Представлен протокол визуализации динамических микротрубочек in vivo с использованием флуоресцентно меченого конечного связывающего белка. Описаны методы маркировки, изображения и анализа динамических микротрубочек в заднем боковом микротрубочке (PLM) нейрона C. elegans.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
In vivo Оценка динамики и ориентации микротрубочек в нейронах Caenorhabditis elegans
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В нейронах ориентация микротрубочек была ключевым оценщиком для идентификации аксонов, которые имеют плюсовые микротрубочки и дендриты, которые обычно имеют смешанную ориентацию. Здесь описаны методы маркировки, изображения и анализа динамики и роста микротрубочек при развитии и регенерации сенсорных нейронов у C. elegans. Используя генетически закодированные флуоресцентные репортеры кончиков микротрубочек, мы визуалировали аксональные микротрубочки. Локальные изменения в поведении микротрубочек, которые инициируют регенерацию аксонов после аксотомии, могут быть количественно определены с помощью этого протокола. Этот анализ адаптируется к другим нейронам и генетическим фонам для исследования регуляции динамики микротрубочек в различных клеточных процессах.
Введение
Нейроны имеют сложную архитектуру со специализированными компартментами, такими как дендриты, клеточные тела, аксоны и синапсы. Нейрональный цитоскелет состоит из микротрубочек, микрофиламентов и нейрофиламентов, и их отчетливая организация поддерживает нейронные компартменты структурно и функционально1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . На протяжен....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Репортерное напряжение: культура и поддержание
ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения динамики микротрубочек и ориентации в нейронах PLM мы использовали штамм червя, экспрессирующий EBP-2::GFP под сенсорным нейроном специфическим промотором mec-4 (аллель juIs338) 18,25,26. Мы используем стандартные методы культивирования и поддержания червей для этого штамма27.
- Подготовьте питательную среду нематоды (3,0 г/л хлорида натрия, 2,5 г/л пептона, 20,0 г/л агара, 10 мг....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В качестве репрезентативного примера мы описали наблюдение in vivo комет EBP в стационарном состоянии и регенерирующими аксонами нейронов PLM. PLM-нейроны расположены в хвостовой области червя с длинным передним отроском, образующий синапс и короткий задний отроск. Нейроны PLM растут в передне-заднем направлении близко к эпидермису и отвечают за нежное ощущение прикосновения у червей. Благодаря их упрощенной структуре и поддающейся визуализации и микрохирургии, нейроны PLM были тщательно исследованы на наличие их микротр.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Понимание динамики микротрубочек было ключевым направлением в области исследований цитоскелетов на протяжении многих лет. Микротрубочки претерпевают зародышивание и катастрофу вместе с непрерывным процессом динамической нестабильности44, 45,46,47. Большая часть этой информации была получена с помощью анализов in vitro, таких как показания рассеяния света свободного .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Мы благодарим Иши Джина и Эндрю Чисхолма за первоначальную поддержку и штамм, использованный в исследовании. Бактериальный штамм OP50 был коммерчески использован Центром генетики Caenorhabditis (CGC), финансируемым Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Мы также благодарим Дхармендру Пури за стандартизацию экспериментальных процедур. Исследование финансируется за счет основного гранта Национального центра исследований мозга (при поддержке Департамента биотехнологии правительства Индии), гранта DBT/Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (грант No IA/E/18/1/504331) S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| CZ18975 штамм червя | Yishi Jin lab | CZ18975 | Создано Anindya Ghosh-Roy |
| Agarose | Sigma | A9539 | Монтажные черви |
| Coverslip (18 мм x 18 мм) | Zeiss | 474030-9010-000 | Монтажные черви |
| Сухая ванна с нагревательным блоком | Neolab | Монтажные черви | |
| Стеклянные слайды (35 мм x 25 мм) | Blue Star | Монтажные червячки | |
| Раствор полистирольных шариков (4,55 x 10^13 частиц/мл в водной среде с минимальным содержанием поверхностно-активного вещества) | Polysciences Inc. | 00876 | Монтажные черви |
| Пробирки | Монтажные черви | ||
| OP50 бактериальный штамм | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Червячные работы |
| 60 мм Пластины | Петри Praveen | Scientific 20440 | Червячки |
| Аспиратор/капиллярный | VWR | 53432-921 | Инкубатор для червей |
| Panasonic | MIR554E | Работа с червями | |
| Платиновая проволока | Работа с червями | ||
| Стереомикроскоп с флуоресцентной насадкой | Leica | M165FC | Работа с червями |
| 0,3% Хлорид натрия | Sigma | 71376 | Среда для роста нематод |
| 0,25% Пептон | T M Среда | 1506 | Среда для роста нематод |
| 10 мг/мл Холестерин | Sigma | C8667 | Среда для роста нематод |
| 1 мМ Дигидрат хлорида кальция | Сигма | 223506 | Среда для роста нематоды |
| 1 мМ Гептагидрат сульфата магния | Сигма | M2773 | Среда для роста нематоды |
| 2% Агар | Т М Среда | 1202 | Среда для роста нематоды |
| 25 мМ Одноосновная Дигидрофосфат калия | Сигма | P9791 | Среда для роста нематоды |
| 0,1М Одноосновной Дигидрофосфат калия | Sigma | P9791 | 1X M9 буфер |
| 0,04M Хлорид натрия | Sigma | 71376 | 1X M9 буфер |
| 0,1M Хлорид аммония | Fisher Scientific | 21405 | 1X M9 буфер |
| 0,2M Диосновной динатрия гидрофосфат гептагидрат | Sigma | S9390 | 1X M9 буфер |
| Стеклянные бутылки | Borosil | Буферное хранилище | |
| 488 нм лазер | Zeiss | Imaging | |
| 5X объектив | Zeiss | Imaging | |
| 63X объектив | Zeiss | ||
| Imaging | Фотометрия | Evolve 512 Delta | Imaging |
| Компьютерная система для вращающегося диска | HP | Intel ® Процессор Xeon E5-2623 3,00 ГГц | |
| Эпифлуоресцентный микроскоп | Zeiss | Observer.Z1 | Визуализация |
| Галогенная лампа | Zeiss | ||
| Imaging Ртутная дуговая лампа | Zeiss | Imaging | |
| Вращающийся дисковый блок | Yokogawa | CSU-X1 | Imaging |
| ZEN2 программное обеспечение | Zeiss | Imaging | |
| Image J (Фиджи Версия) | Анализ и обработка изображений | ||
| Adobe Creative Cloud | Анализ и обработка изображений | Adobe | |
| Компьютерная система для анализа изображений | Dell | Intel Ядро и торговля; Процессор i7-9700 3,00 ГГц | Обработка изображений/Представление |
Ссылки
- Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
- Tas, R. P., Kapitein, L. C.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
