Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Рекомбинантная продукция бифидобактериальных эндогликозидаз для высвобождения N-гликанов

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62804

⸱

20 июля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Çanakkale Onsekiz Mart University, 2Uluova Dairy Farm, 3Department of Nutrition, University of Nevada, 4Department of Food Science and Technology, University of Nebraska, 5Evolve BioSystems Inc., 6Department of Biomedical Engineering, Karabuk University, 7Department of Chemistry, Hacettepe University

В этой статье

Краткое содержание

Бифидобактерии обладают уникальной геномной способностью к расщеплению N-гликанов. Рекомбинантное производство этих ферментов было бы многообещающим новым инструментом для высвобождения биоактивных N-гликанов из богатых гликопротеином субстратов, таких как молозиво.

Аннотация

Гликозилирование белка является разнообразной и распространенной посттрансляционной модификацией, которая связана со многими важными ролями, такими как функция белка, включая сворачивание белка, стабильность, ферментативную защиту и биологическое распознавание. N-гликаны, прикрепленные к гликопротеинам (таким как лактоферрин, лактадерин и иммуноглобулины), не могут перевариваться хозяином и достигают толстой кишки, где они потребляются определенными полезными микробами. Таким образом, они считаются пребиотическими соединениями нового поколения, которые могут избирательно стимулировать полезные микроорганизмы микробиома кишечника. Тем не менее, выделение этих новых классов пребиотиков требует новых ферментов. Здесь мы описываем рекомбинантное производство новых гликозидаз из различных штаммов бифидобактерий (выделенных от младенцев, кроликов, куриц и шмелей) для улучшения выделения N-гликанов из гликопротеинов. Метод, представленный в данном исследовании, включает в себя следующие этапы: молекулярное клонирование генов бифидобактерий с помощью стратегии рекомбинационного клонирования in vivo, контроль успешности трансформации, индукция белка и очистка белка.

Введение

Гликозилирование является очень важной посттрансляционной модификацией, наблюдаемой в белках. Примерно более 50% белков содержится в их гликозилированных формах у эукариот. N- и O-гликозилирование являются двумя основными типами гликозилирования 1,2. О-связанные гликаны (О-гликаны) ковалентно присоединяются к белкам через N-ацетилгалактозамин к гидроксильной группе остатков сериновой (Ser) или треонинной (Thr) аминокислоты. N-связанные гликаны (N-гликаны) представляют собой сложные олигосахариды, которые ковалентно присоединяются к аминокислотному остатку белков аспарагина (Asn) через N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) в определенной аминокислотной последовательности AsN-X-Ser/Thr и менее распространенной, AsN-X-Cys (цистеин) (где X может быть любой аминокислотой, кроме пролина)3,4. Основное ядро N-гликана состоит из двух остатков HexNAc и трех остатков маннозы. Дальнейшая элонгация этого общего ядра с другими моносахаридами с помощью ферментов гликозилтрансферазы и гликозидазы определяет тип N-гликанов на основе степени ветвления и типа сцепления5. N-гликаны обычно группируются в три основных класса: маннозы с высоким содержанием маннозы (HM), комплексного типа (CT) и гибрида (HY)6.

N-гликаны являются неперевариваемыми организмами организма хозяина из-за недостатка ферментов гликозидгидролазы. Эти соединения достигают тонкой/толстой кишки в непереваренной форме, где их используют тысячи различных видов бактерий, и они могут действовать как пребиотики, способствуя развитию специализированных кишечных микробов, особенно Bifidobacterium вида7. Последние данные показали, что N-гликаны избирательно стимулируют рост некоторых видов бактерий 8,9. N-гликаны, высвобождаемые из гликопротеинов коровьего молока, избирательно стимулировали рост подвида Bifidobacterium longum infantis (B. infantis), который является важнейшим видом бифидобактерий в кишечнике младенца, но другие виды бифидобактерий, такие как Bifidobacterium animalis (B. animalis), не использовали эти соединения9. Кроме того, недавнее исследование in vivo показало, что 19 уникальных N-гликанов из молочного лактоферрина и иммуноглобулинов избирательно стимулируют рост B. infantis8. В частности, B. infantis обладают геномной способностью к расщеплению гликана и метаболизму. Эндо-β-N-ацетилглюкозаминидаза (EndoBI-1), принадлежащая к семейству гликозилгидролаз 18, рекомбинантно полученная из B. infantis ATCC 15697, показала высокую активность в отношении молочных гликопротеинов в условиях in vitro 9,10. Этот новый фермент гликозидгидролазы может расщеплять N-N'-диацетилхитобиозные части, обнаруженные в N-гликанах10,11. На активность EndoBI-1 не влияет фукозилирование ядра и различные условия реакции, такие как высокая температура, pH, время реакции и т.д. 3,11,12. Эта уникальная характеристика бифидобактериальных гликозидгидролаз обеспечивает многообещающий инструмент для производства N-гликанов из богатых гликопротеином субстратов, таких как бычье молозиво13,14.

