Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Транзиторная трансдукция стробилированных форм Echinococcus granulosus

3.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62783

⸱

16 сентября 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Student Research Committee, School of Medicine, Kerman University of Medical Sciences, 2Research Center for Hydatid Disease in Iran, Kerman University of Medical Sciences, 3Department of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine, Kurdistan University of Medical Sciences, 4State Key Laboratory for Zoonotic Diseases, Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education, Institute of Zoonosis, College of Veterinary Medicine, Jilin University

В этой статье

Краткое содержание

Описана методика быстрой транзиторной трансдукции на разных стадиях развития Echinococcus granulosus с использованием лентивирусных векторов третьего поколения.

Аннотация

Кистозный эхинококкоз или эхинококковое заболевание является одним из наиболее важных зоонозных паразитарных заболеваний, вызванных Echinococcus granulosus, небольшим ленточным червем, укрывающимся в кишечнике собак. Существует острая необходимость в прикладных генетических исследованиях для понимания механизмов патогенеза и контроля и профилактики заболеваний. Однако отсутствие эффективной системы оценки генов препятствует прямой интерпретации функциональной генетики цестодных паразитов, включая виды Echinococcus . Настоящее исследование демонстрирует потенциал лентивирусной преходящей трансдукции гена в метацестодах и стробилированных формах E. granulosus. Протосколеки (PSC) были выделены из эхинококковых цист и перенесены в специфические двухфазные питательные среды для развития в стробилированных червей. Черви были трансфектированы собранным лентивирусом третьего поколения вместе с клетками HEK293T в качестве контроля процесса трансдукции. Выраженная флуоресценция была обнаружена у стробилированных червей в течение 24 ч и 48 ч, что указывает на преходящую лентивирусную трансдукцию у E. granulosus. Эта работа представляет собой первую попытку переходной трансдукции на основе лентивируса у ленточных червей и демонстрирует многообещающие результаты с потенциальными последствиями в экспериментальных исследованиях биологии плоских червей.

Введение

Кистозный эхинококкоз (CE) является одним из наиболее важных заболеваний гельминтов, вызванных Echinococcus granulosus, небольшим ленточным червем в семействе Taeniidae 1,2. Проведены обширные исследования по иммунодиагностике и разработке вакцины для E. granulosus. Однако недостаточные знания о молекулярных основах биологии паразитов создают серьезные ограничения в диагностике, лечении и профилактике эхинококковой болезни 3,4,5,6.

В последние годы, благодаря развитию секвенирования генома и транскриптомных методов, был проведен широкий спектр молекулярных исследований плоских червей несколькими исследовательскими группами 7,8,9. Однако в мире паразитов достижения в технологии переноса генов у паразитических плоских червей все еще ограничены по сравнению с высоковоспроизводимыми методами транзиторной трансдукции, разработанными для некоторых простейших 10,11,12.

Использование систем доставки вирусов стало важным инструментом для доставки трансгенов и исследований генов / белков за последние два десятилетия13. Лентивирус заражает как делящиеся, так и неделящиеся клетки, что позволяет инфицировать постмитотические клетки 14,15,16. Последние данные свидетельствуют о том, что использование системы трансдукции на основе лентивируса в клетках млекопитающих дает возможность преодолеть большинство ограничений предыдущих методов нокдауна/ нокдауна. Проектирование и построение лентивирусных векторов экспрессии с соответствующими молекулярными маркерами, такими как экспрессия GFP, были описаны ранее16. Поэтому мы оцениваем лентивирусную транзиторную трансдукцию гена-репортера GFP у протосколек и стробилированных червей E. granulosus.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование было одобрено Национальным институтом развития медицинских исследований и Комитетом по обзору этики исследований, No 958680. Лентивирусы классифицируются как организмы BSL-2; следовательно, все процедуры лабораторного культивирования в этом протоколе проводились с использованием стерильной лабораторной практики и проводились под ламинарной проточной вытяжкой в соответствии с руководящими принципами NIH. На рисунке 1 показано схематическое представление протокола исследования для различных стадий E. granulosus .

