Определение трехстороннего взаимодействия между двумя мономерами транскрипционного фактора MADS-бокса и белка датчика кальция методом анализа BiFC-FRET-FLIM

Белково-белковые взаимодействия (ИПП) составляют основу правильного функционирования эукариотических клеток, регулируя различные метаболические процессы и процессы развития. Некоторые ИЦП являются стабильными, в то время как другие носят преходящий характер. Взаимодействия могут быть классифицированы на основе количества и типа членов во взаимодействии, таких как димерные, тримерные, тетрамерные гомомерные и гетеромерные^1. Идентификация и характеристика белковых взаимодействий может привести к лучшему пониманию функций белка и регуляторных сетей.

Факторы транскрипции — это белки, которые участвуют в регуляторных функциях. Они регулируют скорость транскрипции своих нисходящих генов, связываясь с ДНК. Иногда олигомеризация или образование белков комплексов высшего порядка является предпосылкой для выполнения их функций^2. Факторы транскрипции РАСТЕНИЙ MADS-box представляют собой гомеотические гены, которые регулируют различные процессы, такие как переход флоры, развитие цветочных органов, удобрение, развитие семян, старение и вегетативное развитие. Известно, что они образуют комплексы высшего порядка, которые связываются с ДНК^3,4. Изучение сетей PPI среди факторов транскрипции и их интеракторов дает представление о сложности, лежащей в основе транскрипционной регуляции.

Транзиторная экспрессия белка в Nicotiana benthamiana была популярным подходом к изучению локализации белка или белково-белковых взаимодействий in vivo^5. BiFC и FRET являются методами изучения белково-белковых взаимодействий in vivo с использованием флуоресцентных репортерных систем^6. Было показано, что комбинация этих двух методов раскрывает взаимодействие между тремя белками^7. FRET измеряется с использованием акцепторного фотоотбеливания, сенсибилизированного излучения и метода флуоресцентной визуализации (FLIM). Анализ FRET на основе FLIM появился как инструмент, который обеспечивает точную количественную оценку и пространственно-временную специфичность для измерений передачи энергии между двумя молекулами на основе их флуоресцентного времени жизни^8. FLIM измеряет время, в течение которого флуорофор остается в возбужденном состоянии до испускания фотона, и лучше, чем методы, которые используют только измерения интенсивности^9,10. Помимо гетерологичных систем, таких как Nicotiana benthamiana и луковые эпидермальные пилинги, более поздние отчеты продемонстрировали использование корней Arabidopsis и молодых саженцев риса и т. Д. Для анализа in vivo белково-белковых взаимодействий в нативных условиях^11,12.

Помимо подходящей системы выражения, выбор взаимодействующих партнеров для анализов BiFC и FRET также имеет решающее значение для успеха этого эксперимента. PPI среди партнеров, используемых в конфигурации BiFC, должен быть проверен с использованием соответствующих элементов управления перед их использованием в качестве сопряженного партнера в эксперименте FRET^13. BiFC использует структурное дополнение N- и C-концевых частей флуоресцентного белка. Общим ограничением в большинстве, если не во всех флуоресцентных белках, используемых в анализах BiFC, была самосборка между двумя производными нефлуоресцентными фрагментами, способствующая ложноположительной флуоресценции и уменьшающая отношение сигнал-шум (S / N)^14. Последние разработки, включая точечные мутации или положение расщепления флуоресцентного белка, дали начало парам BiFC с повышенной интенсивностью, более высокой специфичностью, высоким соотношением S/N^15,16. Эти флуоресцентные белки также могут быть использованы для проведения BiFC в зависимости от пригодности эксперимента.

Традиционно CFP и YFP использовались в качестве пары донора и акцептора в экспериментах FRET^17. Тем не менее, было обнаружено, что YFP или m-цитрин являются лучшими донорами FRET (при использовании с RFP в качестве акцептора) из-за высокого квантового выхода (QY) во время нативной экспрессии целевых белков в корневой системе Arabidopsis. Выбор промоторов (конститутивных и нативных/эндогенных) и флуорофоров также играет решающую роль в разработке успешного эксперимента BiFC-FRET-FLIM. Важно отметить, что эффективность доноров FRET и пригодность пар FRET, как правило, меняются с изменением промотора и биологической системы, используемой для экспрессии. QY флуорофора, который относится к его яркости, зависит от рН, температуры и используемой биологической системы. Мы предлагаем тщательно рассмотреть эти критерии, прежде чем выбирать пару флуорофоров для эксперимента FRET. Биологическая система, промоторы и белки, используемые для этого протокола, хорошо работали с флуорофорами CFP-YFP для эксперимента BiFC FRET-FLIM.

В настоящем исследовании мы включили функцию FLIM для визуализации взаимодействия между тремя белковыми молекулами с использованием FRET на основе BiFC. В этом методе два белка помечаются разделенным белком YFP, а третий белок — CFP. Поскольку мы были заинтересованы в изучении взаимодействия гомодимера белка MADS-box (M) с белком датчика кальция (C), эти белки были помечены флуоресцентными белками в векторах pSITE-1CA и pSITE-3CA^18. Два из взаимодействующих партнеров в этом анализе были помечены N- и C-концевыми частями YFP в векторах pSPYNE-35S и pSPYCE-35S^19,и их взаимодействие приводит к восстановлению функционального YFP, который действует как акцептор FRET, к третьему взаимодействующему партнеру, который помечен CFP (действуя как донор FRET)(рисунок 1 ). В этом конкретном случае PPI между двумя мономерами M и между M и C был проверен путем выполнения BiFC в трех различных системах вместе с дрожжево-двухгибридной системой. Эти векторы были мобилизованы в штамм Agrobacterium tumifaciens GV3101 путем электропорации. Штамм GV3101 имеет обезоруженную Ti плазмиду pMP90 (pTiC58DT-ДНК) с резистентностью к гентамицину^20. Штамм p19 Agrobacterium добавляли вместе со всеми инфильтрациями для предотвращения глушения трансгенов^21. Мы рекомендуем, чтобы три белка также использовались в противоположных конформациях для проверки трехсторонних взаимодействий.

В этом методе мы использовали FLIM, где сначала время жизни флуоресценции донора (срок службы неутоленного донора) измеряется при отсутствии акцептора. После этого его срок службы измеряется в присутствии акцептора (закаленный срок жизни донора). Эта разница в времени жизни донорской флуоресценции используется для расчета эффективности FRET, которая зависит от количества фотонов, демонстрирующих сокращение времени жизни флуоресценции. Ниже приведен подробный протокол для определения образования троичного комплекса между любыми тремя белками путем временной экспрессии флуоресцентных помеченных белков в Nicotiana benthamiana и анализа их взаимодействия с помощью BiFC-FRET-FLIM.

1. Клонирование генов во входных и целевых векторах(рисунок 2)

1. Амплифицировать кодирующую последовательность (CDS) интересующих генов (генов M и C в нашем случае) с помощью ПЦР и клонировать их в соответствующих входных векторах (например, векторе pENTR/D-TOPO; см. таблицу 1 для векторов, используемых в этом эксперименте).
2. Выращивайте клоны на пластинах, содержащих антибиотики. Валидировать клоны, которые отбираются на антибиотиках путем рестрикции пищеварения и секвенирования ДНК^22,23.
3. Мобилизовать восстановленные CDS из входных клонов к векторам назначения (pSPYNE-35S, pSPYCE-35S, pSITE-1CA и pSITE-3CA) и подтвердить перенос последовательностей от входа к векторам назначения путем переваривания фермента рестрикции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все векторы, используемые в этом эксперименте, перечислены в таблице 1.
4. Наконец, преобразование клеток Agrobacterium GV3101 (pMP90 (Gent^R))с векторами назначения путем электропорации(рисунок 3)^24.

2. Условия роста растений Nicotiana benthamiana

ПРИМЕЧАНИЕ: Выращивайте растения Nicotiana до 4-6 листовой стадии в контрольных условиях.

1. Для выращивания растений Nicotiana подготовьте почвенную смесь, смешав коммерчески доступные почвенные смеси с кокопеатом и компостом в соотношении 2:1:1.
2. Выложите слой этой почвенной смеси толщиной 1 дюйм в пластиковый лоток, чтобы сделать почвенное ложе и насытить его деионизированной водой. Посыпьте около 200 семян в эту почвенную грядку.
3. Переложите его в больший лоток, содержащий 1 см стоячей воды. Накройте этот лоток полиэтиленовой пленкой, чтобы создать влагозащищенную камеру.
4. Перенесите эту установку в камеру роста, установленную при 23 °C с 16-часовым световым и 8-часовым темным циклом с интенсивностью света 150-170^{мкмоль/м2}с.
5. Через две недели перенесите молодые саженцы в небольшие, 3-4-дюймовые горшки, содержащие насыщенную водой почвенную смесь.
6. Поместите эти горшки в пластиковые лотки и переложите их в камеру роста еще на четыре недели.

