем во всех образцах, рекомендуется взвесить сосуды для сбора до и после элюирования и рассчитать эффективный объем элюирования. Сбалансируйте различия путем добавления буфера элюирования.

3. Обнаружение кофактора F420

  1. Установите духовку на 40 °C и флуоресцентный детектор на 420 нм с длиной волны вымирания и длиной волны излучения 470 нм. Достижение разделения в режиме градиента с использованием подвижных фаз A и B (таблица 1): 0-3 мин: 26% B; 3-24 мин: 26%-50% B; 24-25 мин: 50% B; 25-27 мин: 50%-26% B; 27-35 мин: 26% В при расходе 0,75 мл·мин-1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гарантировать уравновешивание условий колонны перед впрыском образцов путем промывки колонны по меньшей мере 3-х колонными объемами 74% подвижной фазы А и 26% подвижной фазы В (таблица 1).
    1. Фильтруйте элюированные образцы из SPE во флаконы ВЭЖХ с помощью фильтра из PTFE с размером пор 0,22 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать фильтры из PTFE с размером пор 0,22 мкм.
    2. Вводят 50 мкл элюированного образца в систему ВЭЖХ для анализа состава и концентрации кофактора F420 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку в этом протоколе не используется количественный стандарт, образцы и варианты должны сравниваться по пиковой зоне.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чистые культуры Methanosarcina thermophila и Methanoculleus thermophilus, оба термофильные метаногенные археи, выращивались в подходящей среде, как описано ранее29,30. Для Methanosarcina thermophila метанол использовался в качестве источника энергии, тогда как Methanoculleus thermophilus выращивался на H2 / CO2. Рост был проверен с помощью микроскопической оценки, в то время как активность была из...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для оценки кофактора F420 из метаногенных чистых культур может быть выполнена микроскопическая оценка для визуализации роста и активности (флуоресцентная микроскопия) вовлеченных микроорганизмов (фиг.1). Для образцов, полученных из природной среды, использование микроскопии для обнаружения или количественной оценки F420 ограничено из-за помех другим флуоресцентным микроорганизмам, органическим и неорганическим частицам. В этом контексте извлечение F420 и посл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы с благодарностью благодарим профессора Колина Джексона за поддержку очищенного кофактора F420. Это исследование было поддержано Тирольским научным фондом (TWF) и Университетом Инсбрука (Publikationsfonds). Мы высоко ценим поддержку GPS, HK, SB, GG и HB.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Автоклав
Биосовместимая система ВЭЖХ оснащена градиентным модулем, печью и флуоресцентным детекторомВЭЖХShimadzu
Центрифуга и ротор на 50 мл» Сокол» трубки (11.000 RCF) и соответствующие трубки
ВЭЖХ Колонка: Gemini NX C18, 5μ m, 150 x 3 ммPhenomenexHPLC колонна
фильтр из ПТФЭ (размер пор 0,22 &; m) для удаления твердых частиц перед анализом
Смола для SPE: Strata-X-AW 33 μ m как слабый анион смешанный модный полимерный сорбентPhenomenexслабый анион смешанный модный полимерный сорбент
Вакуумный коллектор для SPE и соответствующие сборные трубкиSPE оборудование
Вихревой смеситель
Система ВЭЖХ

Ссылки

  1. Greening, C., et al. Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).
  2. Bashiri, G., et al. A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes. Nature Communications. 10 (1), 451(2019).
  3. Grinter, R., Greening, C. Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea. FEMS Microbiology Reviews. , (2021).
  4. Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium. Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).
  5. Ney, B., et al. The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria. The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).
  6. Braga, D., et al. Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420. ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).
  7. Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments. Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).
  8. Michaelis, W., et al. Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane. Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).
  9. Knittel, K., Lösekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps. Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).
  10. Lin, X. -L., White, R. H. Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria. Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).
  11. Spang, A., et al. The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations. Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).
  12. Mand, T. D., Metcalf, W. W. Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).
  13. Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis. Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).
  14. Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri. mBio. 9 (4), (2018).
  15. Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea. FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).
  16. Purwantini, E., Daniels, L. Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).
  17. McCormick, J. R. D., Morton, G. O. Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species. Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).
  18. Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -S. T., Yurek, D. A. Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis. The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).
  19. Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase. Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).
  20. Gurumurthy, M., et al. A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents. Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).
  21. Greening, C., et al. Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism. Frontiers in Microbiology. 8, 1000(2017).
  22. Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -T., Fraaije, M. W. Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes. Chemical Communications. 54 (79), Cambridge, England. 11208-11211 (2018).
  23. Ney, B., et al. Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases. Frontiers in Microbiology. 8, 1902(2017).
  24. Grinter, R., et al. Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria. mSystems. 5 (3), (2020).
  25. Peck, M. W. Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei. Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).
  26. Gorris, L. G., vander Drift, C. Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed. BioFactors. 4 (3-4), Oxford, England. 139-145 (1994).
  27. Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species. Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).
  28. Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain). Microbial Ecology. 61, (2011).
  29. Wagner, A. O., et al. Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155(2019).
  30. Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila. Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).
  31. Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments. Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).
  32. Wagner, A. O., et al. Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants. Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).
  33. Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis. PloS one. 5 (12), 15803(2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Метаногенные культурытвердофазная экстракциявысокоэффективная жидкостная хроматографияанализ длины хвостаобнаружение метаногенованаэробный илпочвенные микробные сообщества
Извлечение кофактора F420 для анализа длины хвоста полиглутамита из метаногенных чистых культур и образцов окружающей среды
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.