Количественная оценка макропиноцитоза в гиперактивных клетках mTORC1 с помощью проточной цитометрии

Amine Belaid; Harilaos Filippakis

doi:10.3791/62793

Методическая статья

Количественная оценка макропиноцитоза в гиперактивных клетках mTORC1 с помощью проточной цитометрии

DOI:

10.3791/62793

⸱

2 августа 2021 г.

Amine Belaid² , Harilaos Filippakis¹

¹Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, ²Metcalf Science Center, Chemistry Department, Boston University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предоставляет экспериментальные инструменты для оценки поглощения макропиноцитарных питательных веществ (углеводов и белков) гиперактивными клетками mTORC1. Подробно описаны шаги по количественной оценке поглощения флуоресцентно меченного декстрана и бычьего сывороточного альбумина (БСА).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Макропиноцитоз является высококонсервативным, актин-зависимым эндоцитарным процессом, который позволяет поглощать внеклеточный материал, включая белки и липиды. В пролиферирующих клетках макропиноцитоз может доставлять внеклеточные питательные вещества в лизосому, перерабатываемые в важнейшие строительные блоки макромолекул. Недавние исследования выявили зависимость множественных видов рака от макропиноцитоза, включая рак молочной железы, колоректальный рак и рак поджелудочной железы. Считается, что мутации Ras являются движущими событиями инициации макропиноцитоза, приводящими к активации клеточных анаболических процессов через сигнальный путь mTORC1. Интересно, что mTORC1 также может быть активирован путем макропиноцитоза независимо от Ras. Таким образом, макропиноцитоз представляет собой метаболическую уязвимость, которая может быть использована для нацеливания на макропиноцитарные опухоли путем ограничения их доступа к питательным веществам терапевтическим путем.

При комплексе туберозного склероза (ТСК) и лимфангиолейомиоматозе (ЛАМ) гиперактивация mTORC1 приводит к усилению макропиноцитоза и метаболическому перепрограммированию. В данной статье мы описываем основанный на проточной цитометрии протокол для количественной оценки макропиноцитоза в клетках млекопитающих. Используются TSC2-дефицитные MEF, которые демонстрируют аберрантную активацию mTORC1 и, как было показано, увеличивают макропиноцитоз по сравнению с клетками, экспрессирующими TSC2. Клетки, обработанные фармакологическими ингибиторами макропиноцитоза, инкубируют с флуоресцентно меченным, фиксируемым лизином, декстрана 70 кДа или флуоресцентно меченным бычьим сывороточным альбумином (БСА), анализируемым методом проточной цитометрии. На сегодняшний день разработаны надежные методы на основе изображений для количественной оценки макропиноцитоза в опухолевых клетках in vitro и in vivo. Этот анализ обеспечивает количественную оценку макропиноцитоза в различных экспериментальных условиях и дополняет существующие методы, основанные на изображениях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Макропиноцитоз — это эндоцитарный процесс, направленный на массовое поглощение внеклеточного материала с последующим образованием макропиносом, либо перерабатываемых в плазматическую мембрану, либо сливающихся с лизосомами для разложения интернализованного груза ^1,2. Несмотря на то, что поглощение груза является неселективным, макропиноцитоз является многоступенчатым процессом, жестко регулируемым Rab ГТФазами и мембранными фосфолипидами ^3,4. Примечательно, что раковые клетки используют макропиноцитоз для усвоения внеклеточных питательных веществ, вклю....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Клеточная обработка

День 1

Затравите TSC2-дефицитные и TSC2-экспрессирующие эмбриональные фибробласты (MEF) мышей в трех экземплярах, в каждой лунке шестилуночного планшета для культивирования тканей с использованием DMEM, с добавлением 10% FBS. К 3-му дню клетки должны быть слиты на 60-70%.
1. Засейте дополнительные контрольные лунки для каждого состояния препарата, который не будет окрашен FITC-Dextan или TMR-BSA.

День 2

Тщательно отсадите среду и дважды промойте клетки PBS при комнатной темпер....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ритансерин ингибирует макропиноцитоз в клетках с дефицитом TSC2
Ранее мы показали, что макропиноцитарное поглощение питательных веществ увеличивается в три раза в клетках с дефицитом TSC2 по сравнению с клетками, экспрессирующими TSC2 ¹⁶. При ТСК и ЛАМ макропиноцитоз опосредован диацилглицеринкиназой альфа (ДГКА). Продуктом метаболизма ДГКА является фосфатидная кислота (ПА), важнейший компонент клеточных мембран. Таки.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье мы описываем количественный подход к оценке макропиноцитоза с помощью проточной цитометрии. Этот метод обеспечивает точное и быстрое измерение флуоресцентно меченного макропиноцитарного грузового декстрана и альбумина. В предыдущих исследованиях был тщательно охарактеризован макропиноцитарный индекс раковых клеток с использованием подходов конфокальной микроскопии^15,20. Хотя эти методы точно количественно определя.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Премия LAM Foundation за развитие карьеры. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com. Критическое чтение было выполнено Хилэром К. Ламом.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM	Gibco	11965-092	Питательная среда
EIPA (амилорид)	Sigma Aldrich	A3085	Ингибитор макропиноцитоза
FBS	R& D Systems	S11150	Фетальная бычья сыворотка
FITC-декстран	Инвитроген	D1822	Флуоресцентный полисахарид (70 кДа)
Парафолмадегид	Пирс	28906	Фиксирующий агент
PBS	Gibco	10010-023	Фосфатный буфер Физиологический раствор
Пеницилин/Стрептомицин	Sigma Aldrich	P4458-100ML	Антибиотики
клеточной культурыФосфатидная кислота	Avanti	840101P	Фосфолипид, полученный из яйца
Ритансерин	Tocris	1955	Ингибитор DGKA
TMR-BSA	Invitrogen	A23016	Флуоресцентный альбумин
Трипсин	Sigma Aldrich	25300-054	Агент диссоциации

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yoshida, S., Pacitto, R., Inoki, K., Swanson, J. Macropinocytosis, mTORC1 and cellular growth control. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (7), 1227-1239 (2018).
Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-t....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Количественная оценка макропиноцитоза в гиперактивных клетках mTORC1 с помощью проточной цитометрии

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи