Методическая статья

Тромбоцитарные внеклеточные везикулы функционализация Ti имплантатов

DOI:

10.3791/62781

⸱

5 августа 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Therapy and Tissue Engineering Group, Research Institute on Health Sciences (IUNICS), University of the Balearic Islands, 2Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa), 3Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (FBSTIB), 4Department of Fundamental Biology and Health Sciences, University of the Balearic Islands

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем метод выделения внеклеточных везикул (EV), полученных из лизатов тромбоцитов (PL), и их использование для покрытия титановых (Ti) поверхностей имплантатов. Мы описываем метод капельного литья, профиль высвобождения EV с поверхностей и биосовместимость in vitro поверхностей EV, покрытых Ti.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (EV) являются биологическими нановезикулами, которые играют ключевую роль в клеточной коммуникации. Их содержание включает активные биомолекулы, такие как белки и нуклеиновые кислоты, которые представляют большой потенциал в регенеративной медицине. Совсем недавно EV, полученные из лизата тромбоцитов (PL), показали остеогенную способность, сравнимую с PL. Кроме того, биоматериалы часто используются в ортопедии или реставрации зубов. Здесь мы предлагаем метод функционализации ti-поверхностей с помощью ЭЛЕКТРОМОБИЛей, полученных из PL, с целью улучшения их остеогенных свойств.

Электромобили выделяются из PL с помощью хроматографии исключения размеров, а затем ti-поверхности функционализируются PL-EV путем капельного литья. Функционализация доказана высвобождением EV и его биосовместимостью с помощью анализа высвобождения лактатдегидрогеназы (LDH).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EV представляют собой мембранные везикулы (30-200 нм), секретируемые любой клеткой и играющие ключевую роль в межклеточной коммуникации, доставляя свой груз. Они содержат различные активные биомолекулы, которые могут включать нуклеиновые кислоты, факторы роста или биологически активные липиды1. По этим причинам электромобили были оценены на предмет их потенциального использования в терапии. С точки зрения ортопедии и регенерации костей, были протестированы электромобили из разных источников. Среди них было показано, что тромбоцитарные EV индуцируют дифференцировочный эффект на стволовые клетки при сохранении низкого цитотоксического профиля2,3. Поэтому необходимы дальнейшие исследования для изучения возможности сочетания EV с биоматериалами с целью их использования в повседневной клинической практике.

Биоматериалы на основе титана широко используются в качестве каркасов для клинических вмешательств по заживлению костей из-за их механических свойств, высокой биосовместимости и долговечности4. Тем не менее, имплантаты Ti являются биоинертным материалом и, следовательно, обладают плохой способностью связываться с окружающей костной тканью5. По этой причине изучаются модификации титана с целью улучшения их характеристик за счет достижения более функционального микросреды на его поверхности4,6,7. В этом смысле электромобили могут быть привязаны к титану химическими8 или физическими взаимодействиями9,10. Иммобилизованные EV, полученные из стволовых клеток или макрофагов, повышают биоактивность Ti, способствуя клеточной адгезии и пролиферации, тем самым вызывая остеогенный эффект8,9,10.

Эта статья будет подробно посвящена стратегии капельного литья для покрытия поверхностей Ti электромобилями, полученными из PL. Кроме того, мы оценим профиль высвобождения электромобилей с поверхности покрытия с течением времени и подтвердим его клеточную биосовместимость in vitro.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лизат тромбоцитов (PL) получают, как описано ранее, в соответствии с институциональными руководящими принципами3 с использованием свежих пушистых покрытий, предоставленных биобанком IdISBa в качестве исходного материала. Их использование для текущего проекта было одобрено его Комитетом по этике (IB 1995/12 BIO).

1. Изоляция электромобилей от PL

  1. Удаление более крупных тел
    1. Разморозить PL при комнатной температуре.
    2. Центрифуга PL при 1 500 х г в течение 15 мин при 4 °C. Выбросьте гранулу, так как она содержит клеточный мусор.
    3. Соберите супернатант и выполните две последовательные центрифугации при 10 000 х г в течение 30 мин при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула соответствует более крупным электромобилям, таким как микровезикулы, и в этом случае она выбрасывается.
    4. Фильтруют супернатант сначала через пористую мембрану 0,8 мкм, а затем через пористую мембрану 0,2 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги удаляют все ненужные электромобили.
    5. Объедините фильтрованный PL и храните при температуре -20 °C до использования.
  2. Исключение размеров хроматография
    1. Уравновешивайте колонну, соединенную с хроматографическим оборудованием, с требуемой скоростью потока с фильтрованным PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый расход зависит от характеристик колонны; в этом случае он установлен на 0,5 мл/мин.
    2. Загрузите обработанный PL (5 мл) шприцем на оборудование.
    3. Введите PL в колонну и начните собирать фракции 5 мл в пробирках по 15 мл.
    4. Соберите фракции, обогащенные электромобилями, и храните их при -80 °C до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении эксперимента в первый раз охарактеризуйте все фракции путем количественной оценки белка и иммунодетекции для определения фракции, обогащенной EV3,11. В этом эксперименте собирается 9-я фракция.
    5. Промыть хроматографическую колонку 30 мл 0,2% раствора NaOH и хранить его в 20% растворе этанола, как только он достигнет равновесия.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Принципиальная схема изоляции внеклеточного везикула (EV) лизата тромбоцитов (PL). PL центрифугируется сначала при 1 500 x g, а затем при 10 000 x g для удаления более крупных тел. Супернатант фильтруется через фильтры 0,8 и 0,2 мкм. Обработанные PL загружаются в колонну, а электромобили разделяются хроматографией исключения размеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Характеристика электромобилей

ПРИМЕЧАНИЕ: Характеристика электромобилей необходима для проведения функциональных исследований12. Ранее сообщалось о электронной микроскопии или характеристике западного пятна13. В настоящем докладе основное внимание будет уделено основным методам характеристик функционализации поверхности Ti.

  1. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
    1. Разбавьте электромобили (1:1000) в 0,2 мкм отфильтрованной PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком концентрированные образцы или слишком разбавленные пробы будут находиться вне диапазона для определения НТА, и потребуется корректировка.
    2. Загрузите 1 мл разбавленных электромобилей шприцем в оборудование NTA и впрыскивайте их в оборудование NTA.
    3. Следуйте протоколу производителя для определения концентрации частиц и распределения по размерам.
  2. Концентрация белка
    1. Определяют концентрацию, используя 1 мкл раствора EV. Измерьте поглощение с помощью спектрофотометра на длине волны 280 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: EV должны иметь низкий уровень белков по сравнению с количеством частиц.
    2. Следуйте инструкциям производителя, чтобы получить показания абсорбции с помощью спектрофотометра.

3. Функционализация поверхности титана

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом методе используются обработанные титановые диски, c.p. grade IV, диаметром 6,2 мм и высотой 2 мм. Дисками можно манипулировать с помощью пинцета Ti, но важно не царапать поверхность. Кроме того, обработанная сторона должна быть обращена вверх в течение всего процесса.

  1. Мойка дисков Ti
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем растворов, используемых для мойки Ti, должен быть достаточным для покрытия Ti-дисков. Поместите диски Ti в стеклянный стакан и налейте на них растворы. Затем удалите раствор путем декантирования.
    1. Промойте имплантаты Ti деионизированной (DI) водой, а затем выбросьте воду.
    2. Промыть имплантаты Ti этанолом на 70%, а затем декантировать для удаления раствора.
    3. Поместите имплантаты в воду DI и соникуйте при 50 °C в течение 5 минут. Выбросьте воду.
    4. Инкубировать имплантаты Ti в 40% растворе NaOH при 50 °C в течение 10 мин с перемешиванием. Выбросьте раствор.
      ВНИМАНИЕ: Раствор NaOH нагревается во время приготовления. Раствор является коррозионным и должен использоваться внутри вытяжной вытяжки.
    5. Обработайте имплантаты ультразвуком в воде DI при 50 °C в течение 5 минут, а затем удалите воду.
    6. Выполните несколько промывок водой DI (не менее 5), пока она не достигнет нейтрального рН. Проверьте pH с помощью индикаторов pH.
    7. Обработайте имплантаты ультразвуком в воде DI при 50 °C в течение 5 минут и удалите воду.
    8. Инкубировать имплантаты Ti в 50% растворе HNO3 при 50 °C в течение 10 мин с перемешиванием. Удалите раствор.
      ВНИМАНИЕ: HNO3 является коррозионным и окислительным веществом, и его следует использовать внутри вытяжного шкафа.
    9. Обрабатывайте имплантаты ультразвуком в воде DI при 50 °C в течение 5 мин. Удалите воду.
    10. Выполните несколько промывок водой DI (не менее 5) до получения нейтрального рН. Проверьте pH с помощью индикаторов pH.
    11. Обрабатывайте имплантаты ультразвуком в воде DI при 50 °C в течение 5 мин. Удалите воду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе эксперимент можно остановить, сохранив имплантаты Ti в 70% растворе этанола.
  2. Ти пассивация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы пассивации Ti выполняются путем полного покрытия дисков Ti различными решениями в порядке, указанном ниже. Диски Ti помещают в стеклянный стакан и аккуратно наливают на них растворы. Объемы, используемые на всех этапах стирки, должны полностью покрывать имплантаты и удаляться с помощью декантирования.
    1. Инкубируйте имплантаты Ti в 30% растворе HNO3 в течение 30 мин при комнатной температуре при мягком перемешивании. Удалите раствор.
    2. Выполните несколько промывок водой DI (не менее 5), пока она не достигнет нейтрального рН. Проверьте pH с помощью индикаторов pH.
    3. Инкубируйте имплантаты Ti на ночь при комнатной температуре в воде DI.
    4. Высушите имплантаты в вакуумных условиях при 40 °C в течение 10 мин.
  3. Капельное литье электромобилей
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для функциональных исследований клеток важно работать в шкафу клеточной культуры.
    1. Поместите имплантаты Ti в 96-луночную пластину, обработанную стороной вверх.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если имплантаты перевернуты вверх дном, можно использовать иглу, чтобы установить их обратно.
    2. Разморозьте раствор электромобилей и смешайте их с перемешиванием. Используйте вихрь для пульса в течение 3 с.
    3. Поместите электромобили на поверхность Ti. В этом исследовании капли 40 мкл раствора EV помещают на Ti для иммобилизации максимум 4 x 1011 EV на имплантат в соответствии с концентрацией, определенной NTA.
    4. Поместите пластины, содержащие Ti, в вакуумных условиях при 37 °C до полного высыхания капель (~2 ч).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время в зависимости от количества имплантатов и воды, присутствующей в вакуумной камере.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Принципиальная схема пассивации Ti и функционализации электромобилей методом капельного литья. Имплантаты Ti сначала пассивируют путем инкубации в течение 30 мин в 30% растворе HNO3 при комнатной температуре. После нескольких смывов водой DI рН достигает нейтрального уровня. Затем имплантаты Ti инкубируют в течение ночи при комнатной температуре в воде DI. После этого имплантаты высушиваются в вакуумных условиях при 40 °C. Для иммобилизации электромобилей 40 мкл раствора EV наносятся на имплантаты Ti. Затем имплантаты инкубируют в вакууме в течение 2 ч, пока EV физически не будут связаны с поверхностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Характеристика поверхности Ti

  1. Исследование релиза
    1. Инкубировать поверхность Ti с 200 мкл фильтрованного PBS при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PBS фильтруется во избежание помех измерению NTA.
    2. Замените PBS в разные моменты времени и храните при -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании были проанализированы 2-, 6-, 10- и 14-дневные временные точки.
    3. Анализ хранимых PBS для исследования частиц NTA в соответствии с инструкциями производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация частиц в PBS в разное время является представлением профиля высвобождения EV с течением времени.
  2. Исследования биосовместимости
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из пуповины человека (hUC-MSC), получают из биобанка IdISBa в соответствии с институциональными руководящими принципами.
    1. Поддерживать hUC-MSC в DMEM с низким содержанием глюкозы, дополненной 20% FBS до использования. Меняйте среду два раза в неделю.
    2. Для посева клеток промыть клетки в колбах с 5 мл PBS дважды.
    3. Трипсинизируют hUC-MSC путем добавления 1 мл раствора трипсина. Убедитесь, что он полностью покрывает монослой клеток. Удалите раствор трипсина и поместите колбу для культивирования клеток при 37 °C примерно на 2 мин. Просмотр отслоения клеток под микроскопом. Отсоединившиеся клетки будут выглядеть округлой формы и будут находиться во взвешенном состоянии.
    4. Повторное суспендирование клеток в DMEM с низким содержанием глюкозы с 1% EV истощенным FBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте носитель, дополненный 1% FBS, а затем ультрацентрифугу при 120 000 х г в течение 18 ч для удаления FBS-EV. Важно удалить ev, чтобы избежать помех с тромбоцитарными EV.
    5. Определение концентрации клеток путем подсчета количества клеток с камерой Нойбауэра14.
    6. Доведите hUC-MSC до концентрации 50 000 клеток/мл.
    7. Посадите 200 мкл клеточного раствора на имплантаты Ti.
    8. Через 48 ч собрать 50 мкл среды и выполнить цитотоксическое определение с использованием набора активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в соответствии с протоколом производителя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод, представленный в данной статье, позволяет получить электромобили функционализированных титановых дисков. Электромобили физически связаны с поверхностью, что обеспечивает устойчивое высвобождение с течением времени. Количество выпущенных электромобилей может быть измерено NTA на 2, 6, 10 и 14 день. Первые измерения, на 2-й день, показывают, что выпущено около 109 электромобилей, за которыми следует пролонгированное высвобождение на 6-й день (~ 108 электромобилей); день 10 (~107 EV) ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол направлен на предоставление четких инструкций по функционализации электромобилей на поверхностях Ti. Представленный метод основан на стратегии капельного литья, которая является физисорбционным типом функционализации. Существует плохая библиография в отношении функционализации электромобилей на поверхностях Ti, хотя есть несколько исследований, показывающих различные преимущества иммобилизации электромобилей на Ti10. Во всяком случае, некоторые из изученных стратегий

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование финансировалось Институтом спасения Карлоса III, Министерством экономики и конкуренции, совместно финансируемым Европейским социальным фондом ESF и Европейским фондом регионального развития ERDF (MS16/00124; СР16/00124; PI17/01605), Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017) и PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), финансируемые за счет налога на устойчивый туризм Балеарских островов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,8 & микро; m шприцфильтр Sartorius16592K
1,5 мл Центрифужная трубкаSPL для медико-биологическихнаук PLC60015
1 мл шприцBD303174
96-луночная культуральная тарелкаSPL для медико-биологических наукPLC30096
Absolut этанолScharlauET0006005PИспользуется для приготовления 20 %  этанола с водой Milli-Q®
AKTA Система очисткиGE Healthcare8149-30-0014
Центрифуга Allegra X-15RBeckman Coutler392934SX4750A качающийся ротор
Центрифуга 5430 REppendorf5428000210F-45-48-11 ротор
Коническая трубка, коническое дно, 50 млSPL Медико-биологические наукиPLC50050
набор для обнаружения цитотоксичности (LDH)Roche11644793001
Одноразовые шприцы 10 млBecton DickinsonBDH307736
DMEM Low Glucose GlutamaxGIBCO21885025
Dulbecco's PBS (1x)Capricorn ScientificPBS-1A
Фетальная бычья сыворотка (FBS) Embrionic CertifiedGIBCO16000044
Filtropur S 0.2 µ м шприц фильтрSarstedt83.1826.001
HiPrep  16/60 Сефакрил  S-400 HRGE Healthcare28-9356-04Колонки из сборного железобетона
мезенхимальные стволовые клетки человека, полученные из пуповины (hUC-MSC)IdISBa Biobank
Nanodrop 2000 спектрофотометрThermoFisherND-2000
NanoSight NS300 анализ отслеживания наночастицMalvernNS300Устройство со встроенным лазером на длине волны λ= 532 нм и камерой sCMOS
ИглаTerumo946077135
азотной кислотой 69,5%ScharlauAC16071000
Optima L-100 XP УльтрацентрифугаBeckman Coulter8043-30-1124SW-32Ti Ротор
Раствор пенициллин-стрептомицина 100XBiowestL0022
pH Тест-полоски 4,5-10,0SigmaP-4536
Лизат тромбоцитов (PL)IdISBa BiobankПолучено из  баффи шуб, выброшенных после сдачи крови
Полипропиленовые центрифугиBeckman Coutler326823
Power wave HTBioTek10340763
Пробирка с завинчивающейся крышкой, 15 мл, (LxØ): 120 x 17 мм, PP, с принтомSarstedt62554502
Sodium hidroxideSharlau SO04251000
Титановые имплантаты репликиImplantmedia, SANATitanium grade IV. Диаметр: 6,2 мм. Высота: 1,95 мм
Trypsin-EDTA 1 xBiowestL0930
Tryton X100SigmaT8787

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  2. Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
  3. Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
  4. Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), Basel, Switzerland. 1709-1800 (2014).
  5. Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590(2020).
  6. Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725(2015).
  7. Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694(2017).
  8. Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
  9. Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
  10. Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571(2020).
  11. Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369(2015).
  12. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  13. Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541(2018).
  14. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).
  15. Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
  16. Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи