Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Химическая модификация остатка триптофана в рекомбинантном N-домене Ca2+-АТФазы для изучения триптофана-ANS FRET

2.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62770

⸱

9 октября 2021 г.

 , 
1Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

В этой статье

Краткое содержание

ANS связывается с Ca2+-ATPase рекомбинантным N-доменом. Флуоресцентные спектры отображают FRET-подобную картину при возбуждении на длине волны 295 нм. NBS-опосредовавшая химическая модификация Trp гасят флуоресценцию N-домена, что приводит к отсутствию переноса энергии (FRET) между остатком Trp и ANS.

Аннотация

Сарко/эндоплазматический щетикулум Ca2+-ATPase (SERCA) представляет собой АТФазу P-типа, которая кристаллизовалась в различных конформациях. Тем не менее, подробная функциональная информация может быть получена из изолированных рекомбинантных доменов. Спроектированный (Trp552Leu и Tyr587Trp) рекомбинантный нуклеотид-связывающий домен (N-домен) отображает флуоресцентное гашение при связывании лиганда. Внешний флуорофор, а именно 8-анилино-1-нафталинсульфонат (ANS), связывается с нуклеотид-связывающим сайтом посредством электростатических и гидрофобных взаимодействий с остатками Arg, His, Ala, Leu и Phe. Связывание ВНС свидетельствует увеличение интенсивности флуоресценции при возбуждении на длине волны (λ) 370 нм. Однако при возбуждении при λ 295 нм увеличение интенсивности флуоресценции, по-видимому, связано с гашением внутренней флуоресценции N-домена. Флуоресцентные спектры отображают резонансную картину переноса энергии Фёстера (FRET), тем самым предполагая наличие пары Trp-ANS FRET, которая, по-видимому, поддерживается коротким расстоянием (~ 20 Å) между Tyr587Trp и ANS. В этом исследовании описывается анализ пары Trp-ANS FRET методом химической модификации Trp (и флуоресцентного гашения), которая опосредована N-бромосукцинимидом (NBS). В химически модифицированном N-домене флуоресценция ANS увеличивалась при возбуждении при λ 295 нм, аналогично при возбуждении при λ 370 нм. Следовательно, опосредованные NBS химические модификации остатка Trp могут быть использованы для исследования отсутствия FRET между Trp и ANS. При отсутствии флуоресценции Trp не следует наблюдать увеличение флуоресценции ВСС. Химическая модификация остатков Trp в белках NBS может быть полезна для изучения FRET между остатками Trp, которые близки к связанным ANS. Этот анализ, вероятно, также будет полезен при использовании других флуорофоров.

Введение

Резонансный перенос энергии Фёстера (FRET) стал стандартным методом определения расстояния между молекулярными структурами после связывания или взаимодействия в белковой структуре и функциональных исследованиях1,2,3,4. В АТФазах Р-типа FRET был использован для исследования структуры и функции сарко-эндоплазматического стикулума Ca2+-АТФазы (SERCA)2,5,6,7,8,например, структурные флуктуации во время каталитического цикла были проанализированы во всем белке с помощью FRET7.

Доноры FRET разнообразны и варьируются от небольших флуоресцентных (внешних) молекул до флуоресцентных белков9,10. Остатки триптофана (Trp) (из-за их флуоресценции) полезны для выявления структурных изменений в белковых аминокислотных последовательностях11,12. Интенсивность флуоресценции Trp существенно зависит от полярности окружающей его среды13,14. Связывание лигандов обычно порождает структурные перестройки в белках/ферментах15,16. Если Trp присутствует в месте связывания белка или расположен близко к нему, структурные колебания часто влияют на степень воздействия Trp на водные среды13,14; таким образом, изменение полярности приводит к гашению интенсивности флуоресценции Trp13,14. Следовательно, флуоресцентное свойство Trp полезно для проведения исследований связывания лигандов для ферментов. Другие физические явления могут также привести к закалке флуоресценции Trp17,18,19,20,например, FRET и изменениям средней полярности. Передача энергии из возбужденного состояния Trp во флуорофор также имеет потенциальное применение, например, определение аффинности малых лигандов в белках21. Действительно, Trp в основном использовался в качестве флуоресцентного донора в исследованиях FRET в белках22,23,24,например, в исследованиях TERBium (Tb3+)FRET, остаток Trp часто используется в качестве антенны для передачи энергии tb3 +25,26,27. Trp демонстрирует различные преимущества перед другими донорами FRET благодаря присущему ему конститутивному характеру в структуре белка, что исключает необходимость в препаративных процессах, которые могут влиять на функцию/структуру исследуемого белка24. Таким образом, идентификация радиационных распадов (перенос энергии и изменения полярности среды, которые индуцируются структурными перестройками белка) важна для получения точных выводов относительно связывания лигандов в структурных исследованиях белка13,14,19,28.

В исследованиях структуры белка внешний флуорофор, а именно 8-анилино-1-нафталинсульфонат (НС), в основном использовался в экспериментах, связанных со сворачиванием/развертыванием белка28,29. ВСС связывается с белками/ферментами в нативном состоянии, обычно в местах связывания субстратов31,32,33; увеличение квантового выхода флуоресценции ВНС (ΦF) (а именно увеличение интенсивности флуоресценции) индуцируется возбуждением белка при λ=370 нм, когда подходящие взаимодействия НС с Arg и его остатками в гидрофобных карманах происходят34,35,36,37. В различных исследованиях сообщалось о возникновении FRET (при возбуждении при λ в пределах 280-295 нм) между остатками Trp (донорами) и ANS (акцептором), что основано на следующем: 1) перекрытии спектра флуоресцентного излучения Trp и спектра возбуждения ANS, 2) идентификации подходящего расстояния между одним или несколькими остатками Trp и ANS для передачи энергии, 3) высокий квантовый выход ВСС при связывании в белковых карманах и 4) характерный паттерн FRET в спектрах флуоресценции белка в присутствииANS 3,17,27,37,38.

В последнее время связывание лигандов с нуклеотидсвязывающим доменом (N-доменом) в SERCA и других АТФазах P-типа было исследовано с использованием инженерных рекомбинантных N-доменов40,41,42,43,44,45,46. Молекулярная инженерия N-домена SERCA была использована для перемещения единственного остатка Trp (Trp552Leu) в более динамичную структуру (Tyr587Trp), которая близка к нуклеотид-связывающему сайту, где вариации флуоресценции (гашение) могут быть использованы для мониторинга структурных изменений при связывании лиганда34. Экспериментальные результаты показали, что ВНС связывается (как АТФ) с нуклеотид-связывающим сайтом в очищенном рекомбинантном N-домене SERCAN 34. Интересно, что флуоресценция ANS увеличивается при связывании с N-доменом при возбуждении при λ 295 нм, в то время как внутренняя флуоресценция N-домена уменьшаетсяна 34,тем самым создавая паттерн FRET, который предполагает образование пары Trp-ANS FRET.

Предложено использовать НБС для определения содержания остатков Trp в белках47 путем анализа абсорбции модифицированных белков. NBS модифицирует высокоабсорбировку индоловой группы Trp на менее абсорбирующий оксиндол47,48. Это приводит к потере (закалке) флуоресцентного свойства Trp40. Следовательно, Опосредованная NBS химическая модификация остатков Trp может быть использована в качестве анализа для определения роли Trp (как донора), когда freT выдвигается гипотеза.

Этот протокол описывает химическую модификацию единственного остатка Trp NBS в спроектированном рекомбинантном N-домене SERCA в качестве белковой модели. Экспериментальные результаты показывают, что интенсивность флуоресценции ANS все еще увеличивается в химически модифицированном NBS N-домене34,которому не хватает внутренней флуоресценции. Поэтому анализ полезен для демонстрации отсутствия FRET между остатком Trp и ANS при связывания с N-доменом34,40,49. Следовательно, этот анализ (NBS химическая модификация Trp) полезен для доказательства присутствия пары Trp-ANS FRET в белках.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Определение(in silico)взаимодействия ANS и SERCA N-домена

  1. Генерация трехмерной (3D) структуры белка (SERCA N-домен) путем молекулярного моделирования с использованием предпочтительного программного обеспечения для моделирования белка50.
  2. Идентифицировать аминокислотные остатки, образующие нуклеотид-связывающий сайт, используя предпочтительное программное обеспечение51молекулярной структуры, и определить наличие остатков Arg и Lys35; они необходимы для связывания ВНС и для увеличения интенсивности флуоресценции (квантового выхода).
  3. Выполняют молекулярную стыковку (с использованием предпочтительного программного обеспечения стыковки)52,53,54 для определения взаимодействий АТФ, фторэсцеина изотиоцианата (FITC) (который образует ковалентную связь с Lys515, маркируя нуклеотид-связывающий сайт) и ANS с аминокислотными остатками в нуклеотид-связывающем сайте(фиг.1).
  4. Рассчитайте молекулярное расстояние (Å) между остатком Trp и связанным ANS с помощью инструмента измерения в предпочтительном программном обеспечении.
  5. Выполнить молекулярно-динамическое моделирование комплекса ANS-N-домена для определения устойчивости взаимодействия52,54. Затем выполните эксперименты in vitro, когда стабильность комплекса будет подтверждена.

