Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение общей РНК из Pseudomonas aeruginosa в биопленках для измерения экспрессии генов

2.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62755

⸱

24 сентября 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 3Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine, Hospital for Sick Children, 4Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Hospital for Sick Children

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе представлен метод выделения РНК из биопленок Pseudomonas aeruginosa, выращенных в камерных предметных стеклах, для высокопроизводительного секвенирования.

Аннотация

Pseudomonas aeruginosa является условно-патогенным микроорганизмом, вызывающим инфекции дыхательных путей у пациентов с муковисцидозом (МВ). P. aeruginosa известна своей способностью образовывать биопленки, которые защищены матрицей экзополисахаридов. Эта матрица позволяет микроорганизмам быть более устойчивыми к внешним факторам, в том числе к лечению антибиотиками. Одним из наиболее распространенных методов выращивания биопленки для исследований является микротитровка или камерные предметные стекла. Преимущество этих систем заключается в том, что они позволяют тестировать различные условия роста, но их недостаток заключается в том, что они производят ограниченное количество биопленки для экстракции РНК. Цель данной статьи – предоставить подробный, пошаговый протокол о том, как извлечь общую РНК из небольших количеств биопленки достаточного качества и количества для высокопроизводительного секвенирования. Этот протокол позволяет изучать экспрессию генов в этих биопленочных системах.

Введение

Большинство хронических бактериальных инфекций, таких как легочные инфекции у пациентов с муковисцидозом (МВ) и инфекции, связанные с протезированием, характеризуются ростом микроорганизмов внутри биопленок. Биопленки1 представляют собой сообщества бактерий, заключенные в матрицу, состоящую преимущественно из полисахаридов2. Бактерии в биопленках могут быть медленно растущими, метаболически спящими, а также находиться в анаэробных, гипоксических условиях. Биопленки более устойчивы к антибиотикам из-за таких факторов, как снижение проникновения антибиотиков, повышенная экспрессия насосов для оттока лекарств иснижение деления клеток3. По этим и другим причинам они представляют большой исследовательский интерес.

Для точного изучения персистирующих инфекций, таких как хроническая инфекция Pseudomonas aeruginosa у пациентов с муковисцидозом, условия роста, наблюдаемые при образовании биопленки, должны быть точно отражены in vitro. Распространенным методом с высокой пропускной способностью является выращивание их в камерных предметных стеклах или микротитровых планшетах и мониторинг образования биопленки с помощью конфокальноймикроскопии. Известно, что ключевым регулятором при переходе от планктонного, или свободноплавающего, к биопленочному бактериальному образу жизни является вторичный мессенджер, cyclic-di-GMP5. Повышенный уровень cyclic-di-GMP увеличивает экспрессию специфических генов, способствующих росту биопленки. Малые некодирующие регуляторные РНК и чувство кворума также играют важную роль в регуляции образования биопленки5. Измерение экспрессии генов биопленки путем секвенирования экстрагированной бактериальной РНК может быть сложной задачей. P. aeruginosa, например, продуцирует три экзополисахарида (Psl, Pel и альгинат), которые в значительных количествах продуцируются в биопленках 6,7. Эти полисахариды могут препятствовать экстракции и очистке РНК, что приводит к получению нечистых препаратов, содержащих низкие уровни бактериальной мРНК8. Коммерчески доступные наборы для экстракции РНК способны производить высококачественную РНК из планктонных бактериальных культур, но могут не работать так же хорошо с культурами биопленки 9,10,11. Существует несколько коммерческих наборов для экстракции РНК, которые утверждают, что работают для биопленок, один из которых мы используем с этим методом.

В данной рукописи мы описываем процедуры выращивания биопленок P. aeruginosa в предметных стеклах камеры и экстракции бактериальной мРНК для высокопроизводительного секвенирования12,13. Используя клинические изоляты, собранные из образцов мокроты пациентов с муковисцидозом, мы демонстрируем, что эти методы могут быть использованы для изолятов с различными характеристиками роста. По сравнению с предыдущими публикациями, этот протокол подробно описан для достижения большего успеха в изучении экспрессии бактериальных биопленочных генов 11,14,15,16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Совет по этике научных исследований (REB) необходим для сбора и обработки образцов мокроты у людей. Это исследование было одобрено Больницей для больных детей (REB#1000019444). Совет по этике научных исследований (REB) обязан собирать и хранить образцы мокроты у людей. Эти исследования были одобрены Больницей для больных детей РЭБ#1000058579.

