Масштабируемый метод изучения выживаемости нейронов в первичной культуре нейронов с разрешением для одной клетки и в реальном времени

Ángela Rodríguez-Prieto; Ana González-Manteiga; Yaiza Domínguez-Canterla; Carmen Navarro-González; Pietro Fazzari

doi:10.3791/62759

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Масштабируемый метод изучения выживаемости нейронов в первичной культуре нейронов с разрешением для одной клетки и в реальном времени

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62759

⸱

26 июля 2021 г.

Ángela Rodríguez-Prieto^*¹ , Ana González-Manteiga^*¹ , Yaiza Domínguez-Canterla¹ , Carmen Navarro-González¹ , Pietro Fazzari¹

¹Laboratory of Cortical Circuits in Health and Disease, Centro de Investigación Príncipe Felipe

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем простую, мощную и универсальную методологию исследования выживаемости нейронов при цитотоксическом стрессе в первичных корковых нейронах с клеточным разрешением в реальном времени или в фиксированном материале.

Аннотация

Потеря нейронов лежит в основе многих невропатологий, включая инсульт, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Были разработаны различные методы изучения процесса выживания нейронов при цитотоксическом стрессе. Большинство методов основаны на биохимических подходах, которые не позволяют разрешить работу с отдельными клетками или включают сложные и дорогостоящие методологии. Здесь представлена универсальная, недорогая и эффективная экспериментальная парадигма для изучения выживания нейронов. Этот метод использует преимущества разреженной флуоресцентной маркировки нейронов с последующей визуализацией в реальном времени и автоматизированной количественной оценкой. С этой целью нейроны электропорируются для экспрессии флуоресцентных маркеров и культивируются совместно с неэлектропорированными нейронами, чтобы легко регулировать плотность клеток и увеличивать выживаемость.

Разреженная маркировка с помощью электропорации обеспечивает простую и надежную автоматическую количественную оценку. Кроме того, флуоресцентное мечение может быть объединено с совместной экспрессией гена, представляющего интерес, для изучения специфических молекулярных путей. В данной работе мы представляем модель инсульта в качестве нейротоксической модели, а именно анализ кислородно-глюкозной недостаточности (ОГД), который проводился в доступной и надежной самодельной гипоксической камере. Наконец, описываются два различных рабочих процесса с использованием IN Cell Analyzer 2200 или ImageJ с открытым исходным кодом для анализа изображений для полуавтоматической обработки данных. Этот рабочий процесс может быть легко адаптирован к различным экспериментальным моделям токсичности и масштабирован для высокопроизводительного скрининга. В заключение следует отметить, что описанный протокол обеспечивает доступную, доступную и эффективную модель нейротоксичности in vitro , которая может быть пригодна для проверки роли конкретных генов и путей в визуализации в реальном времени и для высокопроизводительного скрининга лекарственных средств.

Введение

Для изучения нейрональных нарушений требуются экспериментальные модели, которые поддаются генетическому, молекулярному и клеточному анализу. Первичные корковые нейроны являются очень мощной моделью для изучения выживаемости и токсичности нейронов 1,2,3,4. При соответствующих условиях первичные нейроны будут постепенно развивать синаптические контакты и будут иметь признаки зрелых нейронов. Поэтому эта модель более надежна, чем иммортализированные клеточные линии, в моделировании физиологии нейронов и более п....