1. Сбор эхинококковых кист

  1. Соберите кисты эхинококка печени у естественно инфицированных овец, которых обычно забивают на скотобойне.
  2. Полностью стерилизуют поверхность кисты с использованием стерильной марли и 70% спирта перед аспирацией протосколек (PSC).
  3. Аспират 20-50 мл эхинококковой жидкости выходит в стерильные конические трубки по 50 мл.
  4. После дренирования смойте кисту острым лезвием, переместите зародышевый слой в стерильную коническую трубку объемом 50 мл и встряхните ее в течение короткого периода (~ 2 мин), чтобы увеличить сбор PSC. Переместите зародышевый слой в новую трубку объемом 1,5 мл для молекулярной характеристики.
  5. Промыть ЦОНы 3-5x фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS).
  6. Наблюдайте за PSC в 0,1% эозина в течение 5 мин, чтобы определить жизнеспособность PSC под световым микроскопом. Используйте PSC с не менее чем 95% жизнеспособностью для культуры.
  7. Обработать осадок ПСК 2 мл пепсина (2 мг/мл, рН 2) в течение 15-20 мин.
  8. Чтобы изолировать отдельные PSC, повторно суспендируйте осадок PSC в PBS и пропустите его через два слоя стерильной марли в новую стерильную коническую трубку объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте среднее значение трех отсчетов на 50 мкл отложений PSC с помощью светового микроскопа. Для последующих испытаний используйте оценочное значение для определения PSC/μL. Каждый изолят эхинококковой кисты должен быть охарактеризован на основе нуклеотидных полиморфизмов молекулярными методами, такими как ПЦР-секвенирование17 или анализ кривой плавления с высоким разрешением18.

2. Двухфазное культивирование ЦОНов E. granulosus для получения взрослых червей

ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированные ЦОНы следует культивировать в стерильных условиях в ламинарной проточной камере класса II. Подготовьте твердую и жидкую фазы двухфазной питательной среды отдельно, прежде чем переходить к следующим шагам19.

  1. Подготовьте двухфазную культуральную среду, состоящую из двух фаз.
    1. Для твердой фазы добавьте 10 мл бычьей сыворотки в колбу объемом 25 мл и оставьте ее свертываться при 76 °C в течение 20-30 мин.
    2. Для жидкой фазы (модифицированной CMRL) смешайте 100 мл термоинактивированной фетальной сыворотки для телят (FCS), 36 мл 5% дрожжевого экстракта, 5,6 мл 30% глюкозы (в дистиллированной воде), 1,4 мл 5% собачьей желчи в PBS, 20 мМ буфера HEPES и 10 мМ NaHCO3 в 260 мл среды CMRL-1066. Наконец, добавьте в смесь пенициллин (100 МЕ/мл) и стрептомицин (100 мг/мл).
  2. Добавьте 10 мл жидкофазной среды в каждую колбу для культивирования25 см2 .
  3. Добавьте ~5000 PSC в колбу для культивирования и перенесите колбу в инкубатор CO2 (37 °C, 5% CO2).
  4. Через 24-48 ч переложить ЦОНы в новую колбу с твердой фазой (бычьей сывороткой) и добавить 1 мл той же свежей жидкофазной среды на колбу. Перенесите колбы в инкубаторCO2 (37 °C, 5% CO2).
  5. Каждые 5-7 дней заменяют среду свежей жидкофазной средой на основе изменения цвета питательной среды и расчетной доли дифференцированных ЦОНов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протосколеки быстро реагируют на изменения окружающей среды после культивирования, и большинство из них подвергаются дифференциации в течение 2-3 недель. Из-за потребления питательных веществ и роста и развития протосколек изменяется рН питательной среды, а ее цвет смещается в сторону оранжевого и желтого.

3. Монофазное выращивание ЦОНов E. granulosus

  1. Убедитесь, что монофазное культивирование проводится за 24-48 ч до трансдукции.
    1. Культивируйте ~5000 PSC в колбе для культивирования25 см2 с RPMI и 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS).
    2. Переместите колбы в инкубатор CO2 (37 °C, 5% CO2) до использования.

4. Клеточная культура для производства и подготовки вируса

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки эмбриональной почки человека 293T (HEK293T) были получены для векторного производства из Исследовательского центра патологии и стволовых клеток Университета медицинских наук Кермана.

  1. Перенесите 5 × 105 клеток HEK293T в колбу размером25 см2 , содержащую 5 мл DMEM с 10% FBS, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
  2. Инкубируют клетки HEK293T при 37 °C в 5% CO2 и пропускают их в полной питательной среде каждые 48 ч. Наконец, используйте низкопроходные клетки HEK293T для трансдукции20.

5. Производство и подготовка вируса с лентивирусными векторами третьего поколения

ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспрессии гена-репортера GFP использовались лентивирусный вектор pCDH513b (переносной вектор) и PLPII, PLPI и PMD2G (вспомогательные векторы). См. таблицу материалов и дополнительный рисунок S1.

