Выделение общей РНК из Pseudomonas aeruginosa в биопленках для измерения экспрессии генов

Краткое содержание

В этом протоколе представлен метод выделения РНК из биопленок Pseudomonas aeruginosa, выращенных в камерных предметных стеклах, для высокопроизводительного секвенирования.

Аннотация

Pseudomonas aeruginosa является условно-патогенным микроорганизмом, вызывающим инфекции дыхательных путей у пациентов с муковисцидозом (МВ). P. aeruginosa известна своей способностью образовывать биопленки, которые защищены матрицей экзополисахаридов. Эта матрица позволяет микроорганизмам быть более устойчивыми к внешним факторам, в том числе к лечению антибиотиками. Одним из наиболее распространенных методов выращивания биопленки для исследований является микротитровка или камерные предметные стекла. Преимущество этих систем заключается в том, что они позволяют тестировать различные условия роста, но их недостаток заключается в том, что они производят ограниченное количество биопленки для экстракции РНК. Цель данной статьи – предоставить подробный, пошаговый протокол о том, как извлечь общую РНК из небольших количеств биопленки достаточного качества и количества для высокопроизводительного секвенирования. Этот протокол позволяет изучать экспрессию генов в этих биопленочных системах.

Введение

Большинство хронических бактериальных инфекций, таких как легочные инфекции у пациентов с муковисцидозом (МВ) и инфекции, связанные с протезированием, характеризуются ростом микроорганизмов внутри биопленок. Биопленки¹ представляют собой сообщества бактерий, заключенные в матрицу, состоящую преимущественно из полисахаридов². Бактерии в биопленках могут быть медленно растущими, метаболически спящими, а также находиться в анаэробных, гипоксических условиях. Биопленки более устойчивы к антибиотикам из-за таких факторов, как снижение проникновения антибиотиков, повышенная экспрессия насосов ....

Протокол

Совет по этике научных исследований (REB) необходим для сбора и обработки образцов мокроты у людей. Это исследование было одобрено Больницей для больных детей (REB#1000019444). Совет по этике научных исследований (REB) обязан собирать и хранить образцы мокроты у людей. Эти исследования были одобрены Больницей для больных детей РЭБ#1000058579.

1. Образование биопленки

1. Выращивайте изоляты Pseudomonas aeruginosa, полученные из образцов мокроты пациентов с муковисцидозом, использованных в этом исследовании, на агаровых планшетах Luria Broth (LB) в инкубаторе при температуре 37 °C в течение ....

Результаты

Общий обзор метода представлен на рисунке 1. Ранее мы использовали 8-луночные камерные стекла для выращивания биопленок P. aeruginosa и воздействия на них антибиотиков, а затем исследовали их с помощью конфокальной микроскопии в разных временных точках^12,13. Этот метод может быть использован для извлечения общей РНК непосредственно из биопленок, выращенных в этой системе, с целью изучения изменений экспрессии генов после обр.......

Обсуждение

Общая РНК была успешно экстрагирована из 17 различных образцов бактериальной биопленки в трех экземплярах, в результате чего был получен в общей сложности 51 образец. Сорок девять библиотек РНК объединены и успешно секвенированы. В целом, это подтверждает наши критерии качества с вероятностью успеха 96 %, несмотря на то, что более половины образцов считаются малораспространенными и неоптимального качества 34,35,36,37.<.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Agilent 2100 Биоанализатор	Agilent	G2939BA	Автоматизированный электрофорез биомолекул
Agilent RNA 6000 pico kit	Agilent	5067-1513	Высокочувствительный чип для электрофореза РНК для генерации РИН
ДНК/РНК Лизисный буфер	Zymo Research	D7001-1-50	Тиоцианат гуанидиния и лизисный буфер на основе N-лауроилсаркозина, продаваемый в составе набора для очистки нуклеиновых кислот
Буфер для подготовки ДНК/РНК	Zymo Research	D7010-2-10	Буфер гуанидина HCl и этанола, используемый для очистки ДНК и РНК
ДНК/РНК Shield	Zymo Research	R1100-50	Реагент для сохранения/защиты ДНК и РНК
Буфер для промывки ДНК/РНК	Zymo Research	D7010-3-6	Буфер для соли и этанола, используемый для очистки ДНК и РНК
DNBSEQ G-400RS	MGI	G-400RS	Высокопроизводительный секвенатор
MGIEasy RNA Набор для подготовки направленной библиотеки	MGI	1000006386	Создание библиотек для платформ высокопроизводительного секвенирования MGI из общей РНК.
Mini-Beadbeater-96	BioSpec	1001	Высокоэнергетический, высокопроизводительный клеточный разрушитель
NEBНесток для истощения рРНК (бактерии)	New England Biolabs	E7850X	Эффективное и специфическое истощение бактериальной рРНК (5S, 16S, 23S)
Система камерных стекол Nunc Lab-Tek II	Thermo Fisher Scientific	154534	8-луночная камера со съемными лунками
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33238	Флуориметр для ДНК, РНК и белков
Qubit RNA HS Набор для анализа	Thermo Fisher Scientific	Q32852	Высокочувствительный флуориметрический анализ для измерения концентрации РНК
Спин-Away Фильтры	Zymo Research	C1006-50-F	Спиновая колонка на основе диоксида кремния, в основном используемая для связывания или удаления геномной ДНК
Стерильные петли инокуляции, 1 мкл	Sarstedt	86.1567.050	Стерильные, одноразовые петли посева для манипуляций с микроорганизмами
ZR BashingBead Lysis tubes	Zymo Research	S6003-50	2 мл пробирки, содержащие 0,1 и 0,5 мм матрицу лизиса бусин для гомогенизации биологических образцов
Zymo Spin IIICG Колонки Zymo	Research	C1006-50-G	Спиновая колонка на основе диоксида кремния для очистки ДНК и РНК
Zymo-Spin III-HRC Filters	Zymo Research	C1058-50	Удалить ингибиторы, такие как полифенольные соединения, гуминовые/фульвовые кислоты, дубильные вещества, меланин и т.д.
Набор Zymobiomics DNA/RNA Miniprep Набор	двойной экстракции ДНК и РНК	Zymo Research	R2002
Zymobiomics HRC Prep solution	Zymo Research	D4300-7-30	Для использования с фильтрами Zymo-Spin III-HRC для удаления ингибиторов ПЦР

для