Маркировка внеклеточных везикул для мониторинга миграции и поглощения в хрящевых эксплантатах

Остеоартроз (ОА) – суставное дегенеративное заболевание, подразумевающее прогрессирующее и необратимое воспаление и разрушение внеклеточного матрикса суставного^хряща1. Хотя различные формы артрита имеют многочисленные методы^{лечения 2,3,4,}они ограничены своими побочными эффектами и ограниченной эффективностью. Методы тканевой инженерии с использованием аутологичной имплантации хондроцитов обычно применяются для регенеративного лечения поврежденного хряща при ранних поражениях хряща^ОА4. Клеточная терапия ограничена в основном из-за ограниченного количества фенотипически стабильных хондроцитов или хондропрогениторов, способных эффективно восстанавливать хрящ^3. Поэтому разработка новых терапевтических стратегий для предотвращения прогрессирования заболевания и регенерации крупных поражений хряща имеет первостепенное значение.

Внеклеточные везикулы (EV) были предложены в качестве лечения ОА разными авторами^5,6. EV представляют собой мембранные тела, секретируемые большинством типов клеток, участвуют в межклеточной сигнализации и, как было показано, оказывают терапевтическое воздействие стволовых клеток^7,8,9,из-за чего они недавно вызвали интерес к регенеративной медицине^10. EV, полученные из мезенхимальных стромальных клеток (МСК), являются основными терапевтическими EV, исследуемыми для ОА, хотя другие связанные с суставами клетки использовались в качестве источников EV, например, хондропрогениторы или иммунные клетки^11,12.

Концентраты тромбоцитов, такие как лизаты тромбоцитов (PL), используются для улучшения заживления ран при различных травмах, таких как язвы роговицы^13,14,15 или при регенерации ткани сухожилия^16,из-за гипотезы о том, что компонент EV концентратов тромбоцитов может быть ответственен за эти эффекты¹⁷ . Некоторые исследования, связанные с заболеваниями, связанными с суставами, используют тромбоцитарные EV (PL-EV) в качестве лечения для улучшения остеоартритных состояний. PL-EV улучшают пролиферацию хондроцитов и миграцию клеток, активируя Wnt/β-катениновый^{путь 18,}способствуя экспрессии хондрогенных маркеров в остеоартритных хондроцитах¹⁹или показывая более высокие уровни хондрогенных белков и меньшее количество тиссулярных аномалий у остеоартритных кроликов, получавших PL-EV^18.

EV содержат белки, липиды и нуклеиновые кислоты, которые высвобождаются в клетку-мишень, устанавливая межклеточную связь, что является основной особенностью, связанной с их терапевтическим применением^20. Эффекты электромобилей зависят от их достижения клеток и последующего высвобождения груза. Этот эффект может быть косвенно подтвержден изменениями, вызванными в клетках, такими как метаболическая активность или модификация экспрессии генов. Однако эти методы не позволяют визуализировать то, как электромобили достигают клеток, чтобы выполнять свою функцию. Таким образом, в этой статье представлен метод маркировки этих PL-производных EV для использования в качестве лечения эксплантов хряща ОА, вызванных воспалением. Конфокальная микроскопия использовалась для мониторинга поглощения и прогрессирования EV к хондроцитам, присутствующим в эксплантатах, в течение 5 ч.

ПРИМЕЧАНИЕ: Экспланты хряща были получены из биобанка IdISBa (IB 1995/12 BIO) в соответствии с институциональными руководящими принципами после этического одобрения проекта CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. Подготовка колонны

1. Уравновешивайте колонны в соответствии с инструкциями производителя или следующим образом:
   1. Снимите колпачок столбца и уравновесьте его. Удалите буфер хранилища путем элюирования.
   2. Промыть колонну 3 раза 2,5 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Во время каждой стирки ждите, пока колонна впитает весь объем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не давайте колонке высохнуть.
   3. Накройте колонну колпачком после последней промывки и до пробоподготовки.