1. Образование биопленки

  1. Выращивайте изоляты Pseudomonas aeruginosa, полученные из образцов мокроты пациентов с муковисцидозом, использованных в этом исследовании, на агаровых планшетах Luria Broth (LB) в инкубаторе при температуре 37 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная техника полос важна для получения одиночных бактериальных колоний. Полосы при вращении пластины разбавят клетки бактерий настолько, что могут расти отдельные колонии.
    1. Разбивайте бактерии с помощью петли инокуляции зигзагообразно на верхнем конце свежей пластины LB, пока не будет покрыта примерно 1/4 пластины.
    2. Поверните пластину примерно на 60°. Возьмите новую петлю прививки и пропустите ее один раз через участок с полосами и во второй, чистый участок пластины, повторяя зигзагообразную схему.
    3. Повторите шаг 1.1.2 со свежей петлей в третью область тарелки. Установите на место крышку и переверните пластину при помещении в инкубатор.
  2. Используйте стерильную инокуляционную петлю, чтобы выбрать одну бактериальную колонию из агаровой пластины (содержащей один штамм бактерии) и инокулировать культуральную пробирку, заполненную 5 мл стерильной среды LB. Используя каждый раз новую петлю, инокулируйте две дополнительные культуральные пробирки, заполненные 5 мл LB среды, из той же пластины.
  3. Повторите ту же процедуру инокуляции для разных штаммов бактерий. Выращивайте культуры в течение ночи при температуре 37 °C с встряхиванием при 220 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая агаровая пластина, содержащая один штамм бактерий, используется для инокуляции 3 независимых пробирок для культивирования. Три пробирки представляют собой биологические реплики в трех экземплярах для одного штамма и обрабатываются как отдельные образцы. Это отличается от технических репликаций, которые повлекли бы за собой экстракцию РНК 3 раза из одной культуральной пробирки.
  4. Приготовьте разведение ночных культур в соотношении 1:100, перенеся 50 мкл ночной культуры в новую культуральную пробирку, содержащую 4,95 мл новой LB-среды.
  5. Разведенные культуры выращивают еще 3 ч при 37 °C с встряхиванием при 220 об/мин или до тех пор, пока наружный диаметр600 не составит 0,1 или выше. Измерьте плотность ячеек на спектрофотометре при наружном диаметре600.
  6. В новой пробирке для микрофуги объемом 1,7 мл отрегулируйте наружный диаметр600 до 0,1 (ранняя фаза логарифма) в общем объеме 1,5 мл с помощью свежего LB.
  7. Аккуратно перемешайте методом инверсии. Перенесите 300 μL каждой отрегулированной культуры в 4 лунки 8-луночного предметного стекла, чтобы получить 2 разных образца на предметное стекло (Рисунок 1).
  8. Поместите предметные стекла в холодильник с температурой 37 °C на ночь на 24 часа. Чтобы предотвратить испарение, поместите предметные стекла на верхнюю часть влажного бумажного полотенца в небольшой пластиковый лоток.

2. Восстановление биопленки

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое предметное стекло содержит восемь отдельных лунок. Один образец состоит из четырех лунок с биопленками, которые будут объединеныв 17. Этот протокол экстракции предназначен для 1 образца (4 лунок), где биопленки извлекаются из 2 лунок за раз. Экстракция РНК выполняется с использованием коммерческого набора для экстракции РНК, который включает в себя этап взбивания шариков и очистку в колонке с модификациями. Следуйте инструкциям производителя по приготовлению реагентов.

  1. В ламинарном проточном колпаке медленно удалите среду из 2 из 4 лунок с помощью наконечника для дозатора. Наклоните предметное стекло под углом 45° и выведите фильтрующий материал из нижнего угла лунок, чтобы предотвратить отслоение биопленок.
  2. Удерживая предметное стекло под наклоном, промойте планктонные клетки, осторожно набрав 300 мкл воды, не содержащей РНКазы, в нижний угол двух опорожненных лунок. Удалите воду, аккуратно отпиливая ее, как описано в шаге 2.1. Повторите этап промывки, удалив как можно больше воды.
  3. Добавьте по 300 мкл реагента для защиты РНК (см. Таблицу материалов) в каждую из двух опорожненных лунок с биопленками на основании. Поместите предметное стекло камеры на стеклянную пластину, чтобы предотвратить разрушение лунок, а затем соскребите биопленки в 2 лунках с помощью небольшого, не содержащего нуклеаз, стерильного металлического шпателя, чтобы повторно суспендировать биопленочные бактерии. Дайте постоять до тех пор, пока биопленки не будут извлечены из 2 оставшихся нетронутых лунок из того же образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление реагента для защиты РНК обеспечивает стабильность образцов биопленки в очищенных лунках при температуре окружающей среды при обработке остальных двух лунок того же образца. Реагент защиты РНК лизирует клетки и инактивирует нуклеазы и инфекционные агенты, что приводит к сохранению РНК.
  4. Чтобы извлечь биопленки из оставшихся 2 лунок для образца (напоминаем: один образец состоит из 4 лунок), удалите LB среду из 2 оставшихся новых лунок таким же образом, как описано в шаге 2.1. Повторите шаг 2.2, чтобы смыть планктонные клетки водой без РНКазы из обеих новых скважин, как и раньше.
  5. Вернитесь к первым 2 лункам со соскобленными биопленками в защитном реагенте, полученном в конце шага 2.3, и медленно пипеткой перемешайте 300 мкл ресуспендированной биопленки из одной соскобленной лунки, стараясь не создавать слишком много пузырьков.
    1. Переложите все содержимое из колодца в одну из только что вымытых, опустошенных лунок. Смешайте и перенесите 300 мкл ресуспендированной биопленки из второй соскобленной лунки в оставшуюся, только что промытую, опорожненную лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо добавления нового реагента для защиты РНК в 2 вновь промытые лунки с биопленками, перенесите ранее соскобленные биопленки, уже находящиеся в защитном реагенте, в эти свежепромытые лунки. Это позволит сохранить объединенный объем образца на достаточно низком уровне, чтобы удовлетворить требования к входным данным для коммерческого набора для экстракции РНК. Схема приведена на рисунке 1 .
  6. Повторите соскоб биопленок в новых лунках, как в шаге 2.3, поместив предметное стекло камеры на стеклянную пластину и соскоблив биопленки в 2 новых лунках с помощью небольшого, не содержащего нуклеаз, стерильного металлического шпателя для повторного суспендирования биопленочных бактерий.
  7. Объедините всю ресуспендированную биопленку из 2 новых лунок в одну микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл объемом 1,5 мл без РНКазы с низким уровнем связывания. Измерьте объем, который должен составлять ~500 - 600 μL всего.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Комбинированная биопленочная суспензия из этой второй пары новых лунок будет содержать весь биопленочный материал из исходных 4 лунок образца.

3. Полное выделение РНК и оценка качества

ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция РНК осуществляется с помощью коммерческого набора для экстракции РНК, который, как утверждается, работает на биопленках. По возможности отдельные компоненты включены в Таблицу материалов. По возможности даются пояснения о механизмах, лежащих в основе каждого этапа очистки.

  1. Добавьте достаточное количество реагента для защиты РНК до 750 мкл в пробирке. Перенесите весь объем в трубку для взбивания шариков объемом 2 мл, содержащую шарики 0,1 и 0,5 мм (см. Таблицу материалов). Взбивать в течение 2 1/2 мин в бисерной машине на максимальной скорости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Комбинация гранул высокой плотности 0,1 мм и 0,5 мм в сочетании с высокоскоростным перемешиванием на бисере обеспечивает тщательную гомогенизацию стенок микробных клеток.
  2. Центрифуга при 16 000 х г в течение 1 минуты для гранулирования гранул. Перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку, минимизировав перенос любых шариков, что облегчит шаг 3.3. Измерьте объем.
  3. Добавьте равный объем буфера для лизиса РНК (~450 μл) и хорошо перемешайте. Перенесите до 800 мкл образца, избегая переноса гранул, в колонку с кремнеземом в сборной пробирке и центрифугуйте при давлении 16 000 x g в течение 30 с. Сохраните проточный поток, так как он содержит РНК, в то время как ДНК привязана к столбцу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для лизиса РНК содержит тиоцианат гуанидиния и детергент N-лауроилсаркозин для лизирования клеток. Тиоцианат гуанидиния является хаотропным агентом, который также инактивирует нуклеазы и в присутствии диоксида кремния, обнаруженного в спиновой колонке, способствует связыванию ДНК с кремнеземом18. Отсутствие этанола обеспечивает преимущественное связывание ДНК, а не РНК со спин-колонкой19 кремнезема. Целью шага 3.3 является связывание и удаление геномной ДНК. Мы хотим сохранить РНК, которая содержится в проточной части.
  4. Если осталось больше пробы, перенесите колонку в новую пробирку для сбора и загрузите ее вместе с остальной пробой. Центрифуга при 16 000 x g в течение 30 с. Сохраняем проточный с РНК и соединяем с первой аликвотой.
  5. Измерьте общий объем проточного потока, добавьте равный объем 100 % этанола и хорошо перемешайте. Переведите до 800 μL раствора в новую, вторую спин-колонку из диоксида кремния в сборной пробирке и центрифуге при давлении 16 000 x g в течение 30 с. Откажитесь от проточного потока.
    Примечание: Добавление этанола в раствор хаотропной соли, содержащий РНК, усиливает связывание РНК со спин-колонкой19 диоксида кремния.
  6. Для растворов объемом > 800 мкл перезагрузите спин-колонку и центрифугуйте до тех пор, пока весь раствор не будет пропущен. Отбрасывайте проточный поток после каждого спина.
  7. Добавьте в колонку 400 мкл промывочного буфера и центрифугируйте при давлении 16 000 x g в течение 30 с, чтобы удалить часть солей. Откажитесь от проточного потока.
  8. Приготовьте реакционную смесь ДНКазы I в соответствии с инструкциями производителя и проведите обработку ДНКазой в колонке для удаления остаточной ДНК.
  9. Ресуспендируйте лиофилизированную ДНКазу I в 275 мкл воды, не содержащей РНКазы, с получением раствора 1 ед/мкл. Перемешайте путем легкой инверсии.
  10. Смешайте 5 мкл разбавленной ДНКазы I с 75 мкл предоставленного буфера для расщепления ДНКазы. Аккуратно перемешайте методом инверсии.
  11. Добавьте 80 мкл приготовленного раствора непосредственно в матрицу колонки. Выдерживать при комнатной температуре в течение 20 минут.
  12. Добавьте в колонку 400 мкл буфера для подготовки РНК и центрифугируйте при 16 000 x g в течение 30 с. Откажитесь от проточного потока.
  13. Добавьте в колонку 700 мкл промывочного буфера для РНК и повторите центрифугирование. Откажитесь от проточного потока.
  14. Добавьте 400 μл буфера для промывки РНК и центрифугируйте колонку в течение 2 минут, чтобы полностью удалить остатки буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует 2 различных этапа промывки для удаления загрязнений с колонны. Подготовительный буфер содержит слабую хаотропную соль, смешанную с этанолом, для удаления остаточных белков. Далее промывочный буфер используется для выполнения промывки этанолом для удаления солей. Любой оставшийся этанол должен быть удален для обеспечения эффективного элюирования РНК19,20.
  15. Осторожно переложите колонку в новую микроцентрифужную пробирку с низким уровнем связывания.
  16. Добавьте 50 мкл воды, не содержащей РНКазы, непосредственно в матрицу колонки и инкубируйте в течение 5 минут. Центрифугируйте при давлении 16 000 x g в течение 1 минуты для элюирования РНК.
  17. Для дополнительной очистки для удаления ингибиторов ПЦР поместите фильтр ингибитора ПЦР в новую пробирку для сбора. Добавьте 600 мкл предоставленного раствора для приготовления ингибитора (см. Таблицу материалов).
  18. Центрифуга при 8 000 х г в течение 3 мин для промывки фильтра. Переложите промытый фильтр в новую микроцентрифужную пробирку с низким уровнем связывания.
  19. Перенесите элюированную РНК из шага 3.13 в промытый фильтр и центрифугируйте при 16 000 x g в течение 3 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: РНК можно использовать немедленно или хранить при температуре -80 °C.
  20. Определение концентрации РНК с помощью высокочувствительной флуориметрической системы21.
    Примечание: Эти системы позволяют проводить чувствительное количественное определение небольшого количества РНК в растворе, специфичном для интересующей мишени.
    1. Оцените качество РНК с помощью автоматизированной системы электрофореза, которая может предоставить RIN (число целостности РНК), которое является мерой качества РНК22,23.

