Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

N-гликановое профилирование гликопротеинов методом гидрофильного взаимодействия жидкостной хроматографии с флуоресцентной и масс-спектрометрической детекцией

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62751

⸱

25 сентября 2021 г.

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Karabuk University, 2Department of Chemistry, Hacettepe University

В этой статье

Краткое содержание

N-гликановое профилирование гликопротеинов имеет важное значение для открытия новых биомаркеров и понимания функций гликанов в клеточных событиях. Кроме того, анализ N-гликанов белковых биофармацевтических препаратов очень важен для использования человеком. В данной статье была представлена высокопроизводительная стратегия идентификации и количественного определения структур N-гликанов с использованием метода HILIC-FLD-MS/MS.

Аннотация

Гликозилирование является жизненно важной модификацией, содержащейся в белках. N-гликановое профилирование гликопротеинов требуется для обнаружения новых кандидатов в биомаркеры и определения изменений гликанов при заболеваниях. Большинство коммерчески доступных биофармацевтических белков являются гликопротеинами. На эффективность этих препаратов влияет характер гликозилирования. Таким образом, необходим метод углубленной характеристики N-гликанов. В данной работе представлен комплексный подход к качественному и количественному анализу N-гликанов с использованием жидкостной хроматографии гидрофильного взаимодействия, оснащенной функцией флуоресцентного детектирования и тандемной масс-спектрометрией (HILIC-FLD-MS/MS). N-гликаны были высвобождены из гликопротеинов легким методом и помечены прокаинамидной флуорофорной меткой в стратегии. Впоследствии меченные прокаинамидом N-гликаны анализировали методом HILIC-FLD-MS/MS. При таком подходе структуры N-гликанов были подтверждены тандемным масс-спектрометрическим анализом, тогда как для количественного анализа использовалась флуоресцентная детекция. В исследовании описывается применение для анализа данных об обнаруженных пиках N-гликанов. Этот протокол может быть применен к любому гликопротеину, извлеченному из различных видов.

Введение

Гликозилирование является жизненно важной посттрансляционной модификацией, наблюдаемой в белках1. Множественные ферментативные процессы регулируют модификацию гликозилирования в клеточных организмах. Гликаны присоединяются к белкам посредством этих ферментативных процессов, а белки, подвергшиеся этой модификации, называются гликопротеинами1. В белках обычно наблюдаются два типа гликозилирования. О-гликозилирование представляет собой присоединение О-гликанов к боковой цепи остатков сериновых или треониновых аминокислот. N-гликозилирование — это присоединение N-гликанов к боковой цепи аминокислотного остатка аспарагина в белке.

На структуру, стабильность и сворачиваемость белков влияют гликановые прикрепления2. Процесс гликозилирования оказывает существенное влияние на функции белков, а гликопротеины регулируют многие клеточные функции в организмах 3,4. Например, сильно гликозилированные белки защищают свои гликопротеины от протеолитической деградации5. Другой пример – гликаны белков щитовидной железы, которые регулируют транспорт Tg и синтез гормонов 6,7. Чтобы объяснить их роль в клеточных событиях, требуется углубленная характеристика гликопротеинов.

N-гликановые профили гликопротеинов изменяются в зависимости от ситуации заболевания 9,10,11,12. Профилирование N-гликанов, полученных из важнейших гликопротеинов или жидкостей организма, необходимо для открытия новых биомаркеров и понимания изменений ферментативной активности в случаях заболевания. С другой стороны, большинство белковых биофармацевтических препаратов являются гликопротеинами, и их гликановые профили влияют на эффективность лекарства13. Таким образом, приемлемый метод профилирования N-гликана должен быть выполнен при разработке надлежащих белковых биофармацевтических препаратов для использования человеком14.

Гликомика – это новая дисциплина, используемая для идентификации и количественного определения гликановых структур гликозилированных молекул15,16. Для профилирования гликанов гликозилированных соединений было использовано множество методов, включая ЯМР17 и MS18. Жидкостная хроматография с гидрофильным взаимодействием и флуоресцентным детектированием (ВЭЖХ-HILIC-FLD) является золотым стандартом метода профилирования N-гликанов, полученных из гликопротеинов19. Когда эта стратегия сочетается с масс-спектрометрическим детектированием, идентификация структур N-гликана может быть более простой и надежной. Большинство флуоресцентных меток, используемых в N-гликановом анализе с помощью масс-спектрометрии, имеют низкую эффективность ионизации. Напротив, прокаинамид увеличивает эффективность ионизации N-гликанов, что используется для получения эффективных тандемных масс-спектров N-гликанов 20,21. Специфические фрагменты могут быть получены с помощью тандемной масс-спектрометрии для структурной идентификации N-гликанов, таких как фукозилированный ядро22 (proc-HexNAc1Fuc1) и бисекционирующие типы23 (proc-Hex1HexNAc3, proc-Hex1HexNAc3Fuc1).

В этом исследовании демонстрируется простой протокол профилирования гликопротеинов с помощью N-гликанов с HILIC-FLD-MS/MS. Представленный метод включает четыре этапа: (1) высвобождение N-гликанов из гликопротеинов, (2) мечение N-гликанов прокаинамидной меткой, (3) очистка прокаинамида, меченного N-гликанами, и (4) анализ данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая человеческая плазма коммерчески доступна (Таблица материалов). В дальнейшем биологические образцы, полученные от человека, не использовались.

1. Высвобождение гликана

  1. Денатурация (глико-)белков
    1. Готовьте стандарты гликопротеинов (например, IgG, моноклональное антитело) в концентрации 10 мкг·мл-1 в деионизированномН2О. Для плазмы крови человека используется концентрация 70 мкг·л-1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы следует подвергать вортексу до тех пор, пока все твердые белки не растворятся. Для подготовки образцов плазмы использовалась человеческая плазма (лиофилизированная).
    2. Возьмите 20 мкл образцов гликопротеина (200 мкг) и лиофилизированную плазму крови человека (1,4 мг).
    3. Добавьте 40 мкл 2% SDS (додецилсульфата натрия) (w/v).
    4. Инкубируйте образцы при 60 °C в течение 10 минут для денатурации (глико-)белков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно смешивать при 500 об/мин с помощью термомиксера во время инкубации. В качестве альтернативы можно использовать встряхивающую водяную баню.
  2. Высвобождение гликана
    1. Добавьте 20 мкл 4% Igepal-CA630 в образцы, начиная с шага 1.1.4.
    2. Добавьте 20 мкл 5x PBS (фосфатный буферный раствор).
    3. Приготовьте фермент PNGase F в концентрации 1 U·μL-1 в деионизированной воде.
    4. Добавьте 1 ЕД фермента для стандартов гликопротеинов и 2 ЕД фермента для образцов плазмы крови человека.
    5. Образцы инкубировать при температуре 37 °C в течение 16 часов.
  3. Маркировка прокаинамидом
    1. Приготовьте раствор для мечения с использованием прокаинамида соляной кислоты (110 мг·мл-1 в ДМСО/АА (диметилсульфоксид/ледяная уксусная кислота) 7/3, v/v).
    2. Раствор восстановительного аминирования готовят с использованием цианоборогидрида натрия (65 мг·мл-1 в ДМСО/АА, 7/3, v/v).
      ВНИМАНИЕ: Цианоборогидрид натрия очень токсичен и легко воспламеняется. Надевайте защитные очки. В качестве альтернативы можно использовать 2-пиколиновый борановый комплекс (107 мг·мл-1 в ДМСО).
    3. Смешайте эти растворы в пропорции 1:1, v/v для приготовления маркировочной смеси.
    4. Добавьте 100 мкл этой меченой смеси к образцу, высвобожденному гликаном, начиная с шага 1.2.5.
    5. Инкубируйте образцы при 65 °C в течение 2 часов.

2. Очистка N-гликанов , меченных прокаинамидом, с помощью картриджа с твердофазной экстракцией (SPE)

  1. Приготовьте раствор микрокристаллической целлюлозы (100 мг·мл-1) в деионизированной воде.
  2. Возьмите 300 μл микрокристаллической целлюлозы и вставьте ее в микроцентрифужные пробирки.
  3. Промойте микрокристаллическую целлюлозу 1 мл деионизированной H2O.
  4. Промойте микрокристаллическую целлюлозу 1 мл ACN/MQ (ацетонитрил/dH2O), 85/15, v/v для кондиционирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микроцентрифугу следует использовать в течение 1 минуты для тщательного удаления моющих растворов.
  5. Возьмите 120 μL раствора для высвобождения гликана и смешайте с 680 μL ACN для получения надлежащих условий нагрузки (85/15, v/v, ACN/образец).
  6. Смешайте эту смесь с микрокристаллической целлюлозой в микроцентрифужных пробирках.
  7. Инкубируйте его при комнатной температуре в термомиксере, встряхивая при 500 об/мин в течение 15 минут.
  8. Переложите суспензию в картридж SPE (объемом 1 мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте попадания воздуха в упаковку картриджа.
  9. Выбросьте загрузочные растворы, проходя медленно (1 капля в секунду).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что система SPE подключена к вакуумному насосу. Растворители могут течь под действием силы тяжести. При необходимости подайте вакуум с помощью вакуумного насоса. Применяемое давление вакуума должно быть соответствующим образом отрегулировано для медленного переноса жидкостей вниз.
  10. Промойте образец, дважды пропустив 1 мл раствора ACN/MQ/TFA (ацетонитрил/dH2O/трифторуксусная кислота) (85/14/1, v/v/v).
  11. Промойте образец, дважды пропустив 1 мл смеси ACN/MQ (85/15, v/v).
  12. Разведите прокаинамид, меченный N-гликанами, с 0,75 мл воды.
  13. Высушите раствор для элюирования концентратором в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для сушки используйте температуру концентратора 45 °C.
  14. Растворите высушенные образцы в смеси 100 мкл ACN/MQ (75/25, v/v) и переложите этот раствор во флаконы, включая вкладыш.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторно растворенные образцы должны находиться в состоянии вортекса в течение 20 секунд.

3. Анализ HILIC-FLD-МС/МС

  1. Вставьте адаптеры тройника (T) в колонну HILIC, чтобы разделить поток на два равных объема. Подключите один из них к детектору FLD, другой — к детектору MS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проточные линии должны быть одинаковой длины.
  2. Отрегулируйте программу градиента для разделения прокаинамида, меченных N-гликанамидом, как показано на дополнительном рисунке 1. Используйте мобильный формиат фазы А: 50 мМ формиат аммония (pH: 4,4 и мобильная фаза B: 100 % ACN).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программа градиента может быть дополнительно оптимизирована в зависимости от гетерогенности гликанов образцов.
  3. Нажмите кнопку «Пробоотборник» и установите объем впрыска на 10 μл.
  4. Нажмите на Column Comp и отрегулируйте температуру колонки до 60 °C.
  5. Нажмите кнопку FLD и отрегулируйте длины волн возбуждения и излучения FLD до 310 нм и 370 нм соответственно.
  6. Настройте источник MS, настройку и параметры MS/MS, как показано на дополнительном рисунке 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры MS и MS/MS могут быть изменены в зависимости от масс-спектрометрии, используемой в анализе.

4. Анализ данных

  1. Идентификация N-гликанов, меченных прокаинамидом
    1. Экспортируйте данные MS/MS в формате, подходящем для поиска в базе данных (например, .mgf, .xml).
    2. Вставьте их в поисковую базу данных для идентификации N-гликанов.
    3. Выберите название образца, указанное в программном обеспечении, и нажмите кнопку «Поиск гликанов » для идентификации прокаинамида, меченного N-гликанамидом, с использованием базы данных Carbbank с заданными параметрами (дополнительный рисунок 3).
    4. Откройте кнопку редактирования хроматограммы в программном обеспечении для анализа данных для получения исходных данных и выберите тип хроматограммы извлеченных ионов путем фильтрации по всем MSn.
    5. Добавьте удельные массы для фукозилированного фрагмента ядра proc-N1F1 (m/z 587.3+) и разрезанных пополам фрагментов proc-H1N3 (m/z 1009.5+) и proc-H1N3F1 (m/z 1155.5+).
    6. Определите предшественники, содержащие фукозилированные ядром и разрезанные пополам фрагменты структуры N-гликанов.
    7. Экспортируйте идентифицированные N-гликановые структуры с помощью программного обеспечения (Дополнительная таблица 1-3).
    8. Проверьте обнаруженные вручную предшественники для определения фукозилированных и рассеченных пополам структур N-гликанов.
  2. Количественное определение N-гликанов, меченных прокаинамидом, с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом24
    1. Выберите хроматограмму FLD на хроматограмме и нажмите на метод в программном обеспечении. Откройте метод для экспорта хроматограмм в формате .xy.
    2. Конвертируйте экспортируемые хроматограммы в формате .xy в файлы .txt.
    3. Откройте программное обеспечение для количественного анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение, используемое в исследовании, можно загрузить с исходного кода Github (https://github.com/Tarskin/HappyTools).
    4. Следуйте инструкциям и туториалам программы, представленным разработчиком.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспорта относительных площадей рекомендуется использовать пакетный процесс.
    5. Отрегулируйте параметры настройки (дополнительный рисунок 4). Определите четыре минимальных пика и 27 соотношений сигнал/шум для калибровки.
    6. Откройте файл результатов с помощью соответствующего программного обеспечения, такого как Microsoft Excel, для дальнейшей оценки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В рамках представленного подхода N-гликаны были впервые высвобождены, помечены меткой прокаинамида и очищены картриджами SPE, содержащими целлюлозу. Затем был проведен N-гликановый анализ IgG, трастузумаба и плазмы крови человека с помощью системы ВЭЖХ-HILIC-FLD-МС/МС. Хроматограммы MS (пик основания) и FLD определенных структур N-гликанов, полученных из IgG и трастузумаба, показаны на рисунке 1 соответственно. Данные МС/МС, полученные в результате этих анализов, б...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