  1. День 1:
    1. После трипсинизации клеток HEK293T21 в 6-луночных культуральных пластинах, семена 7 × 104 клеток на лунку со свежим DMEM без антибиотиков, содержащим 10% FBS.
    2. Используют клетки при 50%-60% слиянии для трансдукции методом фосфата кальция.
  2. День 2:
    1. Замените среду культивирования клеток за 2-3 ч до начала эксперимента свежим безантибиотиков DMEM, содержащим 2% FBS.
    2. В пробирке объемом 1,5 мл смешайте лентивирусные плазмиды третьего поколения, включая 7 мкг/мкл pCDH513b (вектор переноса), 4 мкг/мкл PLPII, 4 мкг/мкл PLPI и 2 мкг/мкл PMD2G (вспомогательные векторы).
    3. Добавьте буфер HEPES (0,28 М NaCl, 0,05 М HEPES и 1,5 мМ Na2HPO4; оптимальный диапазон рН, 7,00-7,28) в смесь до объема 422 мкл.
    4. Добавьте в смесь 16 мкл 1% буфера Tris-EDTA (TE).
    5. Добавьте в пробирки 62 мкл хлорида кальция 2,5 мМ и хорошо перемешайте.
    6. Добавьте 500 мкл 2x HEPES-буферного физиологического раствора (HBS) в смесь, капля за каплей, в течение 1-2 минут с помощью пипетки Пастера. Осторожно перемешать до получения полунепрозрачного раствора и инкубировать смесь в течение 20 мин при комнатной температуре.
    7. Медленно добавляйте смесь в каждую тарелку и распределяйте ее медленными круговыми движениями.
    8. Инкубируют пластины при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе и заменяют среду через 4-6 ч dmEM без антибиотиков, содержащим 10% FBS.
  3. День 3:
    1. Подтвердите успешную транзиторную трансдукцию и жизнеспособность клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа.
  4. День 4:
    1. Собирайте вирусы из питательной среды, собирая супернатант каждой скважины и храните их при -70 °C до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные лентивирусы могут быть сконцентрированы и титрованы для точной трансфекции22.

6. Транзиторная трансдукция различных стадий E. granulosus вирусом

  1. День 1:
    1. Используйте 12-луночную культуральную пластину для переноса генов. Культура 5 × 103-5 × 104 HEK293T клеток в трех экземплярах, с полной средой DMEM в качестве внутреннего эталона.
    2. Культивируйте 150 свежих ЦОНов в трех экземплярах в RPMI и 10% FBS.
    3. Культивирование 30 стробилированных червей в трипликате в DMEM, содержащих 10% термоинактивированных FBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все трансдукционные среды должны быть свободны от антибиотиков. Держите в процессе три необработанных контрольных колодца для клеток HEK293T, PSC и стробилированных червей.
    4. Готовят смесь из 1 × 106 вирусов с трансфекционным реагентом 4 мкг/мл (см. Таблицу материалов) для трансдукции клеток HEK293T и различных стадий червя.
    5. Медленно добавляйте смесь в каждую тарелку и распределяйте ее медленными круговыми движениями. Инкубировать пластины в течение 4-6 ч в инкубатореСО2 (37 °C, 5% CO2). Замените среду для каждого образца одной и той же полной питательной средой, чтобы свести к минимуму токсическое воздействие трансфекционного реагента.
  2. День 2:
    1. Повторите шаги 6.1.4-6.1.5 для повышения эффективности переходной трансдукции для клеток HEK293T, PSC и стробилированных червей.
    2. Инкубируют все пластины в течение 24-48 ч в инкубатореCO2 с одинаковыми условиями культивирования в зависимости от типа клеточной среды.
  3. День 3:
    1. Проверьте, успешна ли трансдукция, используя флуоресцентную микроскопию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность использования дальнейших подтверждающих анализов, таких как ПЦР / qPCR20,23 или методы западного блоттинга24 в процедуре переноса генов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь мы описываем быстрый и эффективный метод транзиторной трансдукции у E. granulosus с использованием лентивирусных векторов третьего поколения. Мы культивировали PSC в двухфазной питательной среде для получения стробилированных червей, как описано ранее25,26. Протосколеки развиваются в стробилированных червей через 6 недель in vitro. Различные стадии E. granulosus наблюдались в двухфазной культуральной среде, включая инвагинированны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Понимание молекулярной основы биологии нематод и Platyhelminthes имеет решающее значение для понимания патогенности зоонозных паразитов27. Отсутствие эффективной системы оценки генов является основным препятствием для прямой интерпретации функциональной генетики паразитов цестода, включая виды Echinococcus 12,27. Настоящее исследование демонстрирует отличный потенциал лентивируса в транзиторной трансдукции E. granulosus.<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Исследование, о котором сообщается в этой публикации, было поддержано Комитетом по грантам Elite Researcher под номером 958680 от Национального института развития медицинских исследований (NIMAD), Тегеран, Иран.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12-луночные культуральные планшетыSPL Life Sciences30012
25 см2 колба для культурSPL Life Sciences70325
6-луночные культуральные планшетыSPL Life Sciences30006
Хлорид кальцияSigma-AldrichC4901-500GРабочая концентрация: 2,5  mM
CMRL 1066 среднийThermo Fisher Scientific11530037
CO2 инкубаторmemmertICO150
D-(+)-глюкозаSigma-AldrichG8270-1KG
DMEMLife Technology12100046
Собачья желчьВыделена от усыпленной собаки и стерилизована на 0,2 мкм; m шприц-фильтр
Eosin YSigma-AldrichE4009-5Gприготовьте 0,1% Эозина для теста на исключение рабочего
Фетальная бычья сыворотка (FBS)DNAbiotechDB9723-100mlТепловая инактивация  оф  FBS (30 мин в 40°; C)
Фетальная сыворотка теленка (FCS)DNAbiotechDB9724-100mlТепловая инактивация  оф  FCS (30 мин в 40°; C)
HEK293T клеткиBONbiotechBN_0012.1.14Эмбриональная почка человека 293T
HEPES буферизованный физиологический раствор (HBS)Sigma-Aldrich51558-50ML2x
концентрат Инвертированный флуоресцентный микроскопOLYMPUSIX51
ПенициллинSigma-AldrichP3032-10MUРабочая концентрация: 100 МЕ/мл
PepsinRoche10108057001Рабочая концентрация: 2 мг/мл, pH 2
Фосфатно-солевой буфер (PBS)DNAbiotechDB0011Этот реагент растворяется менее чем за 1 минуту в D.W
Polybrene (реагент для трансфекции)Sigma-AldrichTR-1003-G
RPMI средаBioIdeaBI-1006-05
Бикарбонат натрия (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761-1KG
СтрептомицинSigma-AldrichS9137-25GРабочая концентрация: 100 мкм; г/мл
Лентивирусная плазмида третьего поколения (pCDH513b)SBI System Biosciences (BioCat GmbH)CD513B-1-SBIВектор переноса (получен коммерчески из Исследовательского отдела молекулярной медицины Иранского академического центра образования, культуры и исследований (ACECR), Мешхед, Иран)
Лентивирусная плазмида третьего поколения (pLPI и pLPII)Invitrogen (Life Technologies)K4975-00Хелперный вектор (коммерчески получен из Исследовательского отдела молекулярной медицины Иранского академического центра образования, культуры и исследований (ACECR), Мешхед, Иран)
Лентивирусная плазмида третьего поколения (pMD2G)AddgenePlasmid 12259Хелперный вектор (получен коммерчески из Исследовательского отдела молекулярной медицины Иранского академического центра образования, культуры и исследований (ACECR), Мешхед, Иран)
Tris/EDTA Buffer (TE)DNAbiotechDB9713-100мл
ТрипсинСигма-ОлдричT9935-50MG1x рабочие растворы (pH 7,4– 7.6)

Ссылки

  1. Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315(2017).
  2. Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020(2021).
  3. Eckert, J., Thompson, R. C. A. Historical aspects of echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 1-64 (2017).
  4. Romig, T., et al. Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species. Advances in Parasitology. 95, 213(2017).
  5. Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q. Echinococcosis: control and prevention. Advances in Parasitology. 95, 55(2016).
  6. Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95 (1), 315(2017).
  7. Tsai, I. I. J., et al. The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism. Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).
  8. Koziol, U., Brehm, K. Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research. Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).
  9. Zheng, H., et al. The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).
  10. Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania. International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).
  11. Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens. Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).
  12. Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P. Transfection of Platyhelminthes. BioMed Research International. 2015, 206161(2015).
  13. Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection. Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).
  14. Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J. Establishing transgenic schistosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (8), 1230(2011).
  15. Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T. Lentiviral transduction of microglial cells. Glia. 50 (1), 48-55 (2005).
  16. Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).
  17. Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).
  18. Rostami, S., et al. High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato. Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).
  19. Mousavi, S. M., et al. Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus. Parasites and Vectors. 13 (1), 190(2020).
  20. Afgar, A., et al. MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition. Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).
  21. Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755(2008).
  22. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1499(2009).
  23. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031(2012).
  24. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).
  25. Dezaki, E. S., et al. Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms. Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).
  26. Mousavi, S. M., et al. Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
  27. Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths. Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).
  28. Elegheert, J., et al. Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins. Nature Protocols. 13 (12), 2991(2018).
  29. Mizukami, C., et al. Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference. Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).
  30. Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. Echinococcus as a model system: biology and epidemiology. International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).
  31. Thompson, R. C. A. Biology and systematics of Echinococcus. Advances in Parasitology. Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. 95, 65-109 (2017).
  32. Brehm, K., Koziol, U. Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels. Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).
  33. Moguel, B., et al. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps. SpringerPlus. 4, 496(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Лентивирусные векторыстробилированные червигидатидный цистицеркозизоляция протосколексовдвухфазная культураперенос геновфлуоресцентная микроскопиягенетика цестод
Транзиторная трансдукция стробилированных форм Echinococcus granulosus
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.