Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Масштабируемый метод изучения выживаемости нейронов в первичной культуре нейронов с разрешением для одной клетки и в реальном времени

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62759

⸱

26 июля 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cortical Circuits in Health and Disease, Centro de Investigación Príncipe Felipe

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем простую, мощную и универсальную методологию исследования выживаемости нейронов при цитотоксическом стрессе в первичных корковых нейронах с клеточным разрешением в реальном времени или в фиксированном материале.

Аннотация

Потеря нейронов лежит в основе многих невропатологий, включая инсульт, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Были разработаны различные методы изучения процесса выживания нейронов при цитотоксическом стрессе. Большинство методов основаны на биохимических подходах, которые не позволяют разрешить работу с отдельными клетками или включают сложные и дорогостоящие методологии. Здесь представлена универсальная, недорогая и эффективная экспериментальная парадигма для изучения выживания нейронов. Этот метод использует преимущества разреженной флуоресцентной маркировки нейронов с последующей визуализацией в реальном времени и автоматизированной количественной оценкой. С этой целью нейроны электропорируются для экспрессии флуоресцентных маркеров и культивируются совместно с неэлектропорированными нейронами, чтобы легко регулировать плотность клеток и увеличивать выживаемость.

Разреженная маркировка с помощью электропорации обеспечивает простую и надежную автоматическую количественную оценку. Кроме того, флуоресцентное мечение может быть объединено с совместной экспрессией гена, представляющего интерес, для изучения специфических молекулярных путей. В данной работе мы представляем модель инсульта в качестве нейротоксической модели, а именно анализ кислородно-глюкозной недостаточности (ОГД), который проводился в доступной и надежной самодельной гипоксической камере. Наконец, описываются два различных рабочих процесса с использованием IN Cell Analyzer 2200 или ImageJ с открытым исходным кодом для анализа изображений для полуавтоматической обработки данных. Этот рабочий процесс может быть легко адаптирован к различным экспериментальным моделям токсичности и масштабирован для высокопроизводительного скрининга. В заключение следует отметить, что описанный протокол обеспечивает доступную, доступную и эффективную модель нейротоксичности in vitro , которая может быть пригодна для проверки роли конкретных генов и путей в визуализации в реальном времени и для высокопроизводительного скрининга лекарственных средств.

Введение

Для изучения нейрональных нарушений требуются экспериментальные модели, которые поддаются генетическому, молекулярному и клеточному анализу. Первичные корковые нейроны являются очень мощной моделью для изучения выживаемости и токсичности нейронов 1,2,3,4. При соответствующих условиях первичные нейроны будут постепенно развивать синаптические контакты и будут иметь признаки зрелых нейронов. Поэтому эта модель более надежна, чем иммортализированные клеточные линии, в моделировании физиологии нейронов и более поддается манипуляциям, чем животные модели. Однако, по сравнению с клеточными линиями, первичные нейроны коры головного мозга трудно трансфицируются и относительно хрупки. Кроме того, сложная морфология нейронов коры головного мозга может усложнить визуализацию и анализ в культурах с высокой плотностью. И наоборот, первичные нейронные культуры низкой плотности легче анализировать, но, как правило, они более хрупкие.

Принимая во внимание все это, в данной статье представлен доступный, универсальный и масштабируемый рабочий процесс in vitro для моделирования и исследования выживаемости нейронов (рис. 1). Ключевыми моментами этого протокола являются: i) метод электропорации нейронов in vitro с помощью флуоресцентного маркера для обеспечения разреженной маркировки и визуализации живых клеток; ii) его универсальность в различных моделях цитотоксичности; и iii) полуавтоматический или автоматизированный анализ.

Система электропорации (см. Таблицу материалов) представляет собой открытую и недорогую процедуру, которая не предполагает использования наборов и специфических растворов 4,5,6. Более того, этот метод может быть легко адаптирован для получения оптимальной эффективности трансформации и плотности трансфицированных нейронов, смешивая электропорированные и неэлектропорированные клетки. Совместное культивирование с наивными (неэлектропорированными) нейронами значительно улучшает жизнеспособность электропорированных клеток по сравнению с культурами с низкой плотностью. Кроме того, он позволяет разреженную маркировку с регулируемой плотностью электропорированных нейронов, поддерживая постоянный уровень экспрессии генов. Важно стремиться к 3-5% электропорированных нейронов в анализах выживаемости.

Наличие разреженной маркировки существенно упрощает автоматизацию анализа изображений, поскольку ячейки хорошо разделены и легко различимы. В частности, эта экспериментальная парадигма может быть адаптирована для тестирования нескольких интересующих нас генов путем одновременного культивирования нейронов, совместно электропорированных с различными цитозольными флуоресцентными маркерами (например, голубым флуоресцентным белком, красным флуоресцентным белком (RFP), зеленым флуоресцентным белком (GFP)) в одной и той же лунке. Подобно другим анализам цитотоксичности (например, йодиду пропидия или лактатдегидрогеназе), описанный здесь анализ основан на том факте, что гибель нейронов сопровождается разрывом клеточной мембраны. Это провоцирует высвобождение цитозольных белков путем диффузии и, как следствие, потерю флуоресценции GFP.