2. Экспрессия и очистка рекомбинантного N-домена

  1. Синтезируют ген, кодирующий N-домен40.
  2. Спроектируйте и постройте плазмиду, содержащую синтетический ген, кодируемый N-доменом40.
  3. Экспресс и очистка с помощью аффинной хроматографии (Ni-NTA), инженерного рекомбинантного N-домена. Выполните SDS-PAGE очищенного белка для определения чистоты(Рисунок 2)40.
  4. Определить концентрацию белка можно путем изучения абсорбации при λ 280 нм с коэффициентом вымирания N-домена (ε= 11,960М-1·см-1)40.

3. Мониторинг формирования ANS-N-доменного комплекса на основе изменений интенсивности флуоресценции ANS и N-домена.

  1. Готовят СТОКОВЫЙ раствор ВНС в N,N-диметилформамиде.
    1. Взвесили небольшое количество (1-5 мг) ВНС и растворили его в 1 мл конечного объема N,N-диметилформамида, например, 3,2 мг (конечная концентрация 10,69 мМ).
    2. Готовят водный раствор 100 мкМ ANS с использованием раствора ANS в N,N-диметилформамиде, например, добавляют 9,4 мкл раствора ANS 10,69 мМ к 990,6 мкл 50 мМ фосфатного буфера с рН 8,0 для получения конечного объема 1 мл.
    3. Перемешайте растворы путем вихря 3 - 5 раз в течение 15 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем эксперименте используйте только водный раствор ANS. Перед началом экспериментов приготовьте водный раствор ВС.
  2. Готовят раствор NBS в N,N-диметилформамиде.
    1. Взвесили небольшое количество (1-5 мг) НБС и растворили его в 1 мл N,N-диметилформамида, например, 5,3 мг в 1 мл (конечная концентрация 29,78 мМ).
    2. Готовят водный раствор NBS 1 мМ, используя раствор NBS в N,N-диметилформамиде, например, добавляют 3,36 мкл раствора NBS 29,78 мМ к 96,64 мкл 50 мМ фосфатного буфера с рН 8,0 для получения конечного объема 0,1 мл.
    3. Перемешайте растворы путем вихря 3 - 5 раз в течение 15 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом экспериментов своевременно приготовьте водный раствор NBS.
  3. Титруйте N-домен с ANS и запишите спектры флуоресценции возбуждением при λ=295 нм при 25 °C.
    1. Получение базового уровня флуоресцентного спектра.
      1. Поместите 1 мл 50 мМ фосфатного буфера с рН 8,0 в флуоресцентную кварцевую кювету 1 мл.
      2. Поместите ячейку в термостатированную ячейку ячейки (25 °C) спектрофлуорометра и установите возбуждение λ на 295 нм.
      3. Запись спектра флуоресценции (305 - 550 нм).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Спектр флуоресценции 50 мМ фосфатного буфера с рН 8,0, который служит пустым образцом, вычитается из всех полученных спектров флуоресценции.
    2. Получение собственного спектра флуоресценции N-домена.
      1. Поместите 900 мкл 50 мМ фосфатного буфера с рН 8,0 в флуоресцентную кварцевую кювету.
      2. Добавьте 100 мкл N-доменной (10 мкМ) суспензии для получения конечной концентрации 1 мкМ N-домена в конечном объеме 1 мл.
      3. Аккуратно гомогенизируйте с помощью микропипетки 20 раз, чтобы обеспечить однородность раствора.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Белок должен быть свежеочищен для получения высококачественных собственных флуоресцентных спектров, например, очищенный рекомбинантный N-домен может быть использован только в течение недели после очистки.
      4. Поместите ячейку в термостатированную ячейку ячейки (25 °C) спектрофлуорометра и установите возбуждение λ на 295 нм.
      5. Запишите спектр внутренней флуоресценции N-домена (305-550 нм).
    3. Сложите ВС и получите спектр флуоресценции путем возбуждения при λ=295 нм.
      1. Добавьте 2 мкл аликвоты водного раствора ANS 100 мкМ в взвешенный N-домен (1 мкМ) для получения конечной концентрации 0,2 мкМ ANS.
      2. Аккуратно гомогенизируйте с помощью микропипетки 20 раз, чтобы обеспечить однородность раствора.
      3. Поместите ячейку в термостабильной камере ячейки (25 °C) спектрофлуорометра и установите возбуждение λ на 295 нм.
      4. Запись спектра флуоресценции (305-550 нм).
      5. Повторите сложения ANS и запись спектров флуоресценции выше молярного соотношения 1:1 ANS:N-домен.
      6. Вычтите пустой спектр из каждого спектра с помощью подходящего программного обеспечения.
      7. Построй все спектры в одном графике.
      8. Определите, образуют ли спектры FRET-подобный паттерн. Спектры флуоресценции ANS-N-домена образуют FRET-подобный паттерн(рисунок 3A).