2. Маркировка электромобилей

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол маркировки EV использует образец PL-EV, ранее выделенный с помощью хроматографии исключения размера (SEC) с ранее описанными^{условиями21,22.} Тем не менее, любой образец EV из любого источника может быть использован с этим протоколом.

1. Сконцентрируйте образец EV и контроль (PBS) с помощью концентрирующей трубки.
   1. Поместите образцы в концентрирующую трубку объемом 15 мл или 500 мкл в зависимости от начального объема исходного образца EV. Центрифугируйте пробирки в соответствии с инструкциями производителя до тех пор, пока не будет получен почти сухой образец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольный образец необходим для проверки любого фона красителя. Хотя этот метод не требует какого-либо конкретного начального объема, следует учитывать, что около 10% частиц будет потеряно на этапах очистки.
2. Повторно суспендировать концентрированные образцы с разбавителем C. Повторно суспендировать образцы EV с 200 мкл и контрольную группу со 100 мкл и перенести их в новые центрифужные трубки объемом 1,5 мл.
3. Разделите образец EV на две аликвоты по 100 мкл. Отметьте одну красителем и используйте ее в качестве лечения (PKH-PL-EV); оставьте другой немаркированным, но обработайте его (NTA-PL-EV), как образец EV, и используйте его для количественной оценки концентрации EV по NTA.
4. Готовят 2-кратный раствор красителя, в результате чего получается 8 мкМ раствора PKH26 в разбавителе С.
5. Смешайте 1 мкл 1 мМ линкера PKH26 на 125 мкл разбавителя С в образце. Подготовьте объем, необходимый для добавления к образцам в соотношении 1:1.
6. Добавьте 2-кратный раствор красителя в PKH-PL-EV и контрольные образцы в соотношении 1:1 для достижения 1-кратной концентрации красителя и концентрации PKH26 4 мкМ. Добавьте тот же объем PBS в образец NTA-PL-EV. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
7. Добавьте 5% раствор альбумина-PBS из бычьей сыворотки в образцы в соотношении 1:1 и убедитесь, что конечный объем составляет ~400 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволяет удалить неспецифические взаимодействия красителей или несвязанных красителей.
8. Приступайте к отделению меченых электромобилей от несвязанного красителя и неспецифических взаимодействий красителя с колонкой.

3. Маркировка-EV изоляция

1. Снимите колпачок с колонны, добавьте 400 мкл образца (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV или контрольный) и выбросьте всю элюированную жидкость.
2. Подождите, пока образец полностью войдет в столбец, прежде чем переходить к следующему шагу. Добавьте 600 мкл PBS и выбросьте всю элюированную жидкость.
3. Подождите, пока PBS полностью войдет в столбец, прежде чем переходить к следующему шагу. Добавьте 600 мкл PBS и соберите фракцию 600 мкл в 1,5. mL центрифужная трубка (EV или контроль).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги необходимы для удаления излишков красителя из образцов. Еще одно разделение по столбцам необходимо для получения более чистых электромобилей. Таким образом, следующие шаги должны быть выполнены в новой уравновешенной колонке (этап 4.1.) или той же колонке после начальной стадии промывки (стадия 4.2).
4. Подготовьте столбец к новому этапу разделения электромобилей, чтобы получить более чистые электромобили. Если это новый столбец, повторите шаги 2.1. и 2.2. Если это одна и та же колонка, промыть колонну 2,5 мл 20% изопропанола, а затем повторить шаги 2.1 и 2.2.
5. Добавьте в колонку 600 мкл ранее элюированных EV, полученных на этапе 2.5, и отбросьте элюированный объем. Подождите, пока жидкость полностью войдет в колонну, прежде чем переходить к следующему шагу.
6. Добавьте 400 мкл PBS и отбросьте весь элюированный объем. Подождите, пока жидкость полностью войдет в колонну, прежде чем переходить к следующему шагу.
7. Добавьте 600 мкл PBS и соберите фракцию 600 мкл в 1,5 мл центрифужной трубки. Используйте электромобили и контрольные образцы для дальнейшего анализа или храните их на ночь при температуре 4 oC.
8. Сохраните использованные столбцы для дальнейшего использования.
   1. Вымойте колонку 25 мл 20% изопропанола и отбросьте элюированный объем. Промыть колонку 3 раза 2,5 мл PBS.
   2. Добавьте буфер хранилища, удаленный на шаге 1.1.1, и дождитесь, пока буфер войдет в столбец. Накройте колонну колпачком и храните при 4 oC до последующего использования.