В качестве примера нейротоксичности представлена модель инсульта in vitro, а именно модель OGD. Этот протокол включает в себя воздействие на первичные нейроны солевого буфера, похожего на искусственную спинномозговую жидкость, но лишенного кислорода и глюкозы. Несмотря на то, что эта модель была представлена в качестве примера нейротоксического стресса, различные цитотоксические условия могут быть протестированы с помощью одного и того же рабочего процесса 8,9. Наконец, разреженная маркировка позволяет легко разработать автоматизированный анализ изображений. Здесь был разработан протокол, основанный на стандартной иммунофлуоресценции и анализе ImageJ в меньшей конфигурации. Затем этот рабочий процесс был адаптирован и масштабирован с помощью системы клеточной визуализации, которая позволяет автоматизировать анализ в режиме реального времени в режимах средней и высокой пропускной способности. В заключение следует отметить, что в данной статье представлена гибкая, доступная и масштабируемая методология изучения выживаемости нейронов в различных экспериментальных моделях токсичности с использованием визуализации в реальном времени и автоматизированной количественной оценки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры с использованием животных должны контролироваться комитетом по биоэтичным животным института и выполняться в соответствии с местными правилами. Процедуры, представленные в настоящем документе, были одобрены уполномоченным органом и соответствуют правилам Испании и Европы.

1. Первичная культура нейронов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы выполняются внутри капюшона для культивирования с использованием стерильных материалов и растворов для поддержания стерильных условий.

  1. Покрытие из поли-L-лизина (ФАПЧ)
    1. Промойте покровные стекла (CVs, 15 мм) в 70% этаноле в течение ночи (o/n) в орбитальном шейкере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость орбитального встряхивателя должна быть достаточной для плавного перемещения ШМ, но не слишком быстро, чтобы не повредить или не поцарапать ШМ. Конкретные обороты будут варьироваться в зависимости от модели шейкера. CV могут храниться в этаноле в течение длительного периода времени (месяцы).
    2. Удалите этанол и дважды промойте деионизированной водой в течение 10 минут каждый.
    3. Дайте CV высохнуть при комнатной температуре (RT) в чашке Петри диаметром 100 мм (примерно 13 CV на тарелку). Следите за тем, чтобы CV не касались друг друга или краев пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сухие резюме могут храниться в RT в течение длительного периода времени (месяцев).
    4. Приготовьте стоковый раствор ФАПЧ 5 мг/мл в воде, сделайте аликвоты и храните их при температуре -20 °C. Развести исходный раствор в 1x PBS до рабочей концентрации 0,1 мг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно испытывать более высокие концентрации до 1 мг/мл ФАПЧ.
    5. Добавьте минимальный объем ФАПЧ, чтобы покрыть поверхность ВЧ (см. оптимальные объемы ФАПЧ в таблице 1). Добавляйте раствор ФАПЧ по каплям, чтобы облегчить образование капли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для иммунофлюоресценции требуется нанесение нейронов на CV. Для покадровой визуализации (например, для IN Cell) клетки помещаются непосредственно над лункой без CV, поскольку CV могут перемещаться во время замедленной съемки. В этом случае добавьте минимальный объем ФАПЧ, чтобы покрыть поверхность каждой лунки.
ПоверхностьОбъем ФАПЧ (мл)
Покровные накладки 15 мм0.2
Покровные стекла 13 мм0.18
Планшет на 96 лунок0.07
24-луночный планшет0.3
6-луночная пластина2
Плита 60 мм4.5

Таблица 1: Оптимальные объемы поли-L-лизина в зависимости от площади поверхности.

  1. Инкубировать не менее 1 часа при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубационный период может длиться до о/н.
  2. Удалите ФАПЧ из CV. Дважды промойте CV деионизированной водой в течение 10 минут каждый. Дайте резюме высохнуть на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор ФАПЧ можно хранить при температуре 4 °C для повторного использования (максимум в 3 раза).
  3. Высушенные ЦВ хранить в чашке Петри при температуре 4 °С (до 7-10 суток) или поместить в лунки с металлической средой (см. состав в таблице 2 и рабочие объемы в таблице 3). Гальванический материал добавляйте непосредственно в лунки 12-луночных планшетов (табл. 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нейроны очень чувствительны к качеству фетальной бычьей сыворотки (FBS). Различные партии FBS должны быть протестированы, чтобы определить, в какой партии клетки выглядят более здоровыми. После того, как будет выявлена хорошая партия FBS, рекомендуется получить большое количество и хранить его при температуре -80 °C. Этот протокол может быть адаптирован для других типов CV и пластин (см. различные рабочие объемы в таблице 3).
Гальваническая среда
МЭМ42.5мл
10% лошадиная сыворотка или FBS*5мл
30% глюкозы (0,6% конечной концентрации)1мл
ФС (пенициллин, 10000 ЕД/мл; стрептомицин, 10 мг/мл);0.5мл
Электропораторная среда
Opti-MEM
Нейронная среда
Нейробазальная среда48.5мл
В-271мл
Глутамакс 200 мМ0.125мл
ФС (пенициллин, 10000 ЕД/мл; стрептомицин, 10 мг/мл);0.5мл
OGD Medium (Tasca, et al. 2014)
CaCl21миллиметр
KCl5миллиметр
NaCl137миллиметр
КХ2ГО40.4миллиметр
Na2HPO40.3миллиметр
MgCl20.5миллиметр
MgSO40.4миллиметр
ХЕПЕС25миллиметр
НаОГС34миллиметр