Для получения N-гликанов и О-гликанов из гликопротеинов 2,15 широко используются несколько химически и ферментативно разработанных методов дегликозилирования. Химические методы широко используются в гликобиологии для дегликозилирования гликопротеинов из-за их простоты использования, низкой стоимости и высокой субстратной специфичности. Наиболее распространенными методами химического дегликозилирования являются β-элиминация и гидразизация17. Среди этих методов β-элиминация основана на принципе расщепления гликанов из гликопротеинов путем воздействия гликопротеидов на щелочные условия. Высвобождающиеся гликаны могут разлагаться в процессе из-за реакций элиминации β, но эту проблему можно предотвратить с помощью восстановителей, таких как боргидрид натрия (NaBH4)18,19,20. Метод устранения β имеет различные ограничения. Восстановители превращают гликаны в альдитолы, препятствуют связыванию с ними флуорофора или хромофора. Таким образом, трудно контролировать высвобождение гликана19,20. Из-за высокого содержания соли на стадии очистки метода элюирование может привести к потерям образца20. Другим методом высвобождения гликана из гликопротеинов является гидразиновый метод, основанный на принципе реакции гидролиза после добавления к гликопротеину безводного гидразина. Поскольку он позволяет контролировать выделение гликанов путем изменения условий реакции, таких как температура, метод гидразации широко используется в гликобиологии21. Химическое дегликозилирование также может быть осуществлено с использованием безводной композиции фтористого водорода и трифторуксусной кислоты в дополнение к другим методам химического дегликозилирования 16,22,23. Ферментативное высвобождение N-гликанов из гликопротеинов обычно осуществляется пептидил-N-гликозидазами (PNGазами), которые обычно высвобождают N-гликаны, независимо от их размера и заряда24,25,26,27. Подобно методам химического дегликозилирования, процесс ферментативного дегликозилирования имеет другие проблемы. PNGазы проявляют активность в присутствии нескольких используемых детергентов, которые увеличивают доступность фермента к гликанам. Тем не менее, эти жесткие методы лечения могут нарушить нативные гликаны и оставшиеся полипептидные структуры. ПНГазы могут не расщеплять гликаны, когда есть фукоза, связанная с N-ацетилглюкозамином29. Различные эндогликозидазы, такие как F1, F2 и F3, проявляют большую активность в отношении нативных белков, чем PNGases. Эти эндогликозидазы имеют низкую активность в отношении множественных антенных гликанов, в то время как термостойкий новый EndoBI-1 эффективен при всех типах N-гликанов 10,11,28. Что касается ограничений существующих методов, очевидно, что для эффективного высвобождения гликана без каких-либо ограничений по-прежнему требуются новые ферменты. С этой целью виды бифидобактерий, которые имеют большой геномный островок, кодирующий различные ферменты гликозидгидролаз, позволяют расщеплять N-гликаны из гликопротеинов 30,31. В рамках данного контекста общей целью данного исследования является открытие новых гликозидаз из различных видов бифидобактерий. Для рекомбинантного производства этих ферментов предназначены различные фьюжн-метки, чтобы увеличить их производство, а также их активность.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Молекулярное клонирование генов бифидобактерий

  1. ПЦР-амплификация генов-мишеней с помощью трех наборов векторных праймеров (N-His, C-His и N-His SUMO)
    1. Изготавливают 100 мкМ стоковых грунтовочных растворов (олигомеров) путем добавления стерильной воды в количествах, определенных компанией. Подготовьте 10 μМ новых запасов из этих фондов для использования в ПЦР-амплификации генов-мишеней.
    2. Приготовьте смесь для ПЦР (общий объем 50 мкл) из 25 мкл мастер-смеси, 1 мкл прямого и обратного праймера в дозе 0,2 мкм, 21 мкл дистиллированной воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы, и 2 мкл матричной ДНК (бактериальных клеток) в ПЦР-пробирках. Аккуратно перемешайте смесь, пипетируя вверх и вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мастер-смесь (Lucigen), используемая для ПЦР, содержит Taq DNA полимеразу с высокой чистотой и высокой активностью и может работать при более высоких температурах для надежной амплификации матриц размером до 5 кб.
    3. Установите программу ПЦР следующим образом: начальный этап денатурации при 95 °C в течение 5 мин для высвобождения геномной ДНК, затем 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 30 с, отжиг при 60 °C в течение 30 с и удлинение при 72 °C в течение 1 мин, и окончательное удлинение при 72 °C в течение 10 мин.
    4. Проверьте продукты ПЦР методом электрофореза с агарозным гелем с системой документирования геля после работы при напряжении 100 В в течение 60 минут на 1% агарозном геле. Смешайте продукты ПЦР и лестницу ДНК с загрузочным красителем, смешав в соотношении 1:5 (5 μл продукта ПЦР + 1 μл загружающего красителя и 5 μл 1 kb лестницы ДНК + 1 μл загружающего красителя) для загрузки геля (Рисунок 1).
    5. Измерьте концентрацию ДНК продуктов ПЦР с помощью флуориметра перед этапом молекулярного клонирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации продуктов ПЦР должны находиться в диапазоне, необходимом для молекулярного клонирования (25-100 нг/мкл).
  2. Приготовление агаровой среды Lysogeny Broth (LB) для молекулярного клонирования
    1. Растворить 12,5 г LB и 6 г агарозы в 500 мл dH2O и автоклавировать среду LB агар (стерилизация при 121 °C в течение 20 мин).
    2. Растворите 15 мг канамицина с 1 мл dH2O и храните при температуре -20 °C.
    3. После автоклавирования добавьте 1 мл канамицина во флакон, содержащий стерильные 500 мл агаровой среды LB. Конечная концентрация канамицина составляет 30 мкг/мл. Налейте по 25 мл среды LB агар-канамицина в каждую пластину в лабораторном шкафу.
  3. Трансформация в условиях теплового шока химически компетентных клеток E. coli
    1. Добавьте в пробирку 1-3 мкл (от 25 до 100 нг) продуктов ПЦР для каждого штамма, включая 40 мкл химически компетентных клеток E. coli . Затем добавьте 2 мкл векторной ДНК в ту же пробирку. Осторожно перемешайте наконечником пипетки и переложите смесь в центрифужные пробирки объемом 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте этот шаг на льду. Не проводите пипеткой вверх и вниз для смешивания, чтобы избежать образования пузырьков воздуха и случайного нагрева клеток.
    2. Инкубируйте пробирки, содержащие компетентные клетки и ДНК, на льду в течение 30 минут. Нанести тепловой шок на смесь на водяной бане при температуре 42 °C в течение 45 с. Немедленно положите эти трубки на лед и инкубируйте в течение 2 минут.
    3. Добавьте 960 мкл восстановительной среды, используемой для быстрого восстановления клеток после молекулярного клонирования, в клетки пробирок и инкубируйте пробирки при 250 об/мин в течение 1 ч при 37 °C в встряхивающем инкубаторе.
    4. Планшет 100 мкл трансформированных клеток на LB агаровых планшетах, содержащих 30 мкг/мл канамицина. Используйте только химически компетентные клетки E. coli в качестве отрицательного контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием поместите агаровые планшеты LB, содержащие 30 мкг/мл канамицина, приготовленного на шаге 1.2.2, в инкубатор при температуре 37 °C.
    5. Инкубируйте все планшеты в течение ночи при температуре 37 °C в атмосфере окружающей среды (Рисунок 2).
  4. Приготовление среды LB для ПЦР колоний
    1. Растворите 7,5 г LB с 300 мл dH2O во флаконе и автоклавируйте среду LB (стерилизация при 121 °C в течение 20 минут).
    2. Растворите 9 мг канамицина (30 мкг/мл) с 1 мл dH2O и поместите при -20 °C. После автоклавирования добавьте 1 мл канамицина во флакон, содержащий стерильные 300 мл LB среды. Храните жидкую питательную среду при температуре +4 °C до ее использования.
  5. Скрининг трансформантов методом ПЦР колоний
    1. Чтобы подтвердить, что все трансформанты несут рекомбинантные гены, выберите колонии случайным образом и амплифицируйте целевые гены с помощью ПЦР с использованием праймеров для секвенирования, поставляемых в комплекте для клонирования.
    2. Выполните все шаги на льду и предварительно охладите все ПЦР-пробирки и пробирки объемом 15 мл перед использованием.
    3. С помощью наконечника для пипетки перенесите половину выбранной колонии в пробирку для ПЦР для каждого образца. Возьмите еще одну половину колонии с помощью наконечника пипетки и поместите ее в пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл жидкой среды LB+канамицин (приготовленной на шаге 1.4). Сделайте вихревыми пробирки объемом 15 мл и инкубируйте жидкие культуры при 250 об/мин при 37 °C в течение ночи в встряхивающем инкубаторе.
    4. Налейте 50 мкл реакционной смеси ПЦР (25 мкл исходной смеси, 1 мкл прямого праймера, 1 мкл обратного праймера, 23 мкл дистиллированной воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы) во все пробирки для ПЦР и диспергируйте клетки, аккуратно пипетируя вверх и вниз.
    5. Установите программу ПЦР на 95 °C в течение 5 минут для высвобождения геномной ДНК путем лизирования бактериальных клеток, всего 40 циклов 95 °C в течение 30 с для начальной денатурации, 60 °C в течение 30 с для отжига, 72 °C в течение 1 минуты для удлинения и 72 °C в течение 10 минут для окончательного удлинения.
    6. Проверьте продукты ПЦР методом гель-электрофореза после запуска при напряжении 100 В в течение 60 мин на 1% агарозном геле (Рисунок 3). Детали электрофореза в ДНК-геле описаны в шаге 1.1.3.
    7. Приготовьте 15% запасы глицерина успешных трансформаторов. Поместите 500 μL 60% глицерина в криопробирки и добавьте 1 500 μL жидкой культуры успешных трансформантов. Готовые бульоны хранить при температуре -80 °С.

