Методическая статья

Автоматизированное, высокопроизводительное обнаружение бактериальной приверженности клеткам-хозяевам

DOI:

10.3791/62764

⸱

17 сентября 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обнаружение взаимодействий патогенов-хозяев и бактерий на основе фенотипической приверженности с использованием высокопроизводительной флуоресцентной маркировки изображений наряду с автоматизированными методами статистического анализа позволяет быстро оценить потенциальные бактериальные взаимодействия с клетками-хозяевами.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Идентификация новых бактериальных патогенов имеет решающее значение для здоровья и безопасности человека. Бактериальная приверженность клеткам-хозяевам является важным шагом при бактериальных инфекциях и представляет собой признак потенциальной угрозы. Поэтому изучение приверженности бактерий к клеткам-хозяевам может быть использовано в качестве компонента оценки бактериальной угрозы. Стандартный метод перечисления бактериальной приверженности клеткам-хозяевам заключается в совместной инкубации бактерий с клетками-хозяевами, сборе адгезивных бактерий, нанесении собранных клеток на твердые среды, а затем подсчете результирующих колониеобразующих единиц (КОЕ). Альтернативно, бактериальная приверженность к клеткам-хозяевам может быть оценена с использованием подходов, основанных на иммунофлуоресцентной микроскопии. Однако традиционные стратегии реализации этих подходов отнимают много времени и неэффективны. Здесь описан недавно разработанный автоматизированный метод визуализации на основе флуоресцентной микроскопии. В сочетании с высокопроизводительной обработкой изображений и статистическим анализом метод позволяет быстро количественно оценить бактерии, которые прилипают к клеткам-хозяевам. Два вида бактерий, Gram-отрицательный Pseudomonas aeruginosa и Gram-positive Listeria monocytogenes и соответствующие отрицательные контрольные группы, были протестированы для демонстрации протокола. Результаты показывают, что этот подход быстро и точно перечисляет адгезивные бактерии и значительно снижает экспериментальные нагрузки и сроки.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактериальная адгезия - это процесс, посредством которого бактерии прикрепляются к другим клеткам или поверхностям. Успешное установление инфекции бактериальными возбудителями требует адгезии к клеткам-хозяевам, колонизации тканей, а в некоторых случаях и инвазии клеток-хозяев1,2,3. Возникающие инфекционные заболевания представляют собой серьезную угрозу общественному здравоохранению, о чем свидетельствует недавняя пандемияCOVID-19 4,5,6. Важно отметить, что новые или возникающие патогены не могут быть легко распознаны с использованием геномных подходов, особенно в тех случаях, когда патоген был спроектирован так, чтобы избежать обнаружения или не содержит геномных сигнатур, которые идентифицируют его как патогенный. Поэтому идентификация потенциальных патогенов с использованием методов, которые непосредственно оценивают признаки патогенности, такие как бактериальная приверженность клеткам-хозяевам, может играть решающую роль в идентификации патогенов.

Бактериальная адгезия к клеткам-хозяевам использовалась для оценки механизмов бактериального патогенеза на протяжениидесятилетий 1,7. Микроскопическая визуализация8,9 и перечисление бактериальной колониеобразующей единицы (КОЕ)10,11,12,13 путем постинфекционного покрытия являются двумя хорошо разработанными лабораторными методами тестирования микробной адгезии и/или инфицирования клеток-хозяев14. Учитывая размер бактериальных клеток в микрометровом масштабе, перечисление адгезивных бактериальных клеток обычно требует использования передовых методов микроскопии с высоким увеличением, а также подходов к визуализации с высоким разрешением, включая электронную микроскопию, расширительную микроскопию (ExM)15,16и трехмерную визуализацию17 . Альтернативно, перечисление бактерий, связанных или интернализованных внутри клеток-хозяев, может быть выполнено путем покрытия серии разбавления собранных бактерий на твердом агаре и подсчета результирующих КОЕ10,12,13. Этот метод трудоемкий и включает в себя множество ручных шагов, что создает трудности в создании стандартизированной или автоматизированной процедуры, необходимой для высокопроизводительных анализов18,19. Таким образом, разработка новых методов оценки прикрепления клеток-хозяев позволит устранить текущие ограничения в этой области.

Здесь описан один из таких методов, который использует автоматизированную высокопроизводительную микроскопию в сочетании с высокопроизводительной обработкой изображений и статистическим анализом. Чтобы продемонстрировать подход, были проведены эксперименты с несколькими бактериальными патогенами, в том числе Pseudomonas aeruginosa,оппортунистическим грамотрицательным бактериальным патогеном человека, животных и растений14,20,который часто обнаруживается для колонизации дыхательных путей пациентов с нарушенными защитными функциями хозяина. Этот подход оптимизировал процесс микроскопической визуализации, описанный в предыдущих исследованиях14,20. Обнаружение изображений было упрощено флуоресцентно-мечеными клетками-хозяевами и бактериями для быстрого отслеживания их близости, что значительно снизило рабочую нагрузку микроскопии для получения изображений с высоким разрешением для различения бактерий. Кроме того, автоматизированный статистический анализ изображений при подсчете клеток-хозяев и бактерий заменил ручной эксперимент по бактериальному покрытию КОЕ для оценки соотношения количества адгезивных бактерий на клетку-хозяина. Чтобы подтвердить совместимость этого метода, также были протестированы множественные бактериальные штаммы и типы клеток-хозяев, такие как Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus и Klebsiella pneumoniae, а также эндотелиальные клетки пупочных вен человека (HUVECs), и результаты подтверждают разнообразие и эффективность метода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культура клеток A549

  1. Поддерживать клеточную линию A549 в среде F-12K, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и инкубировать при 37 °C, 5% CO2.
  2. Менять среду каждые 3-4 дня и проходить при 85%-95% слиянии.
  3. Вкратце промыть клетки 1 х фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS, рН 7,4, если не указано иное) и обработать 1 мл 0,25% трипсина-0,53 мМ раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (погружая клеточный слой) в течение примерно 2 мин при 37 °C.
  4. Добавьте дополнительно 6 мл полной питательной среды (среда F-12K + 10% FBS), чтобы остановить активность протеазы. Затем обложите клетки стерильным полистиролом Т-75 тканевой культуральной колбой с соотношением субкультивации 1:3-1:8. Конечный объем культуры составляет 12 мл.
  5. Посейте приблизительно 1 х10 4 ячейки A549 (концентрация клеток: ~1х 10 5 клеток /мл) на каждую лунку 96-луночной пластины за день до анализа адгезии.

2. Рост и окрашивание бактерий

  1. Выполняйте всю бактериальную работу в кабинете биобезопасности, лаборатории уровня биобезопасности 2.
  2. Инокулируют все бактериальные культуры, включая P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes и B. subtilis и т. д., из замороженного глицеринового бульона и выращивают их в триптическом соевом бульоне (TSB, 3 мл) в встряхивающем инкубаторе при 37 °C в течение ночи, поддерживаемом при 250 оборотах в минуту.
  3. На следующий день используйте разбавление 1:100 ночной культуры для прививки субкультуры и выращивайте их в TSB (1 мл) в течение 3 ч до экспоненциальной фазы, измерьте OD при 600 нм (OD600)для подтверждения. Убедитесь, что OD600 находится в диапазоне 0,4-0,6.
  4. Перед выполнением анализа приверженности бактерий-хозяев пластинчатых последовательных разведений бактериальной суспензии на пластинах TSB-агара, инкубируют их в течение ночи при 37 °C, а затем устанавливают бактериальные КОЕ из числа колоний. Для P. aeruginosaOD600 1,0 соответствует 2 x 108 жизнеспособным бактериальным клеткам/ мл, а для L. monocytogenesOD600 1,0 соответствует 9 x 108 жизнеспособным бактериальным клеткам / мл.
  5. Соберите бактериальные культуры в экспоненциальной фазе путем центрифугирования при 13 000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре (RT), затем промыть их один раз, используя 1x PBS (1 мл). Повторно суспендируют бактериальные гранулы в 1 мл 1x PBS и определяют концентрации путем измерения OD600 бактериальных суспензий. Например, P. aeruginosa с OD600 0,5 представляет собой концентрацию 1 х 108 бактериальных клеток/мл.
  6. Окрашивайте бактериальную суспензию зеленым или красным флуоресцентным красителем при RT в течение 30 мин с мягким вращением в темноте. Для этого добавьте 2 мкл 500-кратного концентрированного красителя для окрашивания в 1 мл бактериальной суспензии, чтобы разбавить краситель в 1 раз. Чтобы смыть окрашивающий краситель, центрифугируйте окрашенные бактерии на 13 000 х г в течение 2 минут и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл 1x PBS в течение трех раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если в эксперименте используются флуоресцентные (GFP-, RFP-, mCherry- и т.д.) помеченные бактерии, то пропустите этот этап бактериального окрашивания. В этом протоколе использовались GFP-метки P. aeruginosa и окрашенные красным флуоресцентным красителем L. monocytogenes.
  7. Соберите окрашенные бактериальные клетки или помеченные GFP бактерии центрифугированием при 13 000 х г в течение 2 мин. Повторно суспендировать в свежей среде F-12K (1 мл) и измерить OD600 каждой культуры. Впоследствии разбавляют культуры до желаемых концентраций на основе кратности инфекции (MOI) и концентрации клеток хозяина. Конечный объем, используемый в этом эксперименте, составляет 500 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если концентрация клеток-хозяев, подсчитанная с помощью окрашивания Trypan Blue, составляет 1х 10 5 клеток / мл, желаемая концентрация бактериальных клеток при MOI 100 будет составлять 1 х 107 клеток / мл. Концентрация P. aeruginosa при 0,5 OD600 составляет 1 х 108/мл. Для получения нужной концентрации разводят культуру P. aeruginosa в 10 раз, добавляют 50 мкл повторно суспендированной культуры к 450 мкл свежей среды F-12K.

3. Бактериальная адгезия и окрашивание клеток-хозяев

  1. Сначала промыть посеянные монослои ячейки A549 три раза теплым 1x PBS. Для каждой промывки добавьте 100 мкл 1x PBS в каждую лунку, аккуратно пипетку вверх и вниз три раза, утилизируйте 1x PBS или подождите 10 с после добавления, а затем пылесосите, чтобы удалить 1x PBS. Чтобы определить кинетику бактериальной ассоциации, наложите на клетки 100 мкл желаемых концентраций бактериальной суспензии с различными MOI (0, 1, 10 и 100). Раскрутите бактерии при 200 х г в течение 10 мин и инкубируйте инфицированные клетки A549 при 37 °C, 5% CO2 в течение дополнительного 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте каждое условие имело техническую тройку.
  2. Удалите несвязанные бактерии, промыв монослои пять раз теплым 1x PBS, как описано выше. Добавьте 100 мкл 4% формальдегида (в 1x PBS) в каждую лунку 96-луночных пластин, чтобы зафиксировать ячейки. Дайте пластинам постоять на льду в течение 15 минут, а затем смойте раствор для фиксации, используя 1x PBS три раза.
  3. Чтобы окрасить ядра, добавляют 50 нг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) и инкубируют его в течение 10 мин при RT. После инкубации промыть колодцы три раза, используя 1x PBS. Покройте инфицированные клетки A549 100 мкл 1x PBS, чтобы избежать высыхания. Обработайте для следующего этапа или храните пластину при 4 °C до 2 дней в темноте.

4. Автоматизированная флуоресцентная визуализация, обработка и анализ

  1. Чтобы сохранить целостность данных, случайным образом и вручную выберите пять мест каждой скважины для захвата изображений с 20-кратным увеличением. Захват флуоресцентных изображений клеток и бактерий A549 по каналам DAPI и GFP соответственно. Используйте канал PE-Cy5 для бактерий, окрашенных красным флуоресцентным красителем.
  2. Чтобы иметь лучшее разрешение, обработайте все изображения для сведения и деконволюции фона. Установите параметры диаметра 68 мкм катящегося шара для сглаживания и автоматического измерения функции точечного спреда (PSF) деконволюции изображения на основе объектива.
  3. Чтобы подсчитать все квалифицированные клетки и бактерии, измерьте интенсивность флуоресценции клеток-хозяев и бактерий и установите самую слабую интенсивность флуоресценции клеток-хозяев и бактерий в качестве пороговых значений для количества клеток. Подсчитайте все бактерии, находящиеся рядом с клеткой-хозяином на расстоянии 15 мкм, поскольку адгезивные бактерии, поскольку диаметр ячейки A549 составляет 10,59-14,93 мкм21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка по умолчанию в системе визуализации выборочно подсчитывает клетки-хозяева диаметром от 5 до 100 мкм и бактерии размером от 0,2-5 мкм (ширина и длина).
  4. Основываясь на вышеупомянутых результатах ручной обработки изображений, примените параметры сглаживания изображения, деконволюции, размеров объектов, расстояния и интенсивности флуоресценции к остальным автоматизированным изображениям. После автоматизированного анализа рассмотрите критические показания, такие как общее количество клеток-хозяев, размеры и формы клеток, общее количество бактерий и среднее количество бактерий на клетку-хозяина, что было наиболее важным показателем для определения бактериальной приверженности.
  5. Экспорт данных и статистический анализ
    1. Экспортируйте проанализированные результаты со всех изображений в электронную таблицу (например, в формат 'xlsx'). Автоматизированная система генерирует два набора результатов: 1) среднее количество бактерий адгезивов с каждого изображения; 2) информативные данные каждой отдельной клетки-хозяина, такие как количество адгезивных бактерий на одной клетке, размер хозяина и средняя интенсивность флуоресценции клетки-хозяина и бактерий, из соответствующего изображения.
    2. Рассчитайте среднее число и стандартное отклонение количества адгезивных бактерий из всех изображений, чтобы представить уровень бактериальной приверженности по сравнению с отрицательными контрольными группами. В этом методе E. coli и B. subtilis служили отрицательным контролем при тестировании грамотрицательной и грамположительной бактериальной приверженности соответственно. Выполняйте двусторонние ANOVA для проверки значительных различий между точками данных в лечении для трех независимых экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для разработки анализа бактериальной приверженности на основе флуоресцентной визуализации штамм P. aeruginosa PAO1 и его аналог с отрицательной адгезией E. coli были использованы для проверки эффективности протокола, поскольку сообщалось о прилипании этих бактерий к клеткам A54914,20,22. Во-первых, GFP-меченый P. aeruginosa (PAO1) и GFP-меченый E. coli были совместно инкубированы с увековеченн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол описывает автоматизированный подход к перечислению бактериальной привязанности к клеткам-хозяевам. Описанный подход имеет ряд привлекательных преимуществ перед обычными методами. Во-первых, этот подход позволяет точно количественно оценить количество клеток микробного патогена, которые прикреплены к отдельным клеткам-хозяевам. Важно отметить, что эта количественная оценка может быть выполнена без необходимости трудоемкого сбора бактерий, последовательного разбавления, нанесения покрытий на твердые среды и опреде...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У всех авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны доктору Кайте Злотковски из Biotek Inc. за техническую поддержку. Эта работа была поддержана Министерством обороны по контракту W911NF1920013 с PdF, Агентством перспективных оборонных исследовательских проектов (DARPA) и Министерством внутренних дел по контракту No 140D6319C0029 с PdF. Содержание информации не обязательно отражает позицию или политику правительства, и не следует делать никаких выводов об официальном одобрении.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10x PBSVWR45001-130
4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)Thermo Fisher62248Краситель для окрашивания клеток хозяина
96 лунка Corning3882Половинная площадь лунки, плоское прозрачное дно
A549 клеткиATCC CCL 185Клеточная линия млекопитающих
BactoView Live RedBiotium40101Бактериальный краситель
ЦентрифугаEppendorf5810R
CFSE Трекер деления клетокBioLegend423801
Cytation 5 BioTekCytation 5 Многорежимный считыватель для визуализации клеток
Лабораторный фонд E. coli 
EGM bulletKitLonzaCC-3124HUVEC среда для культивирования клеток
EHECNIST коллекции
F-12k mediumATCC 302004Среда для культивирования клеток A549
Фетальная бычья сывороткаCorning35-016-CV
HUVECЛабораторный фонд 
L. monocytogenesNIST collections
OD600 DiluPhotometerIMPLEN
P. aeruginosaлабораторный запас доктора Лори Берроуза
P. aeruginosa & Delta; pilAД-р Лори Берроуз лабораторный запас
S. agalactiaeNIST collections
S. aureusBEINR-46543
S. aureus & Delta; saeRBEINR-48164
S. rubidaeaNIST collections
Типичный соевый бульонGrowcellsMBPE-4040

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
  2. Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
  3. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433(2017).
  4. Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
  5. Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094(2020).
  6. Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
  7. Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928(2019).
  8. Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
  9. Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192(2021).
  10. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110(2008).
  11. Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078(2011).
  12. Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240(2020).
  13. Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103(2018).
  14. Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
  15. Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173(2020).
  16. Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268(2019).
  17. Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350(2019).
  18. Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43(2018).
  19. Hazan, R., Que, Y. -A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259(2012).
  20. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
  21. Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
  22. Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
  23. Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
  24. Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Исправление

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 2/08/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

to:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

Теги

A549Pseudomonas aeruginosa

Похожие статьи