4. Истощение рибосомной РНК и высокопроизводительное секвенирование

  1. Подайте РНК в Центр анализа эволюции и функции генома (CAGEF) при Университете Торонто (Торонто, Канада) (https://www.cagef.utoronto.ca/) для истощения бактериальной рРНК и подготовки направленной библиотеки РНК (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Истощение бактериальной рРНК нацелено на удаление 5S, 16S и 23S рРНК24.
  2. Истощайте рРНК с помощью коммерческого набора для истощения бактериальных рРНК. Следуйте протоколу для ввода 10 нг - 1 мкг неповрежденной или частично деградированной общей РНК.
  3. Создание библиотек секвенирования РНК с помощью набора для подготовки направленной библиотеки РНК с различными индексами, прикрепленными к каждой библиотеке.
  4. Объедините эквимолярные количества каждой библиотеки РНК и выполните высокопроизводительное секвенирование с помощью 100 спаренных прочтенийоснований 25.

5. Оценка качества чтения секвенирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте качество чтения секвенирования с помощью бесплатной программы FastQC26, доступной на бесплатной платформе с открытым исходным кодом Galaxy27.

  1. Перейдите в https://usegalaxy.org/. Нажмите на меню «Войти» или «Зарегистрироваться » и войдите в систему с учетными данными или создайте учетную запись.
  2. Нажмите на ссылку «Загрузить данные » в левом верхнем углу страницы в меню «Инструменты» и загрузите файлы fastq.gz секвенирования. Подождите, пока имена файлов появятся в правой части страницы, под панелью «История».
  3. Выберите «Контроль качества FASTQ» в меню «Инструменты», чтобы открыть список программ. Выберите FastQC, который заполнит среднюю панель экрана.
  4. В разделе Короткие данные чтения из текущей истории выберите загруженные файлы fastq.gz в раскрывающемся меню.
  5. Нажмите кнопку Выполнить , чтобы запустить программу.
  6. Просмотрите результаты на панели «История» (Таблица 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более подробных инструкций по использованию Galaxy посетите страницу поддержки по адресу https://galaxyproject.org/support/.

6. Картирование прочтений секвенирования

ПРИМЕЧАНИЕ: В списке указан базовый конвейер для обрезки адаптеров и картирования чтения данных RNA-seq. Последовательности адаптеров обрезаются из операций чтения с помощью Trimmomatic28. Обрезанные прочтения картируются с референсным геномом P. aeruginosa PAO1 (NC_002516.2), полученным из NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)29с использованием BWA30 и Samtools31. Для простоты пара операций чтения называется PA_1.fq и PA_2.fq; Файл чтения адаптера, подлежащий обрезке, называется adapter.fa; а референсная последовательность PAO1 называется PAO1.fasta. Все инструменты имеют открытый исходный код и работают в среде UNIX/LINUX. Настоятельно рекомендуется ознакомиться с основами UNIX/LINUX, чтобы выполнять эти команды.