4. N-доменное титрование внутренней флуоресценции методом химической модификации Trp с NBS.

  1. Повторите шаги 3.3.1 и 3.3.2.
  2. Добавьте 1 мкл аликвоты 1 мМ водного раствора NBS к взвешенному N-домену (1 мкМ) для получения конечной концентрации 1 мкМ NBS.
  3. Мягко гомогенизируйте с помощью микропипетки 20 раз, чтобы обеспечить однородность раствора.
  4. Поместите ячейку в термостабильной камере ячейки (25 °C) спектрофлуорометра и установите возбуждение λ на 295 нм.
  5. Запись спектра флуоресценции (305-550 нм)(рисунок 3В).
  6. Повторяйте запись спектров сложения и флуоресценции NBS до тех пор, пока не будет наблюдаться минимальное закалка внутренней флуоресценции N-домена40. В N-домене это обычно происходит при молярном соотношении 5-6 NBS/N-домен40.
    ПРИМЕЧАНИЕ: NBS быстро гасят (<5 с) внутреннюю флуоресценцию N-домена; наблюдается снижение интенсивности флуоресценции. Немедленно переходите к следующему этапу, так как НБС может также вступать в реакцию с другими аминокислотными остатками47.
  7. Вычтите пустой спектр из каждого спектра с помощью подходящего программного обеспечения.
  8. Построй все спектры в одном графике(рисунок 3B).

5. Титруем N-модифицированный N-домен NBS с ANS путем регистрации флуоресцентных спектров при 25 °C.

  1. Выполните шаг 3.3.3, используя измененный N-домен NBS, созданный на шаге 4.
  2. Вычтите пустой спектр из каждого спектра с помощью подходящего программного обеспечения.
  3. Построй все спектры в одном графике(рисунок 3C).
  4. Генерируемые флуоресцентныеспектры (рисунок 3С)поддерживают или опровергают возникновение FRET, т.е. при возникновении FRET флуоресценция ANS не увеличивается и наоборот.

6. Доказательства связывания ВНС с химически модифицированным N-доменом возбуждением при λ=370 нм.

  1. Выполните шаг 3.3.3, используя модифицированный N-домен NBS, который был сгенерирован на шаге 4, но изменив возбуждение λ на 370 нм.
  2. Вычтите пустой спектр из каждого спектра с помощью подходящего программного обеспечения.
  3. Построй все спектры в одном графике(рисунок 3D).
  4. Подтвердите связывание ВНС с N-доменом, наблюдая за увеличением интенсивности флуоресценции ВНС. Связывание ANS с N-доменом показывает увеличение флуоресценции при возбуждении при λ=370 нм(рисунок 3D). В качестве контроля флуоресцентный спектр ВНС (один) в 50 мМ фосфатном буфере с рН 8,0 был получен возбуждающим при λ 295 и 370 нм(рисунок 4,не показанный на видео).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стехиометрическая зависимость NBS:Trp, необходимая для химической модификации, зависит от степени закапывания остатка (остатков) Trp в исследуемом белке46,47,55,56. Поэтому рекомендуется заранее определить молярное соотношение NBS:белок/(Trp).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Молекулярная стыковка показывает связывание ВНС с нуклеотид-связывающим сайтом N-домена посредством электростатических, а также гидрофобных взаимодействий(рисунок 1). Молекулярное расстояние (20 Å) между остатком Trp и ANS (связанным с нуклеотид-связывающим сайтом) поддерживает возникновение FRET(фиг.1). Спроектированный (спроектированный) рекомбинантный N-домен был получен при высокой чистоте с помощью аффинной хроматографии(рис. 2)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Флуоресцентные спектры комплекса ANS-N-домена отображают FRET-подобную картину при возбуждении при λ 295 нм, в то время как молекулярное расстояние (20 Å) между остатком Trp и ANS, по-видимому, поддерживает возникновение FRET(рисунок 1). Химическая модификация Trp NBS приводит к менее флуоресцентной N-домену(рисунок 3B,спектр f); следовательно, передача энергии невозможна. Спектры флуоресценции ANS аналогичны спектрам немодифицированного N-домена при возбуждении...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была частично профинансирована грантом FAI-UASLP No C19-FAI-05-89.89 и грантом CONACYT No 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). Авторы благодарят за техническую помощь Джулиана Э. Мата-Моралеса в видеоигровке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АкриламидBio-Rad1610107SDS-PAGE
персульфат аммонияBio-Rad1610700SDS-PAGE
8-Анилино-1-нафталинсульфоновая кислотаSigma-AldrichA1028Флуорофор
Бис-акриламидBio-Rad1610125SDS-PAGE
N-BromosuccinimideSigma-AldrichB81255Химический
модификация N,N-диметилформамидJ.T. Baker9213-12Препарат исходного раствора
Флуоресцеин изотиоцианатSigma-AldrichF7250Химическая флуоресцентная метка
Флуоресцентная кюветаHellmaZ801291Флуоресцентный анализ Флуоресцентный
спектрофлуориметрShimadzuRF 5301PCФлуоресцентный анализ
HisTrap™ FFGE Healtcare11-0004-59Очистка белка
IPTG, свободный диоксанАмериканский бионалитическийAB00841-00010Экспрессия белка
ИмидазолСигма-ОлдричI5513-25GОчистка белка
LB средаFisher Scientific10000713Клеточная культура
Pipetman L P10LGilsonFA10002Mфлуоресценция Анализ
Пипетман L P100LАнализ ЖильсонаFA10004MФлуоресцентный анализ
Пипетман L P200LАнализ ЖильсонаFA10005MФлуоресцентный анализ
Пипетман L P1000LАнализ ЖильсонаFA10006MФлуоресцентный анализ
Пипетман L P5000LЖильсонFA10007Флуоресцентный анализ
Precision plus stdBio-Rad1610374SDS-PAGE
Додецилсульфат натрияBio-Rad1610302SDS-PAGE
Двухосновной фосфат натрияJ.T. Baker3828-19Буферный препарат
Одноосновной фосфат натрияJ.T. Baker3818-01Буферный препарат
Шприцевой фильтр 0,2 мкмФильтрация миллипорGVWP04700раствор
TemedBio-Rad1610801SDS-СТРАНИЦА
ТрисБио-Рад1610719SDS-PAGE

Ссылки

  1. Munishkina, L. A., Fink, A. L. Fluorescence as a method to reveal structures and membrane-interactions of amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1768 (8), 1862-1885 (2007).
  2. Dong, X., Thomas, D. D. Time-resolved FRET reveals the structural mechanism of SERCA-PLB regulation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 449 (2), 196-201 (2014).
  3. Szilvay, G. R., Blenner, M. A., Shur, O., Cropek, D. M., Banta, S. A FRET-based method for probing the conformational behavior of an intrinsically disordered repeat domain from Bordetella pertussis adenylate cyclase. Biochemistry. 48 (47), 11273-11282 (2009).
  4. Sun, Y., Wallrabe, H., Booker, C. F., Day, R. N., Periasamy, A. Three-color spectral FRET microscopy localizes three interacting proteins in living cells. Biophysical Journal. 99 (4), 1274-1283 (2010).
  5. Cornea, R. L., et al. High-throughput FRET assay yields allosteric SERCA activators. Journal of Biomolecular Screening. 18 (1), 97-107 (2013).
  6. Gruber, S. J., et al. Discovery of enzyme modulators via high-throughput time-resolved FRET in living cells. Journal of Biomolecular Screening. 19 (2), 215-222 (2014).
  7. Dyla, M., et al. Dynamics of P-type ATPase transport revealed by single-molecule FRET. Nature. 551 (7680), 346-351 (2017).
  8. Corradi, G. R., Adamo, H. P. Intramolecular fluorescence resonance energy transfer between fused autofluorescent proteins reveals rearrangements of the N- and C-terminal segments of the plasma membrane Ca2+ pump involved in the activation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (49), 35440-35448 (2007).
  9. Piston, D. W., Kremers, G. -J. Fluorescent protein FRET: The good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
  10. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  11. Chen, Y., Barkley, M. D. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry. 37 (28), 9976-9982 (1998).
  12. Zelent, B., et al. Tryptophan fluorescence yields and lifetimes as a probe of conformational changes in human glucokinase. Journal of Fluorescence. 27 (5), 1621-1631 (2017).
  13. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. I: Descriptive quantum principles of fluorescence quenching using a supermolecule approach. Journal of Molecular Structure. 1077, 14-21 (2014).
  14. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. II: Photophysics of aromatic residues and dependence of fluorescence spectra on protein conformation. Journal of Molecular Structure. 1077, 22-29 (2014).
  15. Agarwal, P. K., Geist, A., Gorin, A. Protein dynamics and enzymatic catalysis: Investigating the peptidyl-prolyl cis-trans isomerization activity of cyclophilin A. Biochemistry. 43 (33), 10605-10618 (2004).
  16. Deng, H., Zhadin, N., Callender, R. Dynamics of protein ligand binding on multiple time scales: NADH binding to lactate dehydrogenase. Biochemistry. 40 (13), 3767-3773 (2001).
  17. van de Weert, M. Fluorescence quenching to study protein-ligand binding: common errors. Journal of fluorescence. 20 (2), 625-629 (2010).
  18. van de Weert, M., Stella, L. Fluorescence quenching and ligand binding: A critical discussion of a popular methodology. Journal of Molecular Structure. 998 (1-3), 144-150 (2011).
  19. Stella, L., van de Weert, M., Burrows, H. D., Fausto, R. Fluorescence spectroscopy and binding: Getting it right. Journal of Molecular Structure. 1077, 1-3 (2014).
  20. Credi, A., Prodi, L. Inner filter effects and other traps in quantitative spectrofluorimetric measurements: Origins and methods of correction. Journal of Molecular Structure. 1077, 30-39 (2014).
  21. Lee, M. M., Peterson, B. R. Quantification of small molecule-protein interactions using FRET between tryptophan and the pacific blue fluorophore. ACS Omega. 1 (6), 1266-1276 (2016).
  22. Zhang, Y., et al. Comparison of FÖrster-resonance-energy-transfer acceptors for tryptophan and tyrosine residues in native proteins as donors. Journal of Fluorescence. 23 (1), 147-157 (2013).
  23. Xie, Y., Maxson, T., Tor, Y. Fluorescent ribonucleoside as a FRET acceptor for tryptophan in native proteins. Journal of the American Chemical Society. 132 (34), 11896-11897 (2010).
  24. Ghisaidoobe, A. B. T. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  25. Goryashchenko, A. S., et al. Genetically encoded FRET-sensor based on terbium chelate and red fluorescent protein for detection of caspase-3 activity. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 16642-16654 (2015).
  26. Arslanbaeva, L. R., et al. Induction-resonance energy transfer between the terbium-binding peptide and the red fluorescent proteins DsRed2 and TagRFP. Biophysics. 56 (3), 381-386 (2011).
  27. Di Gennaro, A. K., Gurevich, L., Skovsen, E., Overgaard, M. T., Fojan, P. Study of the tryptophan-terbium FRET pair coupled to silver nanoprisms for biosensing applications. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (22), 8838-8844 (2013).
  28. Hawe, A., Poole, R., Jiskoot, W. Misconceptions over Förster resonance energy transfer between proteins and ANS/bis-ANS: Direct excitation dominates dye fluorescence. Analytical Biochemistry. 401 (1), 99-106 (2010).
  29. Ghosh, U., Das, M., Dasgupta, D. Association of fluorescent probes 1-anilinonaphthalene-8-sulfonate and 4,4´-dianilino-1,1´-binaphthyl-5,5´-disulfonic acid with T7 RNA polymerase. Biopolymers. 72 (4), 249-255 (2003).
  30. Vreuls, C., et al. Guanidinium chloride denaturation of the dimeric Bacillus licheniformis BlaI repressor highlights an independent domain unfolding pathway. The Biochemical Journal. 384, 179-190 (2004).
  31. Möller, M., Denicola, A. Study of protein-ligand binding by fluorescence. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (5), 309-312 (2002).
  32. Chang, L., Wen, E., Hung, J., Chang, C. Energy transfer from tryptophan residues of proteins to 8-anilinonaphthalene-1-sulfonate. Journal of Protein Chemistry. 13 (7), 635-640 (1994).
  33. Togashi, D. M., Ryder, A. G. A fluorescence analysis of ANS bound to bovine serum albumin: Binding properties revisited by using energy transfer. Journal of Fluorescence. 18 (2), 519-526 (2008).
  34. Dela Cruz-Torres, V., Cataño, Y., Olivo-Rodríguez, M., Sampedro, J. G. ANS interacts with the Ca2+-ATPase nucleotide binding site. Journal of Fluorescence. 30 (3), 483-496 (2020).
  35. Gasymov, O. K., Glasgow, B. J. ANS fluorescence: Potential to augment the identification of the external binding sites of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1774 (3), 403-411 (2007).
  36. Matulis, D., Lovrien, R. 1-anilino-8-naphthalene sulfonate anion-protein binding depends primarily on ion pair formation. Biophysical Journal. 74 (1), 422-429 (1998).
  37. Samukange, V., Yasukawa, K., Inouye, K. Interaction of 8-anilinonaphthalene 1-sulphonate (ANS) and human matrix metalloproteinase 7 (MMP-7) as examined by MMP-7 activity and ANS fluorescence. Journal of Biochemistry. 151 (5), 533-540 (2012).
  38. Qin, J., et al. Selective and sensitive homogenous assay of serum albumin with 1-anilinonaphthalene-8-sulphonate as a biosensor. Analytica Chimica Acta. 829, 60-67 (2014).
  39. Malik, A., Kundu, J., Karmakar, S., Lai, S., Chowdhury, P. K. Interaction of ANS with human serum albumin under confinement: Important insights and relevance. Journal of Luminescence. 167, 316-326 (2015).
  40. Páez-Pérez, E. D., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. Nucleotide binding in an engineered recombinant Ca2+-ATPase N-domain. Biochemistry. 55 (49), 6751-6765 (2016).
  41. Sampedro, J. G., Nájera, H., Uribe-Carvajal, S., Ruiz-Granados, Y. G. Mapping the ATP binding site in the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Journal of fluorescence. 24 (6), 1849-1859 (2014).
  42. Abu-Abed, M., Millet, O., MacLennan, D. H., Ikura, M. Probing nucleotide-binding effects on backbone dynamics and folding of the nucleotide-binding domain of the sarcoplasmic/endoplasmic-reticulum Ca2+-ATPase. The Biochemical Journal. 379, Pt 2 235-242 (2004).
  43. Abu-Abed, M., Mal, T. K., Kainosho, M., MacLennan, D. H., Ikura, M. Characterization of the ATP-binding domain of the sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase: probing nucleotide binding by multidimensional NMR. Biochemistry. 41 (4), 1156-1164 (2002).
  44. Sazinsky, M. H., Mandal, A. K., Argüello, J. M., Rosenzweig, A. C. Structure of the ATP binding domain from the Archaeoglobus fulgidus Cu+-ATPase. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11161-11166 (2006).
  45. Liu, L., et al. Crystallization and preliminary X-ray studies of the N-domain of the Wilson disease associated protein. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 65 (6), 621-624 (2009).
  46. Banci, L., et al. The binding mode of ATP revealed by the solution structure of the N-domain of human ATP7A. Journal of Biological Chemistry. 285 (4), 2537-2544 (2010).
  47. Spande, T. F., Witkop, B. Determination of the tryptophan content of proteins with N-bromosuccinimide. Methods in Enzymology. 11, 498-506 (1967).
  48. Spande, T. F., Green, N. M., Witkop, B. The Reactivity toward N-bromosuccinimide of tryptophan in enzymes, zymogens, and inhibited enzymes. Biochemistry. 5 (6), 1926-1933 (1966).
  49. Rawat, U. B., Rao, M. B. Purification, kinetic characterization and involvement of tryptophan residue at the NADPH binding site of xylose reductase from Neurospora crassa. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1293 (2), 222-230 (1996).
