Method Article

Автоматизированное культивирование микробов и адаптивная эволюция с использованием системы микробной микробной культуры (MMC)

DOI:

10.3791/62800

⸱

February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает, как использовать систему микробной микробной культуры (MMC) для проведения автоматизированного культивирования микробов и адаптивной эволюции. MMC может культивировать и субкультурировать микроорганизмы автоматически и непрерывно и отслеживать их рост в режиме онлайн с относительно высокой пропускной способностью и хорошим распараллеливанием, снижая потребление труда и реагентов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обычные методы культивирования микробов обычно имеют громоздкие операции, низкую пропускную способность, низкую эффективность и большое потребление труда и реагентов. Кроме того, высокопроизводительные методы культивирования на основе микропластин, разработанные в последние годы, имеют плохой статус роста микробов и распараллеливание эксперимента из-за их низкого содержания растворенного кислорода, плохой смеси и сильного испарения и теплового эффекта. Благодаря многим преимуществам микрокапелей, таким как небольшой объем, высокая пропускная способность и сильная управляемость, микрофлюидная технология на основе капель может преодолеть эти проблемы, которая использовалась во многих видах исследований высокопроизводительного микробного культивирования, скрининга и эволюции. Однако большинство предшествующих исследований остаются на стадии лабораторного строительства и применения. Некоторые ключевые проблемы, такие как высокие эксплуатационные требования, высокая сложность строительства и отсутствие технологии автоматизированной интеграции, ограничивают широкое применение капельной микрофлюидной технологии в микробных исследованиях. Здесь была успешно разработана автоматизированная система микробной микробной культуры (MMC) на основе капельной микрофлюидной технологии, обеспечивающая интеграцию таких функций, как посев, культивирование, онлайн-мониторинг, субкультурирование, сортировка и отбор проб, необходимые для процесса культивирования микробных капель. В этом протоколе в качестве примеров были взяты Escherichia coli дикого типа (E. coli) MG1655 и метанол-эссенциальный штамм E. coli (MeSV2.2), чтобы представить, как использовать MMC для проведения автоматизированного и относительно высокопроизводительного микробного культивирования и адаптивной эволюции в деталях. Этот метод прост в эксплуатации, потребляет меньше труда и реагентов, а также имеет высокую экспериментальную пропускную способность и хорошую параллельность данных, что имеет большие преимущества по сравнению с обычными методами культивирования. Он обеспечивает недорогую, удобную в эксплуатации и надежную экспериментальную платформу для научных исследователей для проведения соответствующих микробных исследований.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Культивирование микроорганизмов является важной основой для микробиологических научных исследований и промышленного применения, которое широко используется в выделении, идентификации, реконструкции, скрининге и эволюции микроорганизмов 1,2,3. Обычные методы культивирования микробов в основном используют пробирки, колбы для встряхивания и твердые пластины в качестве контейнеров для культивирования в сочетании с встряхивающими инкубаторами, спектрофотометрами, считывателями микропластин и другим оборудованием для культивирования, обнаружения и скрининга микробов. Однако эти методы имеют много проблем, таких как громоздкие операции, низкая пропускная способность, низкая эффективность и большое потребление труда и реагентов. Высокопроизводительные методы культивирования, разработанные в последние годы, в основном основаны на микропластине. Но микропластина имеет низкий уровень растворенного кислорода, плохие перемешивающие свойства, а также сильное испарение и тепловое воздействие, которые часто приводят к плохому состоянию роста и экспериментальному распараллеливанию микроорганизмов 4,5,6,7; с другой стороны, он должен быть оснащен дорогостоящим оборудованием, таким как рабочие станции для обработки жидкостей и считыватели микропластин, для достижения автоматизированного выращивания и обнаружения процессов 8,9.