4. Количественная оценка EV

1. Подготовьте 1:1000 разбавлений образца NTA-PL-EV и исходного образца PL-EV, как описано следующими двумя шагами.
   1. Приготовьте 1 мл 1:10 разбавленного NTA-PL-EV и 1 мл 1:10 разбавленного исходного PL-EV с PBS, отфильтрованным через фильтр 0,2 мкм.
   2. Подготовьте 1 мл разбавления 1:100 предыдущих разбавленных образцов с PBS, отфильтрованным через фильтр 0,2 мкм.
2. Введите 1:1000 разбавленный образец NTA-PL-EV или исходный образец PL-EV с помощью стерильного шприца в насос NTA. Следуйте инструкциям и рекомендациям производителя по определению концентрации частиц и распределения по размерам.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку концентрация EV зависит от объема стартера образца, может потребоваться считывание промежуточных разрежений и внесение корректировок для получения правильного определения NTA.

5. Электромобили, используемые в качестве лечения ОА, вызванного воспалением

1. Дважды промыть хрящ PBS и иссечь его с помощью биопсийного перфоратора диаметром 3 мм в стерильных условиях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните процедуру с шагов с 5.1 по 5.6 в вытяжке клеточной культуры.
2. Поместите экспланты в 96-луночные культуральные пластины со средой DMEM-F12, дополненной 1% пенициллин-стрептомицином при 37 oC, 5% CO₂и влажности 80%.
   1. Чтобы установить модель ОА, основанную на воспалении, дополните среду клеточного культивирования 10 нг / мл онкостатина М и 2 нг / мл фактора некроза опухоли-альфа (TNFα).
3. Обработайте экспланты 1 × 10⁹ частиц / лунку меченых EV (PKH-PL-EV) или контрольный в среде клеточной культуры, дополненной онкостатином M и TNFα.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте объем образца, содержащего 1 × 10⁹ частиц на лунку, и используйте тот же объем для контроля.
4. Удалите среду из 96-луночных пластин для культивирования клеток, содержащих хрящевые экспланты. Добавляйте 200 мкл клеточной культуральной среды, описанной на стадии 5,3, в каждую лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если 96-луночные пластины контактировали с фетальной бычьей сывороткой (FBS), промыть каждую лунку три раза 200 мкл PBS, чтобы удалить любые EV из FBS.
5. Прекращайте анализ in vitro в разное время: 0, 1, 2, 3, 4 и 5 ч.
6. Промыть клетки культуры колодцами, содержащими экспланты хряща, дважды с 200 мкл PBS.
7. Добавьте 100 мкл 4% параформальдегида (PFA) в ткань, чтобы зафиксировать его в течение 3 ч при 4 oC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы, связанные с ПФА, должны выполняться в вытяжном шкафу в соответствии с рекомендациями Паспорта безопасности.
8. Удалите PFA, добавьте 100 мкл PBS, сохраните фиксированную ткань при 4 °C и обработайте образцы в течение 48 часов.

6. Подготовка и визуализация микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта гистологическая процедура состоит из обезвоживания, встраивания парафина и этапов регидратации. Эти шаги могут снизить общую флуоресценцию красителя (ограничение, упомянутое в техническом описании PKH26). Поэтому другие процедуры, такие как замороженное сечение, могут быть более подходящими для визуализации EV с помощью конфокальной микроскопии.