3. Подготовка бактериальных штаммов к агроинфильтрации

ПРИМЕЧАНИЕ: Для агроинфильтрации бактериальные штаммы должны быть свежевыращены и смешаны вместе со штаммом p19 Agrobacterium в соответствующих соотношениях.

1. Приготовьте агаровые пластины 2xYT, содержащие рифампицин (100 мкг/мл), гентамицин (25 мкг/мл) и канамицин (50 мкг/мл) для агробактерий, содержащих вектор pSPYNE-35S и pSPYCE-35S. Для штамма, содержащего вектор pSITE, используйте рифампицин (100 мкг/мл), гентамицин (25 мкг/мл) и спектиномицин (50 мкг/мл).
2. Прореживайте штаммы Agrobacterium, содержащие плазмиды на этих пластинах, используя стерильные петли прививки в ламинарной вытяжке.
3. Инкубируйте их при температуре 28 °C в течение 48 ч в темноте.
4. Начните эту процедуру с инокуляции штамма Agrobacterium GV3101, содержащего конструкции BiFC и FRET (приготовленные в векторах pSPYNE-35S, pSPYCE-35S и pSITE) из полосатых пластин в 10 мл бульона 2xYT, содержащего соответствующие антибиотики (рифампицин (100 мкг/мл), гентамицин (25 мкг/мл), канамицин (50 мкг/мл) или спектиномицин (50 мкг/мл)).
5. Кроме того, инициируют культуру штамма агробактерий p19 путем инокуляции 10 мл бульона 2xYT, содержащего рифампицин (100 мкг/мл) и канамицин (50 мкг/мл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: штамм p19 добавляется для предотвращения глушения трансгенов.
6. Накройте колбу алюминиевой фольгой и держите ее в шейкере инкубатора при температуре 28 °C и 170 об/мин в течение 16 часов в темноте.
7. После ночного роста переложите 1 мл этой культуры в одноразовую кювету для измерения оптической плотности (O.D.) культур при 600 нм с помощью спектрофотометра.
8. Смешайте культуры соответствующего партнера BiFC и FRET, содержащие штаммы, таким образом, чтобы конечный O.D. каждой культуры составлял 0,5, а p19 - 0,3 в общем объеме 2 мл.
9. Для достижения этих соотношений используйте формулу, указанную ниже:
   
   _{Полученный} OD = O.D. культуры, измеренной при 600 нм
   V_{культура} = Объем требуемой культуры
   Od_final = 0,5 для конструкций и 0,3 для p19
   V_final = Конечный объем для инфильтрации, который составляет 2 мл
   ПРИМЕЧАНИЕ: Комбинации конструкций, используемые в данном исследовании, указаны в таблице 2.
10. Центрифугируйте смешанные культуры Agrobacterium при 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и осторожно выбрасывайте супернатант. Повторно суспендировать гранулу в 2 мл свежеприготовленного инфильтрационного буфера (10 мМ MES, 100 мкМ ацетосиргинона и 10 мМ_MgCl2). Используйте вихревой смеситель, чтобы сделать однородную клеточную суспензию.
11. Инкубируют трубки, содержащие повторно суспендированные клетки, в темноте при комнатной температуре в течение 3 ч.
12. Между тем, маркируйте каждый горшок с растением конструкционной смесью, в которую он будет проникать. Используйте два растения для каждой инфильтрационной смеси.
13. Наполните 1 мл безыгольчатого шприца агробактериальной смесью. Осторожно, но плотно прижмите шприц к абаксиальной стороне полностью расширенного листа, поддерживая лист с другой стороны. Осторожно толкайте плунжер до тех пор, пока растворы не заполнятся в области листа, эквивалентной 2-3-кратному кончику шприца.
14. Проникают до четырех пятен на листе и 3-4 листа на растение, как показано на рисунке 4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Меняйте перчатки или протирайте перчатки 70% спиртом между образцами, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
15. Переложите все горшки в лоток и высиживайте в камере роста в тех же условиях, которые указаны в шаге 2.
16. Проверьте небольшую часть агроинфильтрованного листа в разные моменты времени с помощью флуоресцентного микроскопа. Когда флуоресценция как от YFP, так и от CFP обнаруживается в клетках, перейдите к конфокальному микроскопу для анализа BiFC-FRET FLIM. В этом эксперименте анализ проводили через 3 дня после агроинфильтрации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установите период инкубации после агроинфильтрации индивидуально для каждого промотора и комбинации генов, чтобы избежать чрезмерной экспрессии химерных белков, используемых в анализе BiFC-FRET FLIM. Сверхэкспрессия партнерских белков может привести к ложноположительным взаимодействиям.

4. Подготовьте слайды для флуоресцентной визуализации

1. Когда растения будут готовы к визуализации, вырежьте квадратные образцы листьев, на расстоянии 5-8 мм от инфильтрационной раны, и установите их в дистиллированную воду на чистых горках.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму фоновую флуоресценцию, очистите слайды 80% этанолом, а затем дистиллированной водой 3-4 раза, высушите их на воздухе и держите на абсорбирующем листе.
2. Накройте образец листа чистым обшивочным листом и запечатайте ногтевой эмалью.
3. Визуализируйте эти образцы под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом.

5. Анализ FRET-FLIM с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: В данной процедуре основой определения и количественной оценки взаимодействия между двумя белками является сокращение времени жизни флуоресценции партнера-донора FRET при его взаимодействии с акцептором, которое используется для расчета эффективности FRET. Сложность в случае трехстороннего взаимодействия еще больше возрастает, потому что FRET-акцептор в этом случае представляет собой не одну молекулу, а расщепленную пару YFP-BiFC, которая сначала должна быть восстановлена in vivo, чтобы стать функциональным FRET-акцепторным флуорофором. Для проведения FRET-FLIM необходимо определить время жизни флуоресценции донорской молекулы - сначала в одиночку, а затем в присутствии партнера FRET.

1. Откройте приложение FLIM в конфокальном лазерном сканирующем микроскопе, запустите консоль и используйте подсчет фотонов с распознаванием образов для измерения срока службы флуоресценции. Выберите стандартный режим измерения «Подсчет всех фотонов».
2. Проанализируйте образцы двух типов агроинфильтрированных растений: один только с донором (C-CFP), а другой с донором и акцептором (C-CFP, наряду с M-YFP).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку взаимодействие М-белка уже было подтверждено с С-белком с использованием BiFC и Y2H, ожидается хорошая эффективность FRET с этой взаимодействующей парой.
3. Затем отсканируйте агроинфильтрированный лист C-CFP и сосредоточьтесь на клетке, показывающей хорошую флуоресценцию CFP. Инициировать режим лазерного сканирования и настроить систему визуализации CFP и измерений FLIM (λ_ex 440 нм импульсный лазер, λ_em 480-520 нм гибридными детекторами, скорость сканирования 512 x 512 пикселей при 400 Гц).
4. Отрегулируйте фокусировку, масштабирование и интеллектуальное усиление, чтобы сосредоточиться на области, которую необходимо захватить.
5. Освещайте образец при достаточной мощности лазера для достижения захвата примерно 0,1 фотона на импульс. Для образцов с переменной интенсивностью флуоресценции захватите 50 кадров для сбора адекватных фотонов, необходимых для измерения срока службы. CFP демонстрирует два срока службы флуоресценции из-за его конформационной адаптации; поэтому подгоняйте данные с помощью n-экспоненциальной модели реконволюции, сохраняя при этом значение n равным 2.
6. При этих настройках CFP показывает два времени жизни 1,0 и 3,2 нс. Здесь более высокий, 3,2 нс, срок службы используется для всех последующих расчетов^25,26.
7. Чтобы рассчитать эффективность FRET с помощью FLIM, который является мерой степени взаимодействия между двумя белками, возьмите образец листа, который был совместно инфильтрирован с C-CFP и M-YFP. Ищите ячейку, которая экспрессирует как C-CFP, так и M-YFP, и подтверждайте их соответствующие модели излучения, возбуждая их с помощью импульсного лазера λ_ex 440 нм, λ_em 480-520 нм и λ_ex 514 нм лазера белого света с λ_em 526-550 нм. Последовательно сканируйте и идентифицируйте клетку, которая показывает флуоресценцию CFP и YFP.
8. После подтверждения флуоресценции обоих белков переключитесь на консоль FLIM для измерения времени жизни CFP, используя те же настройки, которые мы использовали ранее для измерения времени жизни C-CFP (шаг 5.5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта клетка также экспрессирует M-YFP, который потенциально может взаимодействовать с C-CFP и вызывать сокращение времени жизни C-CFP.
9. Подойдите к графу, полученному с помощью n-экспоненциальной модели реконволюции, с n = 2. Наблюдалось снижение времени жизни CFP с 3,2 до 2,6 нс, что указывает на резонансную передачу энергии Фёрстера между CFP и YFP(рисунок 5A).
10. Теперь запустите консоль FRET в программном обеспечении и рассчитайте эффективность FRET, вручную введя срок службы неугашенного донора в уравнение, представленное в программном обеспечении. А наблюдаемая эффективность FRET составляет: 56%.
11. Трехстороннее взаимодействие
    1. Наконец, чтобы визуализировать взаимодействие между тремя партнерами, возьмите образец листьев у растения, которое было совместно инфильтрировано с C-CFP, M-YFPn и M-YFPc.
    2. Сканируйте эксплант листьев на предмет клетки, которая показывает как CFP, так и восстановленную флуоресценцию YFP, исходящую от взаимодействия BiFC между двумя M-белками. Используйте те же длины волн лазера и излучения, что и ранее.
    3. Впоследствии выключите 514-нм лазер и перейдите на консоль FLIM.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если димер M-YFP взаимодействует с C-CFP, следует увидеть сокращение времени жизни C-CFP, наблюдаемое во время его взаимодействия с M-YFP. Однако, если C-CFP не взаимодействует с димером M-YFP, его время жизни флуоресценции должно оставаться на уровне 3,2 нс.
    4. Используя настройки, аналогичные упомянутым выше, измерьте срок службы CFP в присутствии восстановленного YFP. Подойдите к графу, полученному с помощью n-экспоненциальной модели реконволюции, с n = 2, и перейдите к консоли FRET.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдается снижение срока службы CFP с 3,2 до 2,3 нс. Рассчитайте эффективность FRET, как описано выше. Расчетный КПД FRET составляет 55%. Сокращение срока службы донора и хорошая эффективность FRET на 55% подтверждают трехстороннее взаимодействие между двумя М-белками и С-белком in vivo (см. Рисунок 5В).

Этот протокол представляет собой оптимизированный метод изучения in vivo трехсторонних белково-белковых взаимодействий в растениях. Основной принцип протокола заключается в объединении двух методов белкового взаимодействия с флуоресцентной меткой, то есть BiFC и FRET, для создания анализа для измерения образования троичного комплекса между тремя белковыми партнерами. Здесь мы использовали FLIM для измерения срока службы флуоресценции партнера-донора FRET в присутствии и отсутствии акцептора FRET. Ожидалось сокращение времени жизни флуоресценции донора, если между двумя белками наблюдалось положительное взаимодействие. Мы начали с измерения времени флуоресценции донора, то есть белка C-CFP. Мы использовали режим измерения «Подсчет всех фотонов», который создает кривую флуоресцентного распада со всеми фотонами в интересующей области (ROI) и дает измеренное время жизни с меньшей погрешностью, чем традиционный коррелированный по времени подсчет одиночных фотонов. Высокоскоростной фильтр FLIM обеспечивает использование однофотонных событий между импульсами. Затем была выбрана подходящая математическая модель для попиксельных вычислений и подгонки кривой распада27.

Вариант CFP, используемый здесь (и также наиболее часто используемый), имеет конформационную адаптацию, которая приводит к двум срокам жизни флуоресценции. Поэтому мы решили подогнать кривую флуоресцентного распада, используя модель для многоэкспоненциального донора. Это приводит к разделению двух времен жизни CFP, которые в нашем случае наблюдались как 1,0 нс и 3,3 нс. Для расчета эффективности FRET мы использовали более высокий срок службы CFP, т.е. 3,3 нс (средний срок службы флуоресценции, n = 10).

В случае положительного контроля (C-CFP и M-YFP) мы наблюдаем снижение времени жизни флуоресценции донора (C-CFP) с 3,3 нс до 2,5 нс(рисунок 6). А эффективность FRET по следующему уравнению составила 56%.

E = эффективность ЛАД
τD = Срок службы неугашенного донора (образец только донора, C-CFP)
τ AvAmp = Среднее время распада - Средневзвешенный срок службы по амплитуде

Аналогичное упражнение с восстановленным YFP в результате взаимодействия между двумя мономерами M и С-белком также привело к положительному взаимодействию, ведущему к сокращению времени жизни флуоресценции акцептора (C-CFP) до 2,6 нс. Расчетная эффективность FRET в данном случае составила около 55%(рисунок 6).

Если вариант CFP или любой другой донорский флуорофор имеет одно время жизни флуоресценции, кривая распада должна быть подогнана с использованием моноэкспоненциальной донорской модели. В этом случае эффективность FRET может быть рассчитана по формуле:

τ - время жизни флуоресценции образца, содержащего только донора
τ закалка измеряется в присутствии акцептора (во время fret происходит)

Необработанные показания срока службы флуоресценции по меньшей мере из 10 ячеек для каждой экспериментальной установки были сопоставлены в виде точечной диаграммы с помощью онлайн-инструмента PlotsOfData (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/, рисунок 6C)28. Сокращение времени жизни флуоресценции донора FRET дает убедительные доказательства трехстороннего взаимодействия между этими тремя белками.

Рисунок 1:Схематическое представление принципа метода BiFC и BiFC FRET-FLIM. Взаимодействие между двумя M-белками приводит к восстановлению YFP, и эта пара может затем действовать как акцепторная молекула. Третий белок C-CFP выступает здесь в качестве донора FRET. Таким образом, положительный сигнал FRET доказывает трехстороннее взаимодействие между двумя М-белками и одним С-белком. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Клонирование генов M и C в векторах конечного назначения. Кодирующие последовательности генов амплифицируются и сначала клонируются в векторе pENTR/D-TOPO с последующей мобилизацией конструкций в векторах конечного назначения pSITE-1CA, pSITE-3CA, pSPYNE-35S и pSPYCE-35S реакцией рекомбинации LR Clonase II. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Используя электропорацию, желаемые векторные комбинации доставляются в штамме GV3101 Agrobacterium tumefaciens. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Схематическая иллюстрация агроинфильтрации растений Nicotiana и комбинаций конструкций, используемых для эксперимента. (A)C-CFP, содержащая агробактериальную культуру, выступает в качестве донорского образца (B) C-CFP и M-YFP служат положительным контролем FRET, (C) C-CFP и M белок в конформации BiFC; M-YFPn и M-YFPc используются для изучения трехстороннего взаимодействия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5:Представление времени жизни флуоресценции образцов при отсутствии и наличии акцептора. (A) Время жизни C-CFP в присутствии M-YFP уменьшается до 2,67 нс, как показано на гистограмме. Аналогично(B)показывает сокращение времени жизни C-CFP до 2,3 нс в случае трехстороннего взаимодействия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6:Трехстороннее взаимодействие между двумя мономерами M и С-белком, проанализированным с использованием анализа FRET-FLIM на основе BiFC. (A)Клетка, показывающая либо только CFP (i), либо оба CFP и YFP (ii и iii), исходящие от донорских и акцепторных белков с использованием соответствующих длин волн возбуждения и излучения. (B)i, ii, iii представляет собой FLIM-изображение, показывающее время флуоресценции CFP в ячейке. Шкала цветов представляет псевдоцвет, соответствующий времени жизни. Шкала bar = 50 мкм. (C) Диаграмма рассеяния, показывающая время флуоресценции CFP при наличии в одиночку или с взаимодействующими партнерами, где n = 10. Сюжет генерируется с помощью онлайн-инструмента PlotsOfdata (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/); Среднее время жизни флуоресценции представлено в виде линии между точками образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Отрицательный контрольный эксперимент для валидации взаимодействия между белками M и C с помощью BiFC. Взаимодействие между мутированной формой M-белка (MΔCBD), в которой отсутствуют все области связывания С-белка, и слиянием С-белка-YFPc пытается служить отрицательным контролем для анализа BiFC. Верхние панели показывают переходную экспрессию MΔCBD-GFP в клетках луковой кожуры, а результаты попытки взаимодействия между MΔCBD-YFPn и C-YFPc показаны на нижних панелях. Отсутствие флуоресценции от восстановленного YFP свидетельствует об отсутствии взаимодействия между MΔCBD и С-белком. N, ядро; C, цитоплазма; BF, яркое поле; FL, флуоресценция; OL, цифровое наложение, цитоплазматическая область показана белыми стрелками. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Таблица 1: Векторы, использованные в исследовании.

Таблица 2: Комбинации конструкций, используемые в исследовании.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.