Как важная отрасль микрофлюидной технологии, капельная микрофлюидика была разработана в последние годы на основе традиционных микрофлюидных систем непрерывного потока. Это дискретная проточная микрофлюидная технология, которая использует две несмешивающиеся жидкие фазы (обычно масло-вода) для генерации дисперсных микрокапелей и работы на них10. Поскольку микрокапли имеют характеристики малого объема, большой удельной площади поверхности, высокой внутренней скорости массопереноса и отсутствия перекрестного загрязнения, вызванного компартментализацией, а также преимущества сильной управляемости и высокой пропускной способности капель, было проведено много видов исследований с применением микрофлюидной технологии капель в высокопроизводительном культивировании, скрининге и эволюции микроорганизмов11 . Тем не менее, все еще существует ряд ключевых проблем, чтобы сделать микрофлюидную технологию капель популяризированной и широко применяемой. Во-первых, работа капельной микрофлюидики громоздка и сложна, что приводит к высоким техническим требованиям к операторам. Во-вторых, капельная микрофлюидная технология сочетает в себе оптические, механические и электрические компоненты и должна быть связана со сценариями применения биотехнологии. Одной лаборатории или команде трудно построить эффективные системы микрофлюидного контроля капель, если нет междисциплинарного сотрудничества. В-третьих, из-за небольшого объема микрокапли (от пиколитра (pL) до микролитра (μL)) требуется много трудностей для реализации точного автоматизированного управления и онлайн-обнаружения капель в режиме реального времени для некоторых основных микробных операций, таких как субкультуризация, сортировка и отбор проб, а также трудно построить интегрированную систему оборудования12.

Для решения вышеуказанных проблем была успешно разработана автоматическая система микробной микрокапельной культуры (MMC) на основе капельной микрофлюидной технологии13. MMC состоит из четырех функциональных модулей: модуля распознавания капель, модуля обнаружения спектра капель, модуля микрофлюидного чипа и модуля выборки. Благодаря системной интеграции и управлению всеми модулями точно устанавливается автоматизированная система управления, включая генерацию, культивирование, измерение (оптическая плотность (OD) и флуоресценция), расщепление, слияние, сортировку капель, достигая интеграции таких функций, как посев, культивирование, мониторинг, субкультурирование, сортировка и отбор проб, необходимые для процесса выращивания микробных капель. MMC может вмещать до 200 реплицированных единиц выращивания капель объемом 2-3 мкл, что эквивалентно 200 единицам культивирования колбы. Система культивирования микрокаплет может удовлетворять требованиям к незагрязнению, растворенному кислороду, смешиванию и массо-энергетическому обмену во время роста микроорганизмов и удовлетворять различные потребности микробных исследований с помощью многочисленных интегрированных функций, например, измерения кривой роста, адаптивной эволюции, однофакторного многоуровневого анализа и исследования и анализа метаболитов (на основе обнаружения флуоресценции)13,14.

Здесь протокол подробно описывает, как использовать MMC для проведения автоматизированного и микробного культивирования и адаптивной эволюции (рисунок 1). Мы взяли кишечную палочку дикого типа (E. coli) MG1655 в качестве примера, чтобы продемонстрировать измерение кривой роста и метанол-эссенциальный штамм E. coli MeSV2.215, чтобы продемонстрировать адаптивную эволюцию в MMC. Было разработано операционное программное обеспечение для MMC, которое делает операцию очень простой и понятной. Во всем процессе пользователю необходимо приготовить исходный раствор бактерий, установить условия MMC, а затем ввести раствор бактерий и связанные с ним реагенты в MMC. Впоследствии MMC будет автоматически выполнять такие операции, как генерация капель, распознавание и нумерация, культивирование и адаптивная эволюция. Он также будет выполнять онлайн-обнаружение (OD и флуоресценция) капель с высоким временным разрешением и отображать соответствующие данные (которые могут быть экспортированы) в программном обеспечении. Оператор может остановить процесс культивирования в любое время в соответствии с результатами и извлечь целевые капли для последующих экспериментов. MMC прост в эксплуатации, потребляет меньше труда и реагентов, а также имеет относительно высокую экспериментальную пропускную способность и хорошую параллель данных, что имеет значительные преимущества по сравнению с обычными методами культивирования. Он обеспечивает недорогую, удобную в эксплуатации и надежную экспериментальную платформу для исследователей для проведения соответствующих микробных исследований.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Установка приборов и программного обеспечения

  1. Выберите чистую и стерильную среду (например, чистую скамейку) в качестве выделенного постоянного пространства для MMC. Установите MMC стабильно в пространстве.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите MMC подальше от помех сильных электрических полей, магнитных полей и источников сильного теплового излучения. Избегайте сильной вибрации, влияющей на оптические компоненты обнаружения. Обеспечьте питание переменного тока AC220 В, 50 Гц для MMC. Для получения подробной информации о MMC обратитесь к Таблице материалов и веб-сайту MMC16.
  2. Установите операционное программное обеспечение из файла MMC.zip
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свяжитесь с авторами для получения файла MMC.zip.
    1. Создайте выделенную папку и сохраните в ней zip-файл.
    2. Создайте еще одну выделенную папку в виде "Каталог установки". Распакуйте консоль MMC.zip и сохраните файлы в новой папке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конфигурация компьютера лучше всего подходит: (1) 64-разрядная операционная система Windows 7 или выше; (2) Процессор: i5 или выше; (3) память: 4 ГБ или выше; (4) жесткий диск: 300 ГБ или выше (скорость вращения более 7200 об/мин или твердотельный диск).

2. Препараты

  1. Соедините шприцевую иглу (внутренний диаметр 0,41 мм, наружный диаметр 0,71 мм), быстрый соединитель А и флакон с реагентом (рисунок 2С) и автоклавируйте их при 121 °C в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слегка открутите крышку флакона с реагентом во время стерилизации. Каждый раз можно готовить еще несколько бутылок с реагентами для использования.
  2. Используйте фильтр 0,22 мкм поливинилиденфторида (PVDF) для фильтрации масла MMC. Поместите микрофлюидный чип (рисунок 2B) и масло MMC в чистую скамью заранее и стерилизуйте их ультрафиолетовым облучением в течение 30 минут перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о быстром разъеме А, бутылке с реагентом, масле MMC и микрофлюидном чипе приведена в Таблице материалов.
  3. Установка микрофлюидного чипа
    1. Откройте дверцу операционной камеры (рисунок 2А) и поднимите оптоволоконный зонд.
    2. Выровняйте отверстия электрического поля с помощью игл электрического поля и аккуратно поместите чип на пьедестал чипа. Затем вставьте две позиционирующие колонны в позиционирующие отверстия и положите оптический волоконный зонд (рисунок 2D).
    3. Подключите быстрый разъем A на микросхеме к соответствующему порту MMC согласно номеру положения (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Затем закройте дверцу операционной камеры.
  4. Пополните масло MMC (примерно до 80 мл) в бутылке с маслом и опорожните отработанную жидкость в бутылке для отходов перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкость для отходов обычно представляет собой органические отходы. Пожалуйста, обратитесь к региональному законодательству и нормативным актам при утилизации, которые могут быть изменены на основе экспериментальной установки.

3. Измерение кривой роста в MMC

  1. Подготовка к исходному бактериальному раствору
    1. Следуйте соответствующим стандартным правилам для подготовки среды Luria-Bertani (LB) и автоклава при 121°C в течение 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Компоненты среды LB: NaCl (10 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л) и триптон (10 г/л).
    2. Извлеките штамм E. coli MG1655 из глицеринового бульона и культивируйте его в колбе 50 мл с 10 мл среды LB в встряхивающем инкубаторе (200 об/мин) при 37 °C в течение 5-8 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время культивирования зависит от конкретных штаммов. Оптимально культивировать штамм до логарифмического периода/фазы.
    3. Культивируют культивируемым раствором E. coli MG1655 со свежей средой до OD600 0,05-0,1 для получения исходного раствора бактерий (готовят около 10 мл).
  2. Щелкните Инициализация , чтобы инициализировать консоль MMC. После появления интерфейса инициализации установите температуру культивирования на уровне 37 °C и значение фотоэлектрического сигнала на 0,6 (рисунок 3A). Инициализация займет около 20 минут.
  3. Включите УФ-лампу (длина волны 254 нм) во время инициализации.
  4. Введите исходный раствор бактерий и масло MMC во флакон с реагентом.
    1. Выньте стерилизованную бутылку реагента на чистую скамейку и затяните крышку.
    2. Используйте стерильный шприц объемом 10 мл для введения 3-5 мл масла MMC из шприцевой иглы боковой трубки. Наклоните и медленно вращайте бутылку с реагентом, чтобы масло полностью проникло во внутреннюю стенку.
    3. Введите около 5 мл исходного раствора бактерий, а затем заполните флакон с реагентом, снова введя 5-7 мл масла.
    4. Вытащите независимый быстрый разъем A и вставьте быстрый разъем A бутылки с реагентом в его быстрый разъем B для завершения операции впрыска образца (рисунок 4A).
  5. Дождитесь окончания инициализации, а затем выключите ультрафиолетовую лампу (длина волны 254 нм).
  6. Откройте дверцу операционной камеры и поместите бутылку с реагентом в металлическую ванну.
  7. Вытащите разъем C2 чипа и быстрый разъем A бутылки с реагентом. Подключите разъем боковой трубки бутылки реагента к разъему C2, а соединитель верхней трубки к разъему O2. Затем закройте дверцу операционной камеры.
  8. Нажмите на кривую роста , чтобы выбрать функцию измерения кривой роста (рисунок 3A). В интерфейсе настройки параметров введите число как 15, включите переключатель обнаружения OD и установите длину волны как 600 нм. Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать генерацию дроплетов. Это займет около 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь Number относится к количеству капель, которые должны быть сгенерированы. Длина волны относится к длине волны OD, которая должна быть обнаружена. Установите число (максимум 200) и длину волны (350-800 нм) в соответствии с требованиями эксперимента.
  9. Когда на главном интерфейсе появится всплывающее окно с запросом «Извлеките бутылку реагента между C2 и O2, затем, пожалуйста, нажмите кнопку OK после завершения», откройте дверцу операционной камеры, чтобы вынуть бутылку реагента и подключите разъемы C2 и O2.
  10. Закройте дверь и нажмите кнопку OK во всплывающем окне, чтобы автоматически культивировать капли и определить значения OD.
    ПРИМЕЧАНИЕ: MMC обнаруживает значение OD, когда капля проходит через датчик оптического волокна. Поэтому период обнаружения зависит от количества генерируемых капель.
  11. Когда кривая роста достигнет стационарной фазы, нажмите кнопку «Экспорт данных», чтобы экспортировать данные OD. Выберите путь сохранения данных и экспортируйте значение OD, записанное в течение периода культивирования, в формате .csv, который может быть открыт соответствующим программным обеспечением (например, Microsoft Excel). Затем используйте картографическое программное обеспечение (например, EXCEL и Origin 9.0) для построения кривой роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процесса культивирования можно в любое время нажать на Экспорт данных , чтобы экспортировать данные OD всех текущих капель.

4. Адаптивная эволюция в MMC

  1. Подготовка к исходному бактериальному раствору
    1. Следуйте соответствующим стандартным правилам для подготовки специальной жидкой среды и твердых пластин для MeSV2.2 и автоклава при 121 °C в течение 15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для компонентов специальной среды обратитесь к Таблице 1 и Таблице материалов.
    2. Культивируйте MeSV2.2 с помощью твердой пластины (диаметр = 90 мм) в инкубаторе с постоянной температурой 37 °C в течение 72 ч. Затем соберите самостоятельную колонию и культивируйте ее в колбе для встряхивания 50 мл с 10 мл специальной жидкой среды в встряхивающем инкубаторе (200 об/мин) при 37 °C в течение 72 ч.
    3. Культивируемый раствор MeSV2.2 разводят средой до OD600 0,1-0,2 (убедитесь, что общий объем составляет не менее 10 мл) и продолжают культивировать его в колбе для встряхивания в течение 5 ч для получения исходного раствора бактерий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: MeSV2.2 является метаноло-незаменимым штаммом E. coli . Специальная жидкая среда содержит 500 ммоль/л метанола, что является сильным стрессом для MeSV2.2, что приводит к очень медленному росту. Обратите внимание, что получение исходного раствора бактерий здесь отличается от того, что описано в шаге 3.1.
  2. Инициализируйте консоль MMC, как описано в шагах 3.2, 3.3 и 3.5.
  3. Достаньте две стерилизованные бутылки с реагентами, одна из которых предназначена для исходного раствора бактерий, а другая - для свежей среды. Вводят исходный раствор бактерий (5 мл), свежую среду (12-15 мл) и масло MMC во флаконы с реагентами, как описано на этапе 3.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку адаптивная эволюция является долгосрочным процессом, включающим несколько субкультур, храните как можно больше свежей среды в MMC. Среда не может быть пополнена во время эксперимента.
  4. Установите две бутылки с реагентами в MMC, как описано в шаге 3.6. Установите один для исходного раствора бактерий между разъемами C2 и O2, а другой для свежей среды между разъемами C4 и O4.
  5. Нажмите на ALE , чтобы выбрать функцию адаптивной эволюции (рисунок 3B). В интерфейсе настройки параметров включите переключатель OD Detection .
  6. Установите число 50, длину волны 600 нм, концентрацию как 0%, введите как время, параметр как 30 ч и повторения как 99. Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать генерацию дроплетов. Это займет около 25 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь «концентрация» относится к максимальной концентрации химических факторов для адаптивной эволюции. Для различных капель в MMC возможно введение различных концентраций химических факторов для обеспечения различных условий роста. Рассчитайте введенные концентрации, используя следующее уравнение:
    figure-protocol-1
    Здесь «С» относится к концентрации химических факторов, вводимых в капли; "а" означает концентрацию химических факторов в бутылках с реагентами между разъемами С4 и О4; "b" означает концентрацию химических факторов в бутылках с реагентами между разъемами C6 и O6; а "i" означает имеющуюся концентрацию. Существует восемь концентраций, доступных в MMC. Поскольку химический фактор здесь имеет единую концентрацию (500 ммоль/л метанола) и является одним из ингредиентов среды, здесь устанавливается только одна бутылка с реагентом, содержащая химический фактор, а концентрация устанавливается как 0%. Тип относится к режиму субкультуры, который делится на три типа: режим времени, режим значения OD и режим флуоресценции. Первый означает культивирование капель в течение фиксированного времени, а затем субкультурацию, в то время как последние два средства культивируют капли до заранее определенного значения OD / интенсивности флуоресценции, а затем субкультурируют. Параметр относится к соответствующему параметру, необходимому при выборе режима субкультуры. Повторения относятся к количеству субкультур.
  7. Извлеките флакон с реагентом, помещенный между разъемами C2 и O2, как описано в шаге 3.8.
  8. Обратите внимание, значительно ли увеличились максимальные значения ОД капель в течение каждого периода субкультуры. Если увеличение происходит и соответствует требованиям эксперимента, нажмите кнопку «Экспорт данных», чтобы экспортировать данные OD, как описано в шаге 3.9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь период субкультуры зависит от параметра. Например, при установке параметра Тип как Время и Параметр как 30 ч, период субкультуры равен 30 ч. В течение каждого периода субкультуры существуют максимальные значения OD капель. Оценить, соответствует ли адаптивная эволюция требованиям эксперимента за счет увеличения максимальных значений ОД (Увеличение зависит от фактического процесса культивирования штамма, например, увеличенного более чем на 20%).
    ВНИМАНИЕ: Обратите внимание на то, исчерпана ли хранящаяся свежая среда. Если значительное увеличение не произошло даже после истощения среды, извлеките более быстрорастущие капли и проведите новый виток адаптивной эволюции.
  9. Извлеките целевые капли из MMC.
    1. Нажмите на кнопку Скрининг , чтобы выбрать функцию извлечения капель (рисунок 3C). Выберите опцию Собирать , нажмите на количество целевых дроплетов, а затем нажмите кнопку ОК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Капельный скрининг включает в себя "Сбор", "Выброс" и "Извлечение семенного раствора". "Экстракционный семенной раствор" означает сбор оставшихся капель13 после операции субкультуры.
    2. Подождите, пока всплывающее окно предложит: «Пожалуйста, вытащите быстрый разъем CF и поместите его в трубку EP». Вставьте быстрый разъем CF в трубку микроцентрифуги для сбора в соответствии с подсказкой программного обеспечения, а затем нажмите OK (рисунок 4D).
    3. Через 1-2 минуты в программном интерфейсе появится новое окно с подсказкой: «Пожалуйста, вставьте разъем обратно и нажмите OK , если закончите». Затем вставьте быстрый разъем CF обратно и нажмите OK , чтобы MMC продолжала работать (рисунок 4D). Когда следующая целевая капля достигнет сайта распознавания капель, повторите 4.9.2-4.9.3, чтобы собрать ее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как все целевые капли будут собраны, MMC продолжит культивирование оставшихся капель. Если культивация не нужна, нажмите «Стоп», чтобы напрямую завершить операцию.
    4. Извлеките каплю с помощью пипетки объемом 2,5 мкл, опустите ее на агарозную пластину толщиной 90 мм и равномерно распределите треугольным стеклянным разбрасывающим стержнем с длиной стороны 3 см. Затем культивируйте его в инкубаторе с постоянной температурой 37 °C в течение 72 ч.
    5. Соберите 3-5 самостоятельных колоний и отдельно культивируйте их в колбах по 50 мл с 10 мл свежей среды в встряхивающем инкубаторе (200 об/мин) при 37 °C в течение 48-72 ч. Следуйте соответствующим стандартным правилам для хранения раствора культивируемых бактерий в глицериновой трубке для последующих экспериментов.