2. Индукция экспрессии белка L-рамнозой

  1. Приготовьте прекультуру из 1 л LB жидкой среды, содержащей 30 мкг/мл канамицина.
  2. Налейте 8 мл среды LB в центрифужные пробирки объемом 50 мл. Используйте одну из пробирок в качестве отрицательного регулятора, содержащую только жидкую среду. Для 20% L-рамнозы в виде исхода растворите 0,5 г L-рамнозы с 2,5 мл dH2O и храните при температуре -20 °C до использования.
  3. Поместите 10 μL бактериальных запасов в центрифужные пробирки, содержащие 8 мл жидкой среды. Осторожно встряхните их и инкубируйте при температуре 37 °C в течение ночи в встряхивающем инкубаторе.
  4. Налейте 250 мл жидкой среды LB в стерилизованную колбу Эрленмейера объемом 2 л.
  5. Инокулируйте 2,5 мл жидкой культуры на ночь в колбу объемом 2 л, содержащую жидкую среду LB, в соотношении 1:100 между колбой и средой, и инкубируйте при 37 °C и 150 об/мин в течение 4 часов в встряхивающем инкубаторе.
  6. Измерьте оптическую плотность бактериальных клеток на длине волны 600 нм (наружный диаметр600) с помощью спектрофотометра. Когда клетки достигнут оптической плотности 0,5-0,6, добавьте 2,5 мл 20% рамнозы (конечная концентрация 0,2%) к 250 мл культуры LB и инкубируйте при 37 °C в течение ночи при 250 об/мин в встряхивающем инкубаторе.
  7. Перенесите жидкую культуру в пробирки объемом 5 x 50 мл, центрифугируйте образцы 3724 x g в течение 15 мин при температуре +4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Храните гранулы при температуре -20 °C до этапа очистки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки экспрессии белка с помощью SDS-PAGE соберите 1 мл неиндуцированной (при культурах с оптической плотностью 600 нм 0,5-0,6, без L-рамнозы) культуры в качестве контроля и 1 мл индуцированной культуры (после ночной инкубации) в качестве индуцированного образца. Микроцентрифугирование всех образцов при 12 000 x g в течение 1 мин и ресуспендирование неиндуцированных и индуцированных образцов 50 мкл и 100 мкл загрузочного буфера SDS-PAGE соответственно.

3. Лизис клеток химически компетентных клеток E. coli, содержащих меченые His-меченные ферменты

  1. Приготовьте буфер для лизиса pH 8,0 (50 мМ Tris-HCl, 200 мМ NaCl, 1 мМ имидазол, 1% SDS), уравновешивающий буфер pH 7,4 (20 мМ2PO4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол), буфер для промывки pH 7,4 (20 мМ2PO4, 300 мМ NaCl, 25 мМ имидазол) и буфер для элюирования pH 7,4 (20 мМ2PO4, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол).
  2. Поместите пробирки объемом 50 мл с гранулами клеток при температуру -80 °C на 15 минут для замораживания. Затем снимите гранулы с -80 °C и разморозьте при комнатной температуре.
  3. Добавьте 5 мл dH2O к гранулам и растворите пипетированием вверх и вниз. Центрифугируйте при 3724 х г в течение 15 мин при +4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
  4. Для гранул культуры объемом 50 мл добавьте в гранулы 6 300 мкл буфера для лизиса и 63 мкл коктейля ингибиторов протеазы остановки без ЭДТА (соотношение 1:100) и растворите путем пипетирования вверх и вниз. Инкубируйте их на льду в течение 30 минут, делайте вихрь каждые 10 минут.
  5. Установите импульсный режим работы ультразвукового аппарата как 10 с ВКЛ и 59 с ВЫКЛ, а амплитуду как 37%. Поместите трубку в стакан со льдом и погрузите в трубку зонд ультразвукового аппарата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зонд должен быть полностью погружен в воду, не касаясь ни одной из сторон трубки.
  6. После процесса ультразвуковой обработки (6 импульсов в течение 10 с охлаждением в течение 1 минуты) центрифугируйте образцы при давлении 3 724 x g в течение 45 минут при температуре +4 °C. Затем соберите все надосадочные жидкости в пробирку и центрифугируйте при давлении 3,724 x g в течение 5 мин при температуре +4 °C.
  7. Соберите надосадочную жидкость в пробирку и возьмите 100 мкл образца для электрофореза в геле додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) на шаге 4.7. Измерьте концентрацию белка в образцах с помощью флуориметра.

