Method Article

Автоматизированное культивирование микробов и адаптивная эволюция с использованием системы микробной микробной культуры (MMC)

DOI:

10.3791/62800

⸱

February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает, как использовать систему микробной микробной культуры (MMC) для проведения автоматизированного культивирования микробов и адаптивной эволюции. MMC может культивировать и субкультурировать микроорганизмы автоматически и непрерывно и отслеживать их рост в режиме онлайн с относительно высокой пропускной способностью и хорошим распараллеливанием, снижая потребление труда и реагентов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обычные методы культивирования микробов обычно имеют громоздкие операции, низкую пропускную способность, низкую эффективность и большое потребление труда и реагентов. Кроме того, высокопроизводительные методы культивирования на основе микропластин, разработанные в последние годы, имеют плохой статус роста микробов и распараллеливание эксперимента из-за их низкого содержания растворенного кислорода, плохой смеси и сильного испарения и теплового эффекта. Благодаря многим преимуществам микрокапелей, таким как небольшой объем, высокая пропускная способность и сильная управляемость, микрофлюидная технология на основе капель может преодолеть эти проблемы, которая использовалась во многих видах исследований высокопроизводительного микробного культивирования, скрининга и эволюции. Однако большинство предшествующих исследований остаются на стадии лабораторного строительства и применения. Некоторые ключевые проблемы, такие как высокие эксплуатационные требования, высокая сложность строительства и отсутствие технологии автоматизированной интеграции, ограничивают широкое применение капельной микрофлюидной технологии в микробных исследованиях. Здесь была успешно разработана автоматизированная система микробной микробной культуры (MMC) на основе капельной микрофлюидной технологии, обеспечивающая интеграцию таких функций, как посев, культивирование, онлайн-мониторинг, субкультурирование, сортировка и отбор проб, необходимые для процесса культивирования микробных капель. В этом протоколе в качестве примеров были взяты Escherichia coli дикого типа (E. coli) MG1655 и метанол-эссенциальный штамм E. coli (MeSV2.2), чтобы представить, как использовать MMC для проведения автоматизированного и относительно высокопроизводительного микробного культивирования и адаптивной эволюции в деталях. Этот метод прост в эксплуатации, потребляет меньше труда и реагентов, а также имеет высокую экспериментальную пропускную способность и хорошую параллельность данных, что имеет большие преимущества по сравнению с обычными методами культивирования. Он обеспечивает недорогую, удобную в эксплуатации и надежную экспериментальную платформу для научных исследователей для проведения соответствующих микробных исследований.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Культивирование микроорганизмов является важной основой для микробиологических научных исследований и промышленного применения, которое широко используется в выделении, идентификации, реконструкции, скрининге и эволюции микроорганизмов 1,2,3. Обычные методы культивирования микробов в основном используют пробирки, колбы для встряхивания и твердые пластины в качестве контейнеров для культивирования в сочетании с встряхивающими инкубаторами, спектрофотометрами, считывателями микропластин и другим оборудованием для культивирования, обнаружения и скрининга микробов. Однако эти мет....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Установка приборов и программного обеспечения

  1. Выберите чистую и стерильную среду (например, чистую скамейку) в качестве выделенного постоянного пространства для MMC. Установите MMC стабильно в пространстве.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите MMC подальше от помех сильных электрических полей, магнитных полей и источников сильного теплового излучения. Избегайте сильной вибрации, влияющей на оптические компоненты обнаружения. Обеспечьте питание переменного тока AC220 В, 50 Гц для MMC. Для получения подробной информации о MMC обратитесь к Таблице материалов и веб-сайту MMC16.
  2. Установите операционное прог....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол использует E. coli MG1655 и штамм MeSV2.2 в качестве примеров для демонстрации культивирования микробов и адаптивной эволюции, необходимой для метанола, с автоматизированной и относительно высокой пропускной способностью в MMC. Измерение кривой роста в основном использовалось для характеристики культивирования микробов. Адаптивная эволюция проводилась путем автоматизированного непрерывного субкультурирования и добавления высокой концентрации метанола в качестве селективного давления во время каждой.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе представлено, как использовать систему микробной микробной культуры (MMC) для выполнения автоматизированного культивирования микробов и долгосрочной адаптивной эволюции. MMC представляет собой миниатюрную, автоматизированную и высокопроизводительную систему культивирования микробов. По сравнению с обычными методами и инструментами культивирования микробов с высокой пропускной способностью, MMC имеет много преимуществ, таких как низкое потребление труда и реагентов, простота эксплуатации, онлайн-обнаружен.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2018YFA0901500), Национальным проектом ключевых научных приборов и оборудования Национального фонда естественных наук Китая (21627812) и Программой научных исследований Инициативы Университета Цинхуа (20161080108). Мы также благодарим профессора Юлию А. Ворхольт (Институт микробиологии, департамент биологии, ETH Zurich, Zurich 8093, Швейцария) за предоставление метанол-эссенциального штамма E. coli версии 2.2 (MeSV2.2).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 μ m Фильтрующая мембрана из ПВДФMerck Millipore Ltd.SLGPR33RBСтерилизуем масло MMC
4 > C холодильникHaierBCD-289BSWДля хранения реагентов
AgarBecton, Dickinson and Company214010Для получения твердых пластин
CaCl2· 2H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20011160Компонент специальной среды для MeSV2.2.
Чистая скамейкаBeijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.DL-CJ-INDIIДля асептической эксплуатации и УФ-стерилизации
CoCl2· 6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10007216Компонент специальной среды для MeSV2.2.
КомпьютерLenovoE450Установка программного обеспечения и управление MMC
Инкубатор постоянной температурыShanghai qixin scientific instrument co., LTDLRH 250Для культивирования микроорганизмов с использованием твердой среды
CuSO4· 5H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10008218Компонент специальной среды для MeSV2.2.
Весыэлектронные OHAUSAR 3130Для взвешивания реагентов
Пробирка EPThermo Fisher1,5 млДля сбора капель
FeCl3· 6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10011928Компонент специальной среды для MeSV2.2.
Морозильная трубкаThermo Fisher2.0 млДля сохранения штамма
ГлюконатSigma-AldrichS2054Компонент специальной среды для MeSV2.2.
ГлицеринGENERAL-REAGENTG66258AДля сохранения
штамма Паровой стерилизационный горшок высокого давленияSANYO ElectricMLS3020Для автоклавной стерилизации
изопропил-&бета;-d-тиогалактопиранизид (IPTG)Биотоп420322Компонент специальной среды для MeSV2.2.
Канамицина сульфатSolarbioK8020Компонент специальной среды для MeSV2.2.
KH2PO4MACKLINP815661Компонент специальной среды для MeSV2.2.
МетанолMACKLINM813895компонент специальной среды для MeSV2.2.
MgSO4· 7H2OBIOBYING1305715Компонент специальной среды для MeSV2.2.
Система микрокапельного культивирования (MMC)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.  MMC-IОпределение кривой роста и адаптивная эволюция. Пожалуйста, обратитесь к http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Микрофлюидный чипLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-ALE-ODДля различных операций с каплями. Пожалуйста, обратитесь к
http://www.tmaxtree.com/en/ MMC oilLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-M/S-ODМасляная фаза для капельной микрофлюидики. Пожалуйста, обратитесь к http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20026118Компонент специальной среды для MeSV2.2.
NaClОБЩИЙ РЕАГЕНТG81793Jкомпонент среды LB
Na2HPO4· 12H2OGENERAL-REAGENTкомпонент специальной среды для MeSV2.2.
NH4ClSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10001518Компонент специальной среды для MeSV2.2.
Чашка ПетриCorning Incorporated90 ммДля приготовления твердой среды
Пипеткаэппендорф2,5 мм; L, 10 μ L, 100μ L, 1000μ LДля работы с жидкостями
Быстроразъемный соединитель ALuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.—Для соединения каждого стыка. Пожалуйста, обратитесь к
http://www.tmaxtree.com/en/ флакону с реагентамиLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-PCBОтбор проб и хранение растворов бактерий и реагентов. Пожалуйста, обратитесь к http://www.tmaxtree.com/en/
Колба для встряхиванияUnion-Biotech50 млДля культивирования микроорганизмов
Встряхивающий инкубаторShanghai Sukun Industrial Co., Ltd.SKY-210 2BДля культивирования микроорганизмов в колбе
стрептомицина сульфат SolarbioS8290Компонент специальной среды для MeSV2.2.
ШприцJIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD10 млНаберите жидкость и введите ее в флакон с реагентом
Игла для шприцаOUBEL Hardware Store22GВнутренний диаметр составляет 0,41 мм, а внешний диаметр 0,71 мм.
ТриптонОксоид Лтд.LP0042Компонент среднетемпературного
холодильникаSANYO Ultra-lowMDF-U4086SДля сохранения деформации (-80 > C)
UV– Вид спектрофотометрGeneral Electric компанииUltrospec 3100 proДля измерения значений ОД
Витамин В1SolarbioSV8080Компонент специальной среды для MeSV2.2.
Дрожжевой экстрактOxoid Ltd.LP0021Компонент среды LB
ZnSO4· 7H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10024018Компонент специальной среды для MeSV2.2.
G10267B LB

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbial Microdroplet CultureAutomated Microbial CultivationAdaptive Laboratory EvolutionDroplet MicrofluidicsGrowth Curve MeasurementEscherichia Coli CultivationHigh Throughput ScreeningOnline MonitoringSub CultivationDroplet Extraction

Related Articles