5. Очистка MMC

  1. После завершения эксперимента нажмите кнопку Стоп , чтобы остановить все операции. Затем нажмите « Очистить», чтобы очистить чип и трубки. Это займет около 15 минут.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол использует E. coli MG1655 и штамм MeSV2.2 в качестве примеров для демонстрации культивирования микробов и адаптивной эволюции, необходимой для метанола, с автоматизированной и относительно высокой пропускной способностью в MMC. Измерение кривой роста в основном использовалось для характеристики культивирования микробов. Адаптивная эволюция проводилась путем автоматизированного непрерывного субкультурирования и добавления высокой концентрации метанола в качестве селективного давления во время каждой...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе представлено, как использовать систему микробной микробной культуры (MMC) для выполнения автоматизированного культивирования микробов и долгосрочной адаптивной эволюции. MMC представляет собой миниатюрную, автоматизированную и высокопроизводительную систему культивирования микробов. По сравнению с обычными методами и инструментами культивирования микробов с высокой пропускной способностью, MMC имеет много преимуществ, таких как низкое потребление труда и реагентов, простота эксплуатации, онлайн-обнаружен...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2018YFA0901500), Национальным проектом ключевых научных приборов и оборудования Национального фонда естественных наук Китая (21627812) и Программой научных исследований Инициативы Университета Цинхуа (20161080108). Мы также благодарим профессора Юлию А. Ворхольт (Институт микробиологии, департамент биологии, ETH Zurich, Zurich 8093, Швейцария) за предоставление метанол-эссенциального штамма E. coli версии 2.2 (MeSV2.2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 μ m Фильтрующая мембрана из ПВДФMerck Millipore Ltd.SLGPR33RBСтерилизуем масло MMC
4 > C холодильникHaierBCD-289BSWДля хранения реагентов
AgarBecton, Dickinson and Company214010Для получения твердых пластин
CaCl2· 2H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20011160Компонент специальной среды для MeSV2.2.
Чистая скамейкаBeijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.DL-CJ-INDIIДля асептической эксплуатации и УФ-стерилизации
CoCl2· 6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10007216Компонент специальной среды для MeSV2.2.
КомпьютерLenovoE450Установка программного обеспечения и управление MMC
Инкубатор постоянной температурыShanghai qixin scientific instrument co., LTDLRH 250Для культивирования микроорганизмов с использованием твердой среды
CuSO4· 5H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10008218Компонент специальной среды для MeSV2.2.
Весыэлектронные OHAUSAR 3130Для взвешивания реагентов
Пробирка EPThermo Fisher1,5 млДля сбора капель
FeCl3· 6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10011928Компонент специальной среды для MeSV2.2.
Морозильная трубкаThermo Fisher2.0 млДля сохранения штамма
ГлюконатSigma-AldrichS2054Компонент специальной среды для MeSV2.2.
ГлицеринGENERAL-REAGENTG66258AДля сохранения
штамма Паровой стерилизационный горшок высокого давленияSANYO ElectricMLS3020Для автоклавной стерилизации
изопропил-&бета;-d-тиогалактопиранизид (IPTG)Биотоп420322Компонент специальной среды для MeSV2.2.
Канамицина сульфатSolarbioK8020Компонент специальной среды для MeSV2.2.
KH2PO4MACKLINP815661Компонент специальной среды для MeSV2.2.
МетанолMACKLINM813895компонент специальной среды для MeSV2.2.
MgSO4· 7H2OBIOBYING1305715Компонент специальной среды для MeSV2.2.
Система микрокапельного культивирования (MMC)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.  MMC-IОпределение кривой роста и адаптивная эволюция. Пожалуйста, обратитесь к http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Микрофлюидный чипLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-ALE-ODДля различных операций с каплями. Пожалуйста, обратитесь к
http://www.tmaxtree.com/en/ MMC oilLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-M/S-ODМасляная фаза для капельной микрофлюидики. Пожалуйста, обратитесь к http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20026118Компонент специальной среды для MeSV2.2.
NaClОБЩИЙ РЕАГЕНТG81793Jкомпонент среды LB
Na2HPO4· 12H2OGENERAL-REAGENTкомпонент специальной среды для MeSV2.2.
NH4ClSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10001518Компонент специальной среды для MeSV2.2.
Чашка ПетриCorning Incorporated90 ммДля приготовления твердой среды
Пипеткаэппендорф2,5 мм; L, 10 μ L, 100μ L, 1000μ LДля работы с жидкостями
Быстроразъемный соединитель ALuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.—Для соединения каждого стыка. Пожалуйста, обратитесь к
http://www.tmaxtree.com/en/ флакону с реагентамиLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-PCBОтбор проб и хранение растворов бактерий и реагентов. Пожалуйста, обратитесь к http://www.tmaxtree.com/en/
Колба для встряхиванияUnion-Biotech50 млДля культивирования микроорганизмов
Встряхивающий инкубаторShanghai Sukun Industrial Co., Ltd.SKY-210 2BДля культивирования микроорганизмов в колбе
стрептомицина сульфат SolarbioS8290Компонент специальной среды для MeSV2.2.
ШприцJIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD10 млНаберите жидкость и введите ее в флакон с реагентом
Игла для шприцаOUBEL Hardware Store22GВнутренний диаметр составляет 0,41 мм, а внешний диаметр 0,71 мм.
ТриптонОксоид Лтд.LP0042Компонент среднетемпературного
холодильникаSANYO Ultra-lowMDF-U4086SДля сохранения деформации (-80 > C)
UV– Вид спектрофотометрGeneral Electric компанииUltrospec 3100 proДля измерения значений ОД
Витамин В1SolarbioSV8080Компонент специальной среды для MeSV2.2.
Дрожжевой экстрактOxoid Ltd.LP0021Компонент среды LB
ZnSO4· 7H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10024018Компонент специальной среды для MeSV2.2.
G10267B LB

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
  3. Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  4. Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381(2019).
  5. Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
  6. Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
  7. Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
  8. Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
  9. Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
  10. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  11. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
  12. Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
  13. Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  14. Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570(2020).
  15. Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508(2018).
  16. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 (2021).
  17. Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
  18. Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
  19. Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
  20. Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
  21. Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
  22. Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998(2020).
  23. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  24. Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
  25. Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbial Microdroplet CultureAutomated Microbial CultivationAdaptive Laboratory EvolutionDroplet MicrofluidicsGrowth Curve MeasurementEscherichia Coli CultivationHigh Throughput ScreeningOnline MonitoringSub CultivationDroplet Extraction

Related Articles