  50. Zaki, M. J., Bystroff, C. Protein Structure Prediction. , Humana Press. Totowa, NJ. (2008).
  51. Wang, Z., et al. Comprehensive evaluation of ten docking programs on a diverse set of protein-ligand complexes: The prediction accuracy of sampling power and scoring power. Physical Chemistry Chemical Physics. 18 (18), 12964-12975 (2016).
  52. Pagadala, N. S., Syed, K., Tuszynski, J. Software for molecular docking: A review. Biophysical Reviews. , 91-102 (2017).
  53. Dolatkhah, Z., Javanshir, S., Sadr, A. S., Hosseini, J., Sardari, S. Synthesis, Molecular Docking, Molecular Dynamics Studies, and Biological Evaluation of 4 H -Chromone-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylate Derivatives as Potential Antileukemic Agents. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (6), 1246-1257 (2017).
  54. Forli, S., et al. Computational protein-ligand docking and virtual drug screening with the AutoDock suite. Nature Protocols. 11 (5), 905-919 (2016).
  55. Lindahl, E. R. Molecular dynamics simulations. Molecular Modeling of Proteins. Methods in Molecular Biology. 443, 3-23 (2008).
  56. Turk, T., Maček, P., Gubenšek, F. The role of tryptophan in structural and functional properties of equinatoxin II. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Protein Structure and Molecular. 1119 (1), 1-4 (1992).
  57. Peterman, B. F., Laidler, K. J. Study of reactivity of tryptophan residues in serum albumins and lysozyme by N-bromosuccinamide fluorescence quenching. Archives of Biochemistry and Biophysics. 199 (1), 158-164 (1980).
  58. Divita, G., Goody, R. S., Gautheron, D. C., Di Pietro, A. Structural mapping of catalytic site with respect to α-subunit and noncatalytic site in yeast mitochondrial F1-ATPase using fluorescence resonance energy transfer. Journal of Biological Chemistry. 268 (18), 13178-13186 (1993).
  59. Horrocks, W. D., Holmquist, B., Vallee, B. L. Energy transfer between terbium (III) and cobalt (II) in thermolysin: a new class of metal-metal distance probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 4764-4768 (1975).
  60. Chakraborty, J., Das, N., Halder, U. C. Unfolding diminishes fluorescence resonance energy transfer (FRET) of lysine modified β-lactoglobulin: Relevance towards anti-HIV binding. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 102 (1), 1-10 (2011).
  61. Sirangelo, I., Malmo, C., Casillo, M., Irace, G. Resolution of Tryptophan-ANS Fluorescence Energy Transfer in Apomyoglobin by Site-directed Mutagenesis. Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 381-384 (2007).
  62. Ribeiro, A. J. M., Tyzack, J. D., Borkakoti, N., Holliday, G. L., Thornton, J. M. A global analysis of function and conservation of catalytic residues in enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 314-324 (2020).
  63. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Exposure of tryptophanyl residues in proteins. Quantitative determination by fluorescence quenching studies. Biochemistry. 15 (3), 672-680 (1976).
  64. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching of indole and model micelle systems. The Journal of Physical Chemistry. 80 (5), 486-493 (1976).
  65. Kinsley, N., Sayed, Y., Mosebi, S., Armstrong, R. N., Dirr, H. W. Characterization of the binding of 8-anilinonaphthalene sulfonate to rat class Mu GST M1-1. Biophysical Chemistry. 137 (2-3), 100-104 (2008).
  66. Mohsenifar, A., et al. A study of the oxidation-induced conformational and functional changes in neuroserpin. Iranian Biomedical Journal. 11 (1), 41-46 (2007).
  67. Gonzalez, W. G., Miksovska, J. Application of ANS fluorescent probes to identify hydrophobic sites on the surface of DREAM. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (9), 1472-1480 (2014).
  68. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching studies with proteins. Analytical Biochemistry. 114 (2), 199-227 (1981).
  69. Poulos, T. L., Price, P. A. The identification of a tryptophan residue essential to the catalytic activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease. The Journal of biological chemistry. 246 (12), 4041-4045 (1971).
  70. Hu, J. -J., He, P. -Y., Li, Y. -M. Chemical modifications of tryptophan residues in peptides and proteins. Journal of Peptide Science An Official Publication of the European Peptide Society. 27 (1), 3286(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FRETNN SERCA
Химическая модификация остатка триптофана в рекомбинантном N-домене Ca2+-АТФазы для изучения триптофана-ANS FRET
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.