N-гликановое профилирование гликопротеинов включает в себя сложные этапы. Несмотря на то, что существует множество различных методологий для этой цели, следует выбрать подходящий подход как для идентификации, так и для количественной оценки структур N-гликанов 14. HILIC-FLD — это золотой стандарт для количественного определения N-гликанов. Однако идентификация всех типов N-гликанов с помощью FLD не достигается. Таким образом, та...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Министерством развития Турецкой Республики с номером проекта: 2016 K121230. Бекир Салих выражает благодарность Турецкой академии наук (TUBA) за частичную финансовую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Уксусная кислотаCarlo Erba Реагенты401413Glacial RS для LC/MS
АцетонитрилMerck1000292500LC-MS LiChrosolv
Agilent 1200 Series HPLC с дедектором FLD серии 1260Agilent Technologies
Ammoniumm FormateCarlo Erba Реагенты419741для LC/MS
Bruker TIMS-TOF (Q-TOF) Масс-спектрометрияBruker Daltonics
ЦеллюлозаSigma Aldrich310697микрокристаллическая, порошок, 20 μ m
Деионизированная водаРеагенты Carlo Erba412111для LC/MS
диметилсульфоксидаSigma Aldrich41639BioUltra, для молекулярной биологии, ≥ 99,5% (GC)
Пустая полипропиленовая трубка SPE с полиэтиленовыми фриттамиSigma Aldrich5422020 μ м пористость, объем 1 мл
Экстракционный коллектор, 20-позиционныйводный WAT200607В комплекте со штативом для пробирок 13 x 100 мм
Плазма человекаSigma AldrichP9523лиофилизированный
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896для молекулярной биологии
IgGSigma AldrichI4506лиофилизированный порошок
Фосфат буферизованный физиологический растворSigma AldrichP4417Таблетка
фермента PNGазы FPromegaV483A
Прокаинамида гидрохлоридаabcamab120955
Цианоборогидрид натрияSigma Aldrich156159реагент марки, 95%
Додецилсульфат натрияSigma Aldrich71725
трастузумабRoche Diagnostics
Трифторуксусная кислотаSigma Aldrich302031для ВЭЖХ, ≥ 99,9%

