Транзиторная трансдукция стробилированных форм Echinococcus granulosus

Summary

Описана методика быстрой транзиторной трансдукции на разных стадиях развития Echinococcus granulosus с использованием лентивирусных векторов третьего поколения.

Abstract

Кистозный эхинококкоз или эхинококковое заболевание является одним из наиболее важных зоонозных паразитарных заболеваний, вызванных Echinococcus granulosus, небольшим ленточным червем, укрывающимся в кишечнике собак. Существует острая необходимость в прикладных генетических исследованиях для понимания механизмов патогенеза и контроля и профилактики заболеваний. Однако отсутствие эффективной системы оценки генов препятствует прямой интерпретации функциональной генетики цестодных паразитов, включая виды Echinococcus . Настоящее исследование демонстрирует потенциал лентивирусной преходящей трансдукции гена в метацестодах и стробилированных формах E. granulosus. Протосколеки (PSC) были выделены из эхинококковых цист и перенесены в специфические двухфазные питательные среды для развития в стробилированных червей. Черви были трансфектированы собранным лентивирусом третьего поколения вместе с клетками HEK293T в качестве контроля процесса трансдукции. Выраженная флуоресценция была обнаружена у стробилированных червей в течение 24 ч и 48 ч, что указывает на преходящую лентивирусную трансдукцию у E. granulosus. Эта работа представляет собой первую попытку переходной трансдукции на основе лентивируса у ленточных червей и демонстрирует многообещающие результаты с потенциальными последствиями в экспериментальных исследованиях биологии плоских червей.

Introduction

Кистозный эхинококкоз (CE) является одним из наиболее важных заболеваний гельминтов, вызванных Echinococcus granulosus, небольшим ленточным червем в семействе Taeniidae ^1,2. Проведены обширные исследования по иммунодиагностике и разработке вакцины для E. granulosus. Однако недостаточные знания о молекулярных основах биологии паразитов создают серьезные ограничения в диагностике, лечении и профилактике эхинококковой болезни 3,4,5,6.

В посл....

Protocol

Это исследование было одобрено Национальным институтом развития медицинских исследований и Комитетом по обзору этики исследований, No 958680. Лентивирусы классифицируются как организмы BSL-2; следовательно, все процедуры лабораторного культивирования в этом протоколе проводились с использованием стерильной лабораторной практики и проводились под ламинарной проточной вытяжкой в соответствии с руководящими принципами NIH. На рисунке 1 показано схематическое представление протокола исследования для различных стадий E. granulosus .

1. Сбор эхинококковых кист

1. Соберите кисты эхинок....

Results

Здесь мы описываем быстрый и эффективный метод транзиторной трансдукции у E. granulosus с использованием лентивирусных векторов третьего поколения. Мы культивировали PSC в двухфазной питательной среде для получения стробилированных червей, как описано ранее^25,26. Протосколеки развиваются в стробилированных червей через 6 недель in vitro. Различные стадии E. granulosus наблюдались в двухфазной культуральной среде, включая инвагинированны.......

Discussion

Понимание молекулярной основы биологии нематод и Platyhelminthes имеет решающее значение для понимания патогенности зоонозных паразитов²⁷. Отсутствие эффективной системы оценки генов является основным препятствием для прямой интерпретации функциональной генетики паразитов цестода, включая виды Echinococcus ^12,27. Настоящее исследование демонстрирует отличный потенциал лентивируса в транзиторной трансдукции E. granulosus.<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-луночные культуральные планшеты	SPL Life Sciences	30012
25 см2 колба для культур	SPL Life Sciences	70325
6-луночные культуральные планшеты	SPL Life Sciences	30006
Хлорид кальция	Sigma-Aldrich	C4901-500G	Рабочая концентрация: 2,5  mM
CMRL 1066 средний	Thermo Fisher Scientific	11530037
CO2 инкубатор	memmert	ICO150
D-(+)-глюкоза	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
DMEM	Life Technology	12100046
Собачья желчь			Выделена от усыпленной собаки и стерилизована на 0,2 мкм; m шприц-фильтр
Eosin Y	Sigma-Aldrich	E4009-5G	приготовьте 0,1% Эозина для теста на исключение рабочего
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	DNAbiotech	DB9723-100ml	Тепловая инактивация  оф  FBS (30 мин в 40°; C)
Фетальная сыворотка теленка (FCS)	DNAbiotech	DB9724-100ml	Тепловая инактивация  оф  FCS (30 мин в 40°; C)
HEK293T клетки	BONbiotech	BN_0012.1.14	Эмбриональная почка человека 293T
HEPES буферизованный физиологический раствор (HBS)	Sigma-Aldrich	51558-50ML	2x
концентрат Инвертированный флуоресцентный микроскоп	OLYMPUS	IX51
Пенициллин	Sigma-Aldrich	P3032-10MU	Рабочая концентрация: 100 МЕ/мл
Pepsin	Roche	10108057001	Рабочая концентрация: 2 мг/мл, pH 2
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	DNAbiotech	DB0011	Этот реагент растворяется менее чем за 1 минуту в D.W
Polybrene (реагент для трансфекции)	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
RPMI среда	BioIdea	BI-1006-05
Бикарбонат натрия (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761-1KG
Стрептомицин	Sigma-Aldrich	S9137-25G	Рабочая концентрация: 100 мкм; г/мл
Лентивирусная плазмида третьего поколения (pCDH513b)	SBI System Biosciences (BioCat GmbH)	CD513B-1-SBI	Вектор переноса (получен коммерчески из Исследовательского отдела молекулярной медицины Иранского академического центра образования, культуры и исследований (ACECR), Мешхед, Иран)
Лентивирусная плазмида третьего поколения (pLPI и pLPII)	Invitrogen (Life Technologies)	K4975-00	Хелперный вектор (коммерчески получен из Исследовательского отдела молекулярной медицины Иранского академического центра образования, культуры и исследований (ACECR), Мешхед, Иран)
Лентивирусная плазмида третьего поколения (pMD2G)	Addgene	Plasmid 12259	Хелперный вектор (получен коммерчески из Исследовательского отдела молекулярной медицины Иранского академического центра образования, культуры и исследований (ACECR), Мешхед, Иран)
Tris/EDTA Buffer (TE)	DNAbiotech	DB9713-100мл
Трипсин	Сигма-Олдрич	T9935-50MG	1x рабочие растворы (pH 7,4– 7.6)