Оптимизация установки и условий для электроретинограммы Ex Vivo для изучения функции сетчатки в маленьких и больших глазах

Краткое содержание

Модификация существующего многоэлектродного массива или патч-зажимного оборудования делает электроретинограмму ex vivo более доступной. Улучшенные методы регистрации и поддержания световых реакций ex vivo облегчают изучение функции фоторецепторов и ON-биполярных клеток в здоровой сетчатке, животных моделей глазных заболеваний и донорской сетчатки человека.

Аннотация

Измерения световых реакций нейронов сетчатки имеют решающее значение для исследования физиологии здоровой сетчатки, определения патологических изменений при заболеваниях сетчатки и тестирования терапевтических вмешательств. Электроретинограмма ex vivo (ERG) позволяет количественно оценить вклад отдельных типов клеток в изолированной сетчатке путем добавления специфических фармакологических агентов и оценки тканевых изменений независимо от системных воздействий. Световые реакции сетчатки могут быть измерены с помощью специализированного держателя образца ex vivo ERG и записывающей установки, модифицированной из существующего зажима патча или микроэлектродного массива. В частности, изучение ON-биполярных клеток, а также фоторецепторов было затруднено медленным, но прогрессирующим снижением световых реакций в EX VIVO ERG с течением времени. Повышенная скорость перфузии и регулировка температуры перфузата улучшают функцию сетчатки ex vivo и максимизируют амплитуду и стабильность отклика. Ex vivo ERG уникально позволяет изучать отдельные типы нейрональных клеток сетчатки. Кроме того, улучшения для максимизации амплитуд отклика и стабильности позволяют исследовать световые реакции в образцах сетчатки от крупных животных, а также в глазах доноров человека, что делает ex vivo ERG ценным дополнением к репертуару методов, используемых для исследования функции сетчатки.

Введение

Электроретинография измеряет функцию сетчатки в ответ на свет¹. Это неотъемлемая часть изучения физиологии и патофизиологии сетчатки, а также измерения успеха терапии заболеваний сетчатки. In vivo ERG широко используется для оценки функции сетчатки у интактных организмов, но имеет значительные ограничения ^2,3. Среди них количественный анализ отдельных типов клеток сетчатки в IN VIVO ERG затруднен, поскольку он регистрирует сумму потенциальных изменений и, следовательно, наложение ответов от всех клеток сетчатки к световым стимулам⁴. Кроме того, ....

Протокол

Все эксперименты с использованием мышей проводились в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Институциональным комитетом по изучению животных в Университете штата Юта. Глаза свиней для демонстрации этого видео были получены посмертно со скотобойни (Sustainable Swine Resources, Johnsonville). Глаза были получены от человеческих доноров после смерти мозга или сердца с согласия на исследовательское использование через Utah Lions Eye Bank, San Diego Eye Bank или Lifesharing, которые полностью аккредитованы FDA, Ассоциацией организаций по закупке органов (AOPO) и Ассоциацией глазных банков Америки. Использование челов....

Результаты

Ex vivo ERG позволяет регистрировать воспроизводимые и стабильные световые реакции фоторецепторов и ON-биполярных клеток, например, от сетчатки мыши (рисунок 2A-C). Регистрация реакций фоторецепторов от донорской сетчатки человека возможна при посмертной задержке энуклеации до 5 ч (рисунок 2D) и реакций ON-биполярных клеток с задержкой энуклеации <20 мин (рисунок 2E). Важные параметры дл.......

Обсуждение

Первоначально разработанный в 1865 году Холмгреном для измерения световых реакций сетчатки от амфибии^{сетчатки 10}, технические ограничения первоначально препятствовали широкому использованию ERG. Тем не менее, основополагающие исследования Рагнара Гранита и других выявили клеточное происхождение ЭРГ и измерили фоторецепторные и ON-биполярные клеточные реакции ex vivo 11,12,13. С тех пор усовершенс.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Раструб 2 мм	WPI	2026-10	материалы для приготовления электрода
Ag/AgCl Электрод	World Precision Instruments	EP1	материалы для приготовления электрода
Среда Эймса	Sigma Aldrich	A1420	перфузионная среда
хлорид бария	Sigma Aldrich	B0750	блокатор калиевых каналов
DL-AP4	Tocris	0101	Глутаматергический антагонист широкого спектра действия
OcuScience Ex Vivo ERG Адаптер	OcuScience	н/д	ex vivo ERG держатель образца
Резьбовой люэровский соединитель	McMaster-Carr	51525K222 или 51525K223	материалы для подготовки электрода