1. Встраивайте неподвижные ткани в парафиновые блоки. Разрежьте ткань на участки толщиной 6 мкм.
2. Депарафинизируют участки тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги с использованием ксилола должны выполняться в вытяжной вытяжке.
   1. Погружайте участки ткани в ксилол на 30 мин, 100% этанол на 2 мин, 96% этанол на 2 мин, 75% этанол на 1 мин и, наконец, в дистиллированную воду на 30 с.
3. Пермеабилизируют участки тканей.
   1. Готовят 0,1% раствор тритона-0,1% цитрата натрия для пермеабилизации тканей. Добавьте каплю 20 мкл к каждому участку ткани и инкубируйте в течение 10 мин при комнатной температуре. Дважды вымойте каждую секцию 20 мкл PBS.
4. На микроскопический слайд добавьте каплю монтажной среды, содержащей 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) с водной монтажной средой для сохранения флуоресценции. Закройте слайд, содержащий 3 участка ткани из шага 6.3.1.
5. Инкубируйте горки на ночь при комнатной температуре, защищенной от света.
6. Хранить при температуре 4 °C, защищенном от света до конфокальной микроскопии.

Схематический обзор маркировки и мониторинга поглощения электромобилей показан на рисунке 1. Концентрация частиц и размер EV, обнаруженные NTA в таблице 1, показывают, что концентрация EV уменьшается во время процесса из-за стадии очистки, выполненной дважды после маркировки колонкой. Однако полученное количество находится в оптимальном диапазоне количества частиц для использования для лечения. Эта концентрация частиц используется для расчета объема PKH-PL-EV и контроля, которые используются для лечения остеоартритных эксплантов хряща.

После того, как экспланты хряща обрабатываются EV или контрольной группой, они фиксируются на разные периоды: 0, 1, 2, 3, 4 и 5 ч. Затем каждую группу парафинизируют, нарезают и готовят к конфокальной микроскопии монтажной средой, содержащей DAPI. Репрезентативные изображения для каждой группы в каждый момент времени представлены на рисунке 2,показывая, как EV входят в ткань, пока они не достигнут хондроцитов и не войдут в них с течением времени.

Как видно на рисунке 2,меченые EV уже локализованы вокруг хондроцитов (показаны синим цветом с окрашиванием DAPI) после 1 ч инкубации (показаны красным цветом с красителем PKH26). Некоторый фон из-за остаточного красителя может наблюдаться для контрольной группы, которая не имеет электромобилей, но обрабатывается по тому же протоколу, что и образец EV. Эти результаты подтверждают успех протокола маркировки электромобилей, который может быть использован для мониторинга их миграции через анализы in vitro в тканях, как показано здесь, и в экспериментах in vivo.

Рисунок 1:Схематический обзор протокола маркировки и мониторинга поглощения электромобилей. Сокращения: PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; EV = внеклеточный везикул; RT = комнатная температура; BSA = бычий сывороточный альбумин; NTA = анализ отслеживания наночастиц; ОА = остеоартроз; TNFα = фактор некроза опухоли-альфа; PL = лизат тромбоцитов; PFA = параформальдегид; DAPI = 4′,6-диамидин-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Репрезентативные изображения поглощения электромобилей в разное время. Конфокальные репрезентативные изображения, полученные через 0, 1, 2, 3, 4 и 5 ч эксплантантов остеоартритного хряща, инкубированных с мечеными PKH EV или с контрольной группой. Снимки были сделаны в 400x. Шкала стержней = 50 мкм. Сокращения: ОА = остеоартроз; PL = лизат тромбоцитов; EV = внеклеточный везикул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Характеристика путем анализа отслеживания наночастиц. Сокращения: ОА = остеоартроз; PL = лизат тромбоцитов; EV = внеклеточный везикул; NTA = анализ отслеживания наночастиц.

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.