Таблица 2: Состав различных используемых сред.

Площадь поверхности скважин и планшетовРабочий объем
Планшет на 96 лунок0.32см 20.1мл
24-луночный планшет1.9см 20.5мл
12-луночная пластина3.8см 21мл
6-луночная пластина9.5см 22.5мл
Плита 60 мм21.5см 26мл

Таблица 3: Площадь поверхности различных типов пластин и рабочие объемы.

  1. Подготовка культуры нейронов
    1. Предварительно подогрейте (37 °C) и уравновесьте (в атмосфере 5%CO2 ) гальваническую среду, нейрональную среду и электропорационную среду (см. состав в таблице 2) в частично открытой бутылке внутри клеточного инкубатора в течение не менее 2 ч. Дайте трипсину нагреться на RT. Предварительно нагрейте 1x Сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS) при 37 °C на водяной бане.
    2. Задайте параметры электропорации (табл. 4).
УСЛОВИЯ ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ: Пористый импульс
ДлинаVИнтервалND. СтавкаПолярность
2 мс17550210плюс
УСЛОВИЯ ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ: Передаточный импульс
ДлинаVИнтервалND. СтавкаПолярность
502050540плюс/минус

Таблица 4: Настройки электропорации для NEPA21.

  1. Вскрытие мозга и забор CD-1 у мышей в E15 после полового акта
    1. Принесите в жертву беременную самку при вывихе шейки матки без седации. Простерилизовать живот 70% этанолом; Разрежьте и вскройте брюшную полость острыми ножницами.
    2. Извлеките матку и поместите ее в чашку Петри с холодным 1x HBSS. Оставьте его на льду внутри капюшона для клеточных культур с помощью общих щипцов.
    3. Извлеките эмбрион из матки с помощью щипцов и ножниц и обезглавьте его одним разрезом с помощью ножниц.
    4. Возьмитесь за голову и введите щипцы (например, тонкие щипцы Дюмона) в глазную орбиту.
    5. Используя иглу (шприц с иглой 30 г) в качестве лезвия, разрежьте брегму и прорежьте заднюю часть головки.
    6. Введите острые щипцы через разрез вертикально в брегму, и разорвите тонкий слой кожи передней области. Потяните за щипцы так, чтобы пройти по продольной трещине между двумя полушариями, не повреждая кору головного мозга.
    7. Используйте небольшие щипцы под углом 45°, от передней к задней части, чтобы удалить мозг из головы.
    8. Переместите мозг в чашку Петри диаметром 3,5 см с ледяным 1x HBSS под стереомикроскопом.
  2. Рассечение коры головного мозга
    Примечание: Протокол для посева нейронов адаптирован из процедуры, описанной Дотти и Банкером10.
    1. Используйте щипцы Дюмона (11 см), чтобы удерживать таламус, и иглу, наклоненную под углом 45°, чтобы отделить кору каждого полушария от среднего мозга. Следите за тем, чтобы на коре головного мозга не было следов других тканей; Используйте острые щипцы для удаления мозговых оболочек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мозговые оболочки образуют тонкую эластичную мембрану, обволакивающую мозг, и их легко узнать благодаря их красному цвету. Мягкие движения зигзагом помогут удалить мозговые оболочки. Убедитесь, что все мозговые оболочки были удалены, так как они токсичны для культуры.
    2. Переместите чистую кору головного мозга в чистую чашку Петри диаметром 3,5 см с ледяным 1x HBSS и положите ее на лед.
  3. Дезагрегация
    1. Разрежьте каждую кору на две половины и с помощью щипцов или острой иглы (30 G) облегчите действие трипсина на следующем этапе.
    2. Перенесите кусочки в 7 мл буфера трипсин-ЭДТА при комнатной температуре в пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки P1000 (отрежьте 3-4 мм наконечника). Подождите, пока они опустятся на дно наконечника, прежде чем выпускать их из наконечника пипетки. Перемешайте, наклоняя.
    3. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 12 минут на водяной бане. Перемешивайте, наклоняя каждые 4-5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может варьироваться от 12 до 15 минут.
    4. Дайте ткани погрузиться под действием силы тяжести и осторожно удалите трипсин. Дважды промойте салфетку 8 мл 1x HBSS и аккуратно перемешайте, наклоняя. Осторожно извлеките 1x HBSS с помощью пипетки P1000, но с помощью неразрезанного наконечника для дозатора.
    5. Промойте салфетку один раз 5 мл гальванической среды. Взбалтывайте наклоном. Осторожно удалите гальванический материал с помощью пипетки P1000.
    6. Добавьте 1,5 мл гальванической среды. Разберите смесь механическим способом с помощью пипетки P1000, отсасывая среду со дна пробирки и осторожно выпуская ее над стенками максимум 8-12 раз.
    7. Профильтруйте через стерильное клеточное ситечко (70 мкм), помещенное в пробирку объемом 50 мл. Добавьте в пробирку 10 мл или другой желаемый объем гальванической среды.
    8. Введите 5 μL клеточной суспензии в камеру для подсчета клеток, добавьте 5 μL трипанового синего (0,4% по объему) и подсчитайте клетки.
    9. Пластинчатую поверхность элементов (см. раздел 1.6) путем переноса достаточного объема клеточной суспензии для получения желаемого количества ячеек для электропорации (например, 10–6 клеток) в центрифужной пробирке объемом 15 мл. Центрифугируйте клетки при 250 × г в течение 5 минут. Перейдите к разделу 1.6.
  4. Гальванические ячейки
    1. В каждой лунке, содержащей гальваническую среду, необходимо определить требуемую плотность суспензии нецентрифугированных ячеек из стадии 1.5.7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе от 100 000 до 200 000 клеток/лунку были засеяны в 12-луночный планшет. В качестве ориентира укажите не менее 3 CV для каждого экспериментального условия, чтобы учесть экспериментальную изменчивость. Типичная экспериментальная установка может включать в себя визуализацию 4-5 полей на CV (например, при использовании 20-кратного объектива ожидается, что каждое поле будет иметь ширину ~1,3мм2 ).
    2. Перемещайте пластину в колпаке для клеточных культур по всем сторонам света, чтобы равномерно распределить клетки.
  5. Электропорация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать и другие системы трансфекции. Система NEPA21, используемая в этом протоколе, имеет преимущество в том, что она является «открытой системой». Протокол может быть изменен пользователем, и он не требует специальных реагентов для трансфекции специальных кювет, используемых для электропорации. Этот протокол был изменен от 5.
    1. Продолжите с шага 1.5.9. Ресуспендируйте клеточную таблетку 5 мл электропориционной среды в пробирке объемом 15 мл. Центрифугируйте пробирку при 250 × г в течение 5 минут.
    2. Повторите шаг 1.7.1. Суспендировать электропориционной средой до получения концентрации10-6 клеток/мл в каждой из электропорационных кювет. Смешайте клетки с нужным количеством ДНК в кювете.
      Примечание: Для экспрессии GFP использовалось 3 мкг плазмиды на миллион клеток. Из-за высокой вариабельности рекомендуется тестировать оптимальную концентрацию для каждой плазмиды. Было протестировано от 2 до 24 мкг плазмиды на миллион клеток. Различные плазмиды могут быть объединены в одной кювете для выполнения двойной трансфекции. В случае ко-трансфекции трансфектируйте интересующий ген в избытке по сравнению с GFP (например, 3:1 является оптимальным соотношением, которое следует проверить), чтобы убедиться, что большинство клеток, экспрессирующих GFP, совместно экспрессируют интересующий ген.
    3. Поместите кювету в камеру кюветы (рисунок 2). Нажмите кнопку «Пуск » для выполнения заданной программы (см. условия электропорации в таблице 4). Запишите значения токов и джоулей, отображаемые в рамке Измерения .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователь может изменить определенные условия. Например, снижение напряжения может снизить эффективность трансфекции, но увеличить выживаемость нейронов.
    4. Выньте кювету из камеры. Сразу после электропорации добавьте в кювету 500 мкл гальванической среды и перенесите образец из кюветы в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл с помощью пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чем быстрее вводится среда, тем лучше выживаемость после электропорации, так как она помогает избежать повреждения клеток.
    5. Запишите желаемое количество электропорированных ячеек в каждой лунке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Планшет от 20 000 до 100 000 ячеек в 12-луночном планшете. В зависимости от условий, только 5-10% электропорированных клеток могут выжить. Точное число должно быть проверено и адаптировано пользователем.
    6. Выдерживать в течение 2-4 ч в стандартных условиях (37 °C, 5%CO2, насыщенная влажность).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубационного периода понаблюдайте за клетками под микроскопом. Если культура здорова, большинство клеток прилипли бы к поверхности и начали бы прорастать видимыми нейритными отростками.
    7. Смените среду покрытия на нейронную среду (объемы и состав в таблице 1 и таблице 2 соответственно).
  6. Поддержание клеток
    1. Чтобы освежить среду, удалите половину среды и добавьте такой же объем свежей предварительно уравновешенной среды после 7 дней культивирования.
    2. На 10-й день посева замените половину объема свежей нейронной средой без добавки глютамина (см. Таблицу материалов). Повторяйте этот шаг через день после 10 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После 10 дней культивирования клетки вырабатывают глутамат самостоятельно.