Ссылки

  1. Dwek, R. A. Glycobiology: Toward understanding the function of sugars. Chemical Reviews. 96 (2), 683-720 (1996).
  2. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2016).
  3. Spiro, R. G. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12 (4), 43(2002).
  4. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochimica et Biophysica Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  5. Stavenhagen, K., et al. and O-glycosylation Analysis of Human C1-inhibitor Reveals Extensive Mucin-type O-Glycosylation. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1225-1238 (2018).
  6. Ząbczyńska, M., Kozłowska, K., Pocheć, E. Glycosylation in the Thyroid Gland: Vital Aspects of Glycoprotein Function in Thyrocyte Physiology and Thyroid Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
  7. Mallet, B., et al. N-Glycans Modulate in Vivo and in Vitro Thyroid Hormone Synthesis: Study at the N-Terminal Domain Of Thyroglobulin. Journal of Biological Chemistry. 270 (50), 29881-29888 (1995).
  8. Dong, X., et al. Advances in mass spectrometry-based glycomics. Electrophoresis. 39 (24), 3063-3081 (2018).
  9. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  10. Koçak, ÖF., et al. N-glycan profiling of papillary thyroid carcinoma tissues by MALDI-TOF-MS. Analytical Biochemistry. 584, 113389(2019).
  11. Peng, W., et al. Clinical application of quantitative glycomics. Expert Review of Proteomics. 15 (12), 1007-1031 (2018).
  12. Yaman, M. E., Kayili, H. M., Albayrak, M., Kadioglu, Y., Salih, B. Differential N-glycosylation profiling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) invasive ductal carcinoma tissues using MALDI-TOF-MS. Molecular Omics. 17 (3), 394-404 (2021).
  13. Liu, L. Antibody Glycosylation and Its Impact on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Monoclonal Antibodies and Fc-Fusion Proteins. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (6), 1866-1884 (2015).
  14. Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. Glycan analysis of therapeutic glycoproteins. mAbs. 8 (2), 205-215 (2016).
  15. Hart, G. W., Copeland, R. J. Glycomics Hits the Big Time. Cell. 143 (5), 672-676 (2010).
  16. West, C. M., Malzl, D., Hykollari, A., Wilson, I. B. H. Glycomics, Glycoproteomics, Glycogenomics: An Inter-Taxa Evolutionary Perspective. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100024(2021).
  17. Unione, L., et al. Glycoprofile Analysis of an Intact Glycoprotein As Inferred by NMR Spectroscopy. ACS Central Science. 5 (9), 1554-1561 (2019).
  18. Morelle, W., Michalski, J. -C. Analysis of protein glycosylation by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (7), 1585-1602 (2007).
  19. Reusch, D., et al. Comparison of methods for the analysis of therapeutic immunoglobulin G Fc-glycosylation profiles--part 1: separation-based methods. mAbs. 7 (1), 167-179 (2015).
  20. Keser, T., Pavić, T., Lauc, G., Gornik, O. Comparison of 2-Aminobenzamide, Procainamide and RapiFluor-MS as Derivatizing Agents for High-Throughput HILIC-UPLC-FLR-MS N-glycan Analysis. Frontiers in Chemistry. 6, 324(2018).
  21. Kozak, R. P., Tortosa, C. B., Fernandes, D. L., Spencer, D. I. R. Comparison of procainamide and 2-aminobenzamide labeling for profiling and identification of glycans by liquid chromatography with fluorescence detection coupled to electrospray ionization-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 486, 38-40 (2015).
  22. Nwosu, C., Yau, H. K., Becht, S. Assignment of Core versus Antenna Fucosylation Types in Protein N-Glycosylation via Procainamide Labeling and Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87 (12), 5905-5913 (2015).
  23. Kayili, H. M. Identification of bisecting N-glycans in tandem mass spectra using a procainamide labeling approach for in-depth N-glycan profiling of biological samples. International Journal of Mass Spectrometry. 457, 116412(2020).
  24. Jansen, B. C., et al. HappyTools: A software for high-throughput HPLC data processing and quantitation. PLOS ONE. 13 (7), 0200280(2018).
  25. Ruhaak, L. R., et al. Glycan labeling strategies and their use in identification and quantification. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3457-3481 (2010).
  26. Rojas-Macias, M. A., et al. Towards a standardized bioinformatics infrastructure for N- and O-glycomics. Nature Communications. 10 (1), 3275(2019).
  27. Everest-Dass, A. V., Abrahams, J. L., Kolarich, D., Packer, N. H., Campbell, M. P. Structural feature ions for distinguishing N- and O-linked glycan isomers by LC-ESI-IT MS/MS. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (6), 895-906 (2013).
  28. Li, X., Xu, Z., Hong, X., Zhang, Y., Zou, X. Databases and Bioinformatic Tools for Glycobiology and Glycoproteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6727(2020).
  29. Qing, G., Yan, J., He, X., Li, X., Liang, X. Recent advances in hydrophilic interaction liquid interaction chromatography materials for glycopeptide enrichment and glycan separation. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 124, 115570(2020).
  30. Reiding, K. R., et al. Human Plasma N-glycosylation as Analyzed by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance-MS Associates with Markers of Inflammation and Metabolic Health. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (2), 228-242 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.