  1. Откройте окно в UNIX/LINUX.
  2. Установите Java, Trimmomatic, BWA и Samtools.
  3. Перейдите в папку, в которой находится файл trimmomatic-0.39.jar.
  4. Отрежьте все последовательности адаптеров из операций чтения, введя команду:
    Java -jar PA_1.fq PA_2.fq PA_1_paired.fq PA_1_unpaired.fq PA_2_paired.fq PA_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP: adapters.fa
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаляются только последовательности адаптеров. Чтение не было обрезано по качеству32.
  5. Переместите файл справочника PAO1.fasta в ту же папку.
  6. Индексируйте ссылку с помощью BWA с помощью команды:
    Индекс Bwa PA01.fasta
  7. Сопоставьте парные чтения с эталонным геномом, введя следующие 4 команды. Введите каждую команду после завершения предыдущей.
    Bwa -mem PA01.fasta PA_1_paired.fq PA2_2_paired.fq > PA_R1R2_map.mem.sam
    Samtools view -S -b PA_R1R2_map.mem.sam > PA_R1R2.bam
    Samtools sort PA_R1R2.bam -o PA_R1R2_sorted.bam
    Индекс Samtools PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam
  8. Просмотрите статистику сопоставления, введя команду:
    Флагстат Samtools PA_R1R2_sorted.bam
    ПРИМЕЧАНИЕ:3-я строка статистики показывает долю прочтений, которые соответствуют референсному геному.
  9. Вычислите среднюю глубину чтения и ширину покрытия с помощью следующих 2 команд33 соответственно:
    Samtools глубина -a PA_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; s+=$3}END{print s/c}'
    Глубина SamTools -а PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; if($3>0) total+=1}END{print (total/c)*100}'

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Общий обзор метода представлен на рисунке 1. Ранее мы использовали 8-луночные камерные стекла для выращивания биопленок P. aeruginosa и воздействия на них антибиотиков, а затем исследовали их с помощью конфокальной микроскопии в разных временных точках12,13. Этот метод может быть использован для извлечения общей РНК непосредственно из биопленок, выращенных в этой системе, с целью изучения изменений экспрессии генов после обр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Общая РНК была успешно экстрагирована из 17 различных образцов бактериальной биопленки в трех экземплярах, в результате чего был получен в общей сложности 51 образец. Сорок девять библиотек РНК объединены и успешно секвенированы. В целом, это подтверждает наши критерии качества с вероятностью успеха 96 %, несмотря на то, что более половины образцов считаются малораспространенными и неоптимального качества 34,35,36,37.<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не могут декларировать никаких разоблачений.

Благодарности

Вклад авторов:.В., Ю.Й. и В.В. принимали участие в концептуализации исследования. К.Г., Л.ДЖ., А.М. и.В. оптимизировали лабораторные протоколы. Финансирование K.G. было поддержано субсидией Программы стажировки студентов через BioTalent Canada.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Agilent 2100 БиоанализаторAgilentG2939BAАвтоматизированный электрофорез биомолекул
Agilent RNA 6000 pico kitAgilent5067-1513Высокочувствительный чип для электрофореза РНК для генерации РИН
ДНК/РНК Лизисный буферZymo ResearchD7001-1-50Тиоцианат гуанидиния и лизисный буфер на основе N-лауроилсаркозина, продаваемый в составе набора для очистки нуклеиновых кислот
Буфер для подготовки ДНК/РНКZymo ResearchD7010-2-10Буфер гуанидина HCl и этанола, используемый для очистки ДНК и РНК
ДНК/РНК ShieldZymo ResearchR1100-50Реагент для сохранения/защиты ДНК и РНК
Буфер для промывки ДНК/РНКZymo ResearchD7010-3-6Буфер для соли и этанола, используемый для очистки ДНК и РНК
DNBSEQ G-400RSMGIG-400RSВысокопроизводительный секвенатор
MGIEasy RNA Набор для подготовки направленной библиотекиMGI1000006386Создание библиотек для платформ высокопроизводительного секвенирования MGI из общей РНК.
Mini-Beadbeater-96BioSpec1001Высокоэнергетический, высокопроизводительный клеточный разрушитель
NEBНесток для истощения рРНК (бактерии)New England BiolabsE7850XЭффективное и специфическое истощение бактериальной рРНК (5S, 16S, 23S)
Система камерных стекол Nunc Lab-Tek IIThermo Fisher Scientific1545348-луночная камера со съемными лунками
Qubit FluorometerThermo Fisher ScientificQ33238Флуориметр для ДНК, РНК и белков
Qubit RNA HS Набор для анализаThermo Fisher ScientificQ32852Высокочувствительный флуориметрический анализ для измерения концентрации РНК
Спин-Away ФильтрыZymo ResearchC1006-50-FСпиновая колонка на основе диоксида кремния, в основном используемая для связывания или удаления геномной ДНК
Стерильные петли инокуляции, 1 мклSarstedt86.1567.050Стерильные, одноразовые петли посева для манипуляций с микроорганизмами
ZR BashingBead Lysis tubesZymo ResearchS6003-502 мл пробирки, содержащие 0,1 и 0,5 мм матрицу лизиса бусин для гомогенизации биологических образцов
Zymo Spin IIICG Колонки ZymoResearchC1006-50-GСпиновая колонка на основе диоксида кремния для очистки ДНК и РНК
Zymo-Spin III-HRC FiltersZymo ResearchC1058-50Удалить ингибиторы, такие как полифенольные соединения, гуминовые/фульвовые кислоты, дубильные вещества, меланин и т.д.
Набор Zymobiomics DNA/RNA Miniprep Набордвойной экстракции ДНК и РНКZymo ResearchR2002
Zymobiomics HRC Prep solutionZymo ResearchD4300-7-30Для использования с фильтрами Zymo-Spin III-HRC для удаления ингибиторов ПЦР
для

Ссылки

  1. Beaudoin, T., Waters, V. Infections With Biofilm Formation: Selection of Antimicrobials and Role of Prolonged Antibiotic Therapy. The Pediatric Infectious Disease Journal. 35 (6), 695-697 (2016).
  2. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
  3. Folsom, J. P., et al. Physiology of Pseudomonas aeruginosa in biofilms as revealed by transcriptome analysis. BMC Microbiology. 10, 294(2010).
  4. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  5. Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (10), 791-808 (2013).
  6. Colvin, K. M., et al. The Pel and Psl polysaccharides provide Pseudomonas aeruginosa structural redundancy within the biofilm matrix. Environmental Microbiology. 14 (8), 1913-1928 (2012).
  7. Hentzer, M., et al. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of Bacteriology. 183 (18), 5395-5401 (2001).
  8. Cury, J. A., Koo, H. Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms. Analytical Biochemistry. 365 (2), 208-214 (2007).
  9. Francavilla, M., et al. Extraction, characterization and in vivo neuromodulatory activity of phytosterols from microalga Dunaliella tertiolecta. Current Medicinal Chemistry. 19 (18), 3058-3067 (2012).
  10. Atshan, S. S., et al. Improved method for the isolation of RNA from bacteria refractory to disruption, including S. aureus producing biofilm. Gene. 494 (2), 219-224 (2012).
  11. Franca, A., Melo, L. D., Cerca, N. Comparison of RNA extraction methods from biofilm samples of Staphylococcus epidermidis. BMC Research Notes. 4, 572(2011).
  12. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. The Journal of Visusalized Experiments. (47), e2481(2011).
  13. Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model. The Journal of Visusalized Experiments. (118), e54819(2016).
  14. Cockeran, R., et al. Biofilm formation and induction of stress response genes is a common response of several serotypes of the pneumococcus to cigarette smoke condensate. The Journal of Infection. 80 (2), 204-209 (2020).
  15. Bisht, K., Moore, J. L., Caprioli, R. M., Skaar, E. P., Wakeman, C. A. Impact of temperature-dependent phage expression on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. npj Biofilmsand Microbiomes. 7 (22), (2021).
  16. Harrison, A., et al. Reprioritization of biofilm metabolism is associated with nutrient adaptation and long-term survival of Haemophilus influenzae. NPJ Biofilms and Microbiomes. 5 (1), 33(2019).
  17. Sousa, C., Franca, A., Cerca, N. Assessing and reducing sources of gene expression variability in Staphylococcus epidermidis biofilms. BioTechniques. 57, 295-301 (2014).
  18. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
  19. Coppin, C. Re: How do silica based RNA spin columns only bind RNA and not DNA. , Available from: https://www.researchgate.net/post/How_do_silica_based_RNA_spin_columns_only_bind_RNA_and_not_DNA/60b017bffa5c4151cac1c/citation/download (2021).
  20. Kennedy, S. A complete guide to how nucleic extraction kits work. , Available from: https://bitesizebio.com/13516/how-dna-extraction-rna-miniprep-kits-work/ (2021).
  21. Qubit RNA HS Assay Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FQubit_RNA_HS_Assay_UG.pdf&title=VXNlciBHdWlkZTogUXViaXQgUk5BIEhTIEFzc2F5IEtpdHM (2015).
  22. Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN) - Standardization of RNA Quality Control (Application report # 5989-1165EN). , Available from: https://www.agilent.com/cd/library/applications/5989-1165EN.pdf (2016).
  23. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  24. Culviner, P. H., Guegler, C. K., Laub, M. T. A Simple, Cost-Effective, and Robust Method for rRNA Depletion in RNA-Sequencing Studies. mBio. 11 (2), (2020).
  25. MGIEasy RNA Directional Library Prep Set User Manual verA2. MGI Tech Co. , Available from: https://en.mgi-tech.com/products/reagents_info/14/ (2020).
  26. Andrews, S. FastQC: A Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  27. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
  28. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina Sequence Data. Bioinformatics. , (2014).
  29. NCBI Resource Coordinators. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 44 (1), (2016).
  30. Li, H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM. arXiv. , (2013).
  31. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), (2009).
  32. Liao, Y., Shi, W. Read trimming is not required for mapping and quantification of RNA-seq reads at the gene level. NAR Genomics and Bioinformatics. 2 (3), (2020).
  33. Penir, S. Calculating Mapping Statistics from a SAM/BAM file using SAMtools and awk. , Available from: https://sarahpenir.github.io/bioinformatics/awk/calculating-mapping-stats-from-a-bam-file-using-samtools-and-awk/ (2019).
  34. Haile, S., et al. Evaluation of protocols for rRNA depletion based RNA sequencing of nanogram inputs of mammalian total RNA. PLoS ONE. 14 (10), 0224578(2019).
  35. Schuierer, S., et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 18 (442), (2017).
  36. Shanker, S., et al. Evaluation of Commercially Available RNA Amplification Kits for RNA Sequencing Using Very Low Input Amounts of Total RNA. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), (2015).
  37. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10, 623-629 (2013).
  38. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biology. 17 (13), (2016).
  39. Illumina, Inc. Coverage depth recommendations. , Available from: https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/plan-experiments/coverage.html (2021).
  40. What is a good sequencing depth for bulk RNA-Seq. ECSEQ Bioinformatics. , Available from: https://www.ecseq.com/support/ngs/what-is-a-good-sequencing-death-for-bulk-rna-seq (2019).
  41. Bedre, R. Sequencing coverage and breadth of coverage. , Available from: https://www.reneshbedre.com/blog/sequencing-coverage.html (2021).
  42. Dotsch, A., et al. The Pseudomonas aeruginosa transcriptome in planktonic cultures and static biofilms using RNA sequencing. PLoS One. 7 (2), 31092(2012).
  43. Chen, Y., et al. Population dynamics and transcriptomic responses of Pseudomonas aeruginosa in a complex laboratory microbial community. npj Biofilms and Microbiomes. 5 (1), (2019).
  44. Thoming, J. G., et al. Parallel evolutionary paths to produce more than one Pseudomonas aeruginosa biofilm phenotype. NPJ Biofilms and Microbiomes. 6, 2(2020).
  45. Soares, A., et al. Understanding ciprofloxacin failure in Pseudomonas aeruginosa biofilm: persister cells survive matrix disruption. Frontiers in Microbiology. 10, 2603(2019).
  46. Whiteley, M., et al. Gene expression in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 413, (2001).
  47. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1, (2006).
  48. Liu, Y., Zhou, J., White, K. P. RNA-seq differential expression studies: more sequence or more replication. Bioinformatics. 30 (3), (2014).
  49. Wieczorek, D., Delauriere, L., Schagat, T. Methods of RNA Quality Assessment. , Available from: https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment/ (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Выделение РНК из биопленокэкстракция тотальной РНКформирование биопленокэкзополисахаридный матриксбиопленки в микротитрационных планшетахвысокопроизводительное секвенированиебактериальный патогенмуковисцидоз

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.