2. Строительство гипоксической камеры

  1. Для этой цели используйте любой герметичный контейнер с завинчивающейся крышкой или эквивалентную систему уплотнения (рисунок 3A). Просверлите два отверстия в стенке пластикового контейнера и введите в каждое по пластиковой трубке. Запечатайте их силиконом так, чтобы емкость была герметично закрыта (рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для изготовления камеры использовался цилиндрический пластиковый контейнер (размер 1 литр) с завинчивающейся крышкой. Убедитесь, что контейнер достаточно велик для размещения резюме, необходимых для эксперимента. Чтобы обработать большее количество CV в одном и том же пространстве, пластиковые платформы можно уложить друг на друга (рисунок 3A).
  2. Чтобы подготовить камеру барботирования (см. 3.2), просверлите отверстие в крышке колбы, используя любую стандартную механическую дрель со сверлом чуть меньше трубки, и введите пластиковую трубку через отверстие в колбу. Заклейте отверстие парапленкой, чтобы сохранить герметичность (Рисунок 3B).
  3. Перед использованием контейнер и колбу простерилизовать 70% этанолом и облучать ультрафиолетовым светом в течение одного цикла.

3. Кислородно-глюкозное голодание (ОГД)

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол для OGD адаптирован из Tasca et al.7

  1. Приготовьте раствор ОГД с раствором фосфата (табл. 2), который ранее был дополнен антибиотиками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой пластины диаметром 35 мм используйте 5 мл; для пластины 100 мм используйте 10 мл.
  2. Добавьте раствор OGD внутрь барботажной камеры (рис. 3B) и поместите его в водяную баню (уже предварительно нагретую до 37 °C). Соедините колбу с источником азота (N2, 100%).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что, поскольку раствор OGD содержит HEPES в качестве буфера, он не требуетCO2. Если раствор OGD основан на бикарбонатной буферной системе, используйте 5%CO2 и 95%N2 для насыщения гипоксического раствора и камеры.
  3. Насытьте раствор ОГД мягко барботирующим азотом. Оставьте раствор в слегка пузырчатом состоянии на 20-30 минут.
  4. Немедленно перенесите колбу в колбу для клеточных культур и добавьте 5 мл раствора OGD без кислорода в 35 мм планшетах или 10 мл в 100 мм культуральных планшетах.
  5. Переместите БВ с культивируемыми клетками в планшеты с ОГД. Не накрывая пластины, переместите их в камеру гипоксии и плотно, но осторожно закройте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.4 и 3.5 должны быть выполнены как можно быстрее. Поддерживайте контроль CVs (Neuronal Medium in normoxia) в луночных планшетах внутри инкубатора. В качестве альтернативы можно подвергнуть контрольные нейроны воздействию нормоксической среды OGD с добавлением глюкозы (10 мМ) для более избирательного изучения эффектов гипоксии и депривации глюкозы.
  6. Подключите азотную систему к камере гипоксии и проверьте, что трубки открыты. Насытите камеру N2 в течение нескольких минут под давлением 2-3 бар (например, 2-3 мин; 1 бар = 750 мм рт.ст.) (рис. 3C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте снова запустить пузырьковый раствор OGD в течение 15 минут между несколькими временными точками.
  7. Уменьшите давление азота до 1,3-1,5 бар и закройте обе трубки камеры гипоксии (рисунок 3В). Оставьте камеру в инкубаторе на необходимое время (например, 60 мин) при температуре 37 °C, 5%CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность OGD может потребовать корректировки в зависимости от условий эксперимента и целей исследования. Короткое время инкубации (например, 30 минут) будет имитировать легкую гипоксию. Два часа ОГД обычно очень суровы по отношению к нейронам. Перед началом исследования рекомендуется провести тест продолжительностью OGD от 45 до 90 минут. Конечно, продолжительность ОГД будет влиять на общую выживаемость и относительное наступление гибели нейронов после выздоровления от ОГД. Если цель состоит в том, чтобы проанализировать гибель нейронов в режиме реального времени, стремитесь достичь условий OGD, которые спровоцируют гибель клеток через несколько часов после восстановления после OGD для более эффективного анализа.
  8. Откройте камеру и переместите CV на исходную многолуночную пластину для восстановления. После этого шага рассмотрите две альтернативы: 1) для небольших экспериментов перейдите к разделу 4 для иммунофлуоресценции и анализа изображений; 2) Для скрининга с высоким содержанием перейдите к разделу 5 для анализа в анализаторе клеток (или эквивалентной платформе).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация в реальном времени обеспечивает более гибкий подход, поскольку позволяет контролировать различные экспериментальные точки в режиме реального времени.

4. Анализ с помощью стандартной иммунофлюоресценции и ImageJ

ПРИМЕЧАНИЕ: Время восстановления может варьироваться от 1 до 24 часов в зависимости от условий.

  1. Промойте нейроны 1x PBS в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным, так как существует несколько способов продолжения и анализа изображений.
  2. Зафиксируйте нейроны с помощью 4% параформальдегида на 10 минут в RT. Промойте их три раза 1x PBS в течение 10 минут каждое мытье.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку параформальдегид токсичен, работайте под химическим колпаком.
  3. Проникните нейроны, добавив 1x PBS, содержащий 0,1% Triton X-100, в течение 10 минут. Быстро промойте клетки с помощью 1x PBS. Повторите этап стирки дважды по 10 минут при каждой стирке.
  4. Добавьте 350 μл блокирующего раствора (1x PBS, содержащий 2% бычьего сывороточного альбумина) в CV и оставьте их не менее чем на 30 минут. Раскрутите запас первичных антител (АБ) (5 × г в течение 30 с) и смешайте его с блокирующим раствором в требуемом разведении, например, анти-GFP в 1:600.
    1. Перенесите покровные стекла на парапленку во увлажненную камеру (коробку с пропитанной водой тканью для поддержания влажности и предотвращения испарения). В зависимости от размера CV осторожно добавьте 60 или 80 μL первичного разведения антитела в каждую CV и убедитесь, что клетки находятся в контакте с антителом. Инкубируйте CVs o/n при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На поверхности CV должна образоваться капля, чтобы покрыть всю поверхность CV. Избегайте нарушения работы клеток во время пипетирования раствора антитела на СС. Время инкубации может быть сокращено до 2 ч при ЛТ.
  5. Промойте CV 1x PBS в течение 10 минут над парапленкой. Повторите этап стирки дважды.
  6. Разведите вторичный AB, например, Alexa 488 (1:500), и 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI, 1:2000) в блокирующем растворе. В зависимости от размера CV добавьте на клетки каплю объемом 60-80 μL вторичного раствора AB. Инкубируйте CV в течение 1 часа в темноте в RT. Промойте вторичные AB и DAPI из нейронов с помощью 1x PBS в течение 10 минут и повторите этот шаг дважды.
  7. Установите CV в монтажную среду (см. Таблицу материалов) для иммунофлуоресцентного анализа и храните их в темноте при температуре 4 °C после высыхания.
  8. Захват и анализ изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения изображений с 20-кратным увеличением использовался инвертированный микроскоп (Рисунок 4А, см. Таблицу материалов).
    1. Используйте программное обеспечение ImageJ с открытым исходным кодом для анализа изображений и получения маски для канала GFP (Рисунок 4C).
      Примечание: Существует несколько способов визуализации и анализа нейронов, в зависимости от доступности оборудования и формата эксперимента. В качестве базового примера приведен следующий рабочий процесс, целью которого является идентификация сомы отдельных GFP-экспрессирующих нейронов, присутствующих на изображении. Представленные здесь конкретные значения, такие как пороговое значение и размер частиц, должны быть проверены пользователем на основе конкретных условий эксперимента. Кроме того, могут быть добавлены различные фильтры и этапы обработки. Например, фильтры ImageJ « Вычесть фон » и «Удалить пятна » часто помогают в очистке изображения в начале обработки. Оптимизация рабочего процесса для конкретных экспериментальных условий требует предварительного опыта в анализе изображений и знания основных концепций количественного анализа изображений. Поскольку подробное руководство по анализу изображений выходит за рамки текущего протокола, мы рекомендуем использовать следующие ресурсы: Руководство пользователя ImageJ, https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/; примеры и учебные пособия, https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.htm; Комплект MBF ImageJ, https://imagej.net/mbf/index.htm.
    2. Для сегментации выберите сегментацию Интенсивность с необходимыми параметрами для выделения сомы, которая является самой яркой областью нейронов.: Меню | Изображение | Настройка | Порог | Установите минимальное пороговое значение (например, 100) | нажмите « Применить».
    3. Повторите порог из 4.8.2. на всех изображениях, чтобы увидеть маску (т.е. сегментированное изображение) для сом нейронов (рисунок 4E).
    4. Чтобы получить количество сохранившихся ячеек на каждом изображении и экспортировать результаты в электронную таблицу для выполнения вычислений, выберите Меню | Анализ | Проанализируйте частицы и введите необходимые значения параметров (например, Размер: 50-бесконечность пикселя; Круговость: 0,5-1,00). Рассмотрим, что при t = 0 h количество подсчитанных клеток является общим числом идентифицированных клеток, и вычислим процент клеток, которые выжили в разные моменты времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более низкий порог размера полезен для фильтрации более мелких объектов, чем сома (например, 60-80мкм2).
    5. Используйте функцию Record Macro в ImageJ для автоматизации и повторения анализа: Меню | Плагины | Макросы | Запись | нажмите кнопку Создать , чтобы сгенерировать макрос.

5. Анализ в режиме реального времени с помощью IN Cell Analyzer 2200

  1. Вставьте 12-луночный планшет в анализатор клеток, подключите систему CO2 и установите температуру на уровне 37 °C.
    Примечание: Этот шаг может быть легко масштабирован на этой платформе, выполнив аналогичный эксперимент на нейронах, размещенных в пластине с 96 лунками.
  2. Выберите объектив 20x, случайным образом выберите 5 полей для каждой лунки (охватывающие 2,33% лунки в этом примере) и автоматически сфокусируйте их для каждого флуоресцентного канала (в данном случае изотиоцианата флуоресцеина [FITC]). Выберите параметры съемки (30 мин таймлапс за 16 часов). Нажмите «Пуск» и подождите.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество полей визуализации должно быть определено исследователем и должно быть достаточным для учета вариабельности внутри одной скважины.
  3. Используйте IN Cell Developertoolbox v1.9 для настройки соответствующего рабочего процесса для анализа.
  4. Проанализируйте изображения нейронов (канал FITC) для создания маски для сомы нейронов (рис. 4).
    Примечание: Цель состоит в том, чтобы идентифицировать сому отдельных нейронов, присутствующих на изображении. Этот анализ состоит из шагов, эквивалентных описанным в разделе 4 для ImageJ. Пожалуйста, обратитесь к разделу 4 для ознакомления с рабочим процессом и общими соображениями. Порог интенсивности определяется для выбора сомы, которая является самой яркой областью нейронов.
    1. Для сегментации выберите сегментацию Интенсивность с необходимыми параметрами (в данном случае минимальным порогом 20005.40).
    2. Для постобработки выберите опцию Сито , сохраняя мишени с областью больше заданного значения (здесь 189 пикселей (~80 мкм2)).
    3. Выберите параметр Сумма , чтобы подсчитать и суммировать все нейроны, идентифицированные в маске (выжившие нейроны) для каждого поля и для всех полей скважины в каждой временной точке временного хода.
    4. Экспортируйте результаты в таблицу. При t = 0 h учтите, что количество подсчитанных клеток является общим количеством идентифицированных клеток, и вычислите процент клеток, которые выжили в разные моменты времени. Рассчитайте время, в которое 50% клеток становятся мертвыми, чтобы облегчить сравнение условий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры этапов сегментации и постобработки должны быть настроены пользователем для различных флуоресцентных каналов в зависимости от идентифицируемых структур.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол направлен на создание модели инсульта in vitro. Важно получить адекватную плотность нейронов, что позволит распознавать отдельные электропорированные нейроны и анализировать их по отдельности. Стадия культуры нейронов после нанесения пластин также имеет решающее значение. Созревание нейронов в культуре происходит прогрессивно. Зависимость от факторов роста, роста нейритов, связности и электрофизиологической активности будет сильно варьироваться в зависимости от стадии. В этих специфических условиях...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол показывает эффективный способ моделирования инсульта in vitro. Для достижения поставленной цели мы предложили разреженную маркировку нейронов коры головного мозга с помощью системы электропорации NEPA215. Это открытая система, которая позволяет настраивать протокол с минимальными эксплуатационными затратами по сравнению с другими системами, в которых используются комплекты или специальные устройства. Смешанная культура наивных и электропорир...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Карлоса Дотти за то, что он поделился своим опытом в области нейронной культуры. Мы также благодарим Алисию Мартинес-Ромеро из Центра цитоматических исследований Центра исследований принципов Фелипе (CIPF), которая поддерживается европейским финансированием FEDERER. Проект поддерживается Министерством экономики и конкурентоспособности Испании (SAF2017-89020-R) реагентами, материалами и заработной платой YDC и PF. PF также поддерживается грантом RyC-2014-16410. CGN и PF поддерживаются Conselleria de Sanitat Женералитата Валенсии, а также AGM (ACIF/2019/015). Анхела Родригес Прието получила грант от Министерства науки, инноваций и университетов Испании от PRE2018-083562.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10 см чашки ПетриFISHER SCIENTIFIC, S.L.1130-9283
3,5 см чашки ПетриСтерилин
75 см<суп>2 колбаCorning430641U
B-27Life Technologies17504-044
Планшеты для клеточных культурCorning incorporation Costar®3513
Клеточный инкубаторThermo Electron CorporationМодель 371
Клеточный фильтр 70 & микро; mFalcon352350
Cold lightsSchott223488KL 1500
LCD Cover Slips (15 мм)Marienfeld111530
CU500 Кюветная камераNepa Gene
CU600 Cuvette Подставка держательnepa Gene
DAPISigma-Aldrich Quimica, S. L.D9542-10MG1:2000
DMSOPanreacA3672
Тонкие щипцы DumontFST11254-20
Тонкие щипцы DumontFST11252-00
EC-002S NEPA Электропорационные кюветы, зазор 2 мм ФильтрNepa Фильтр
Фильтр Falcon352350
Тонкие ножницы-острые-тупыеFST14028-10
Тонкие ножницы-ToughCut rFST14058-09
GFP курица IgYAves LabsGFP-10101:600
ГлюкозаSigma68769-100мл
GlutaMAX-I Добавка 200 мМ 100 млFisher Scientific35050-061
HBSSThermofisher14175-095https://www.thermofisher.com/es/es/home/technical-resources/media-formulation.156.html
Hepes 1 MThermoFisher15630-080
Сыворотка для лошадейInvitrogen26050088
MEMThermofisher11095080https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11095080#/11095080
предметное стекло для микроскопа (полилизин)VWR631-0107Размеры: 25 x 75 x 1 мм
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich Quimica, S. L.81381-250G
Иглы желтые, 30 калибрBD Microlance™ 3304000
NEPA21 электропораторNepa Gene
Neubauer chamberBlau Brand717805
Neurobasal MediumThermoFisher21103-49
Opti-MEMInvitrogen31985-062
ParafilmCole-ParmerPM996
Параформальдегид (PFA), 95%Sigma-Aldrich Quimica, S. L.158127-500GИспользуйте раствор: 4%
PEIPolysciences23966-1
Плазмида для GFPpCMV-GFP-ires-Cre, описанная в Fazzari et al., Nature, 2010
Poly-L-LysineSIGMAP2636
PS ( Пенициллин, Стрептомицин)ThermoFisher15140122
Зубчатые щипцыFST11152-10
СтереомикроскопWORLD PRECISION INSTRUMENTS
ШприцыBD Plastipak 1мл303176
Triton X-100Sigma-Aldrich Quimica, S. L.Номер MDL: MFCD00128254Неионогенный
трипсин-ЭДТАThermoFisher25300054
Пробирки 15 млFisher05-539-4
Пробирки 50 млVWR21008-242
Tupperware--Герметичная посуда с завинчивающейся крышкой. SP Berner - Taper 1 л Redondo con Rosca. Любую аналогичную герметичную посуду Tupperware можно приобрести в любом супермаркете.
Водяная баняSHELDON LABORATORY МОДЕЛЬ 12241641951

Ссылки

  1. Salazar, I. L., Mele, M., Caldeira, M., Costa, R. O., Correia, B., Frisari, S., Duarte, C. B. Preparation of primary cultures of embryonic rat hippocampal and cerebrocortical neurons. Bio-protocol. 7 (18), 2551(2017).
  2. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  3. Fazzari, P., et al. Cell autonomous regulation of hippocampal circuitry via Aph1b-γ-secretase/neuregulin 1 signalling. eLife. 3, 02196(2014).
  4. Navarro-González, C., Huerga-Gómez, A., Fazzari, P. Nrg1 intracellular signaling is neuroprotective upon stroke. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 3930186(2019).
  5. NEPA21 transfection of cell suspensions using cuvettes. NEPAGENE Co. Ldt. , Available from: http://2017.igem.org/wiki/images/3/3a/T--TECHNION-ISRAEL--Electroporation-NEPA2_for_HPC-7.pdf (2017).
  6. Larson, M. A., Gibson, K. A., Vivian, J. L. In vivo validation of CRISPR reagents in preimplantation mouse embryos. Methods in Molecular Biology. 2066, 47-57 (2020).
  7. Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods in Molecular Biology. 1254, 197-210 (2015).
  8. Holloway, P. M., Gavins, F. N. E. Modeling ischemic stroke in vitro: the status quo and future perspectives. Physiology and Behavior. 47 (2), 561-569 (2016).
  9. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
  10. Dotti, C. G., Banker, G. A. Experimentally induced alteration in the polarity of developing neurons. Nature. 330 (6145), 254-256 (1987).
  11. Fazzari, P., et al. Control of cortical GABA circuitry development by Nrg1 and ErbB4 signalling. Nature. 464 (7293), 1376-1380 (2010).
  12. Sadiq, A. A., et al. An overview: Investigation of electroporation and sonoporation techniques. 2015 2nd International Conference on Biomedical Engineering. , 1-6 (2015).
  13. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), 3044(2018).
  14. Fazzari, P., Mortimer, N., Yabut, O., Vogt, D., Pla, R. Cortical distribution of GABAergic interneurons is determined by migration time and brain size. Development. 147 (14), 185033(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.