4. Очистка меченых His-меченных ферментов периодическим методом

  1. Добавьте 1 мл смолы Ni-NTA в пробирку центрифуги и центрифугируйте в течение 2 мин при 700 x г. Осторожно извлеките трубку и выбросьте образовавшуюся надосадочную жидкость.
  2. Добавьте в пробирку 2 мл (в два раза больше объема смолы) уравновешивающего буфера и хорошо перемешайте до полного образования взвешенной смолы. Центрифугируйте пробирку в течение 2 минут при давлении 700 x g , осторожно извлеките и выбросьте буфер.
  3. Смешайте в центрифужной пробирке белковый экстракт и уравновешивающий буфер в соотношении 1:1. Добавьте смесь в тюбик со смолой и поставьте его на шейкер при 150 об/мин на 30 минут. Центрифугируйте пробирку в течение 2 минут при давлении 700 x g и выбросьте надосадочную жидкость.
  4. Промойте смолу 5 мл промывочного буфера и центрифугируйте пробирку в течение 2 минут при давлении 700 x g. Повторяйте этап промывания до тех пор, пока концентрация надосадочной жидкости не уменьшится до исходного уровня.
  5. Добавьте в пробирку 1 мл элюирующего буфера, чтобы элюировать связанные белки, меченные His. Центрифугируйте пробирку в течение 2 минут при давлении 700 x g. Сохраните надосадочную жидкость и возьмите 100 мкл для анализа SDS-PAGE на шаге 4.7. Повторите шаг элюирования три раза. Измерьте концентрации каждой надосадочной жидкости с помощью флуориметра.
  6. Соберите все надосадочную жидкость в отрезную пробирку с токсингой 10 кДа и центрифугируйте ее в течение 2 мин при давлении 700 x g. Повторяйте центрифугирование до тех пор, пока объем надосадочной жидкости не уменьшится до 200 μл, периодически пипетируя вверх и вниз. Храните очищенные белки при температуре -20 °C и возьмите 100 мкл для анализа SDS-PAGE на шаге 4.7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует измерить концентрацию белка и, если концентрация низкая, центрифугировать до ее увеличения.
  7. SDS-PAGE анализ очищенных белков
    1. Приготовьте 4% стекирующий гель (40% акриламид/бисакриламид, 1 М Трис pH 6,8, 10% SDS, 10% персульфат аммония, TEMED, dH2O) и 12% растворяющий гель (40% акриламид/бисакриламид, 1 М Трис pH 8,8, 10% SDS, 10% персульфат аммония, TEMED, dH2O).
    2. Смешайте образец с 2x буфером для образцов Laemmli в соотношении 1:1 и инкубируйте при 95 °C в течение 5 минут для денатурации белков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация белка в образцах должна быть измерена перед загрузкой, а объем загрузки будет основан на их концентрации при равной загрузке.
    3. Добавьте 1x бегущий буфер в резервуар и загрузите образцы и белковую лестницу в лунки. Сначала запустите белки при напряжении 80 В и увеличьте ток до 120 В, когда белки перейдут от стекирующего геля к разрешающему гелю.
    4. Поместите гель в краску для окрашивания в синий цвет и поставьте в шейкер на 30 минут. Смойте гель раствором для задержания (250 мл dH2O + 50 мл уксусной кислоты (HOAc) + 200 мл метанола) и сделайте снимок (рис. 4).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом исследовании были выбраны ферменты гликозилгидролазы, отобранные из разных источников. Предполагалось, что совместное применение различных ферментов с разными структурами может обеспечить лучшее высвобождение гликанов, поскольку они эволюционировали и активны в разных гликопротеинах. Список генов-мишеней и их происхождение приведены в таблице 1. Штаммы бактерий были получены из Бельгийской скоординированной коллекции микроорганизмов. Наборы грунтовок были разработаны в соответствии с рекомендациям...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Стратегия рекомбинационного клонирования in vivo , используемая для молекулярного клонирования целевых генов, обеспечивает быстрые и надежные результаты по сравнению с другими традиционными протоколами клонирования. Несмотря на то, что существует множество удобных методов молекулярного клонирования, метод, описанный в этой статье, имеет больше преимуществ. Система клонирования in vivo , в отличие от других систем клонирования, не нуждается в какой-либо ферментативной об...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Данное исследование проводится при поддержке компаний TUBITAK #118z146 и Uluova Süt Ticaret A.Ş. (Uluova Milk Trading Co.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
EconoTaq PLUS 2X Master MixLucigen30035-1Амплификация генов-мишеней (ПЦР)
ДНКаза/РНКаза дистиллированная вода без ДНКазыInvitrogen10977035Амплификация генов-мишеней (ПЦР)
Safe-Red Loading DyeabmG108-RДНК-гель электрофорез
1 kb Plus DNA LadderGoldBioD011-500ДНК-гель электрофорез
Набор для анализа белка QubitInvitrogenQ33211Измерение концентрации ДНК
LB Бульон, Miller (Luria-Bertani)amrescoJ106-2KGБактериальные питательные среды
AgaroseInvitrogen16500-500Бактериальные культуральные среды и др.
Канамицин моносульфатGoldBioK-120-5Антибиотик в бактериальных культуральных средах
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, N-HISLucigen49011-1Набор для клонирования
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, SUMOLucigen49013-1Набор для
клонирования и экспрессии Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, C-HISLucigen49012-1Набор для клонирования
Раствор глицеринаSigma-Aldrich15524-1L-RПриготовление глицеринового запаса
L-Рамноза моногидратSigma-Aldrich83650Индукция экспрессии белка
2X Laemmli Буфер образцаClearBandTGS10SDS-Page анализ
SureCast 40% (w/v) АкриламидInvitrogenHC2040SDS-Page анализ
SureCast APSInvitrogenHC2005SDS-Page анализ
SureCast TEMEDInvitrogenHC2006SDS-Page анализ
10X Бегущий буферClearBandTGS10SDS-Page анализ
Triset al.BioShopTRS001.1SDS-Page анализ и лизис клеток
10% SDSClearBandS100SDS-Page анализ
PageRuler Plus Prestained Protein LadderThermoFisher26619SDS-Page анализ
ИмидазолSigma-Aldrich56750Лизис клеток
NaClSigma-Aldrich31434-5Kg-RЛизис клеток
Sodium Фосфат Одноосновной Безводныйамреско0571-1КгФосфат натрия Буфер для лизиса клеток
Фосфат натрия Диосновной Дигидрат др.Sigma-Aldrich04272-1KgНатрий-фосфатный буфер для лизиса клеток
10-кДа-отсечной центробежный фильтрAmicon® - MERCK UFC9010Очистка ферментов

Ссылки

  1. Adlerova, L., Bartoskova, A., Faldyna, M. Lactoferrin: a review. Veterinarni Medicina. 53 (9), 457-468 (2008).
  2. Karav, S., German, J. B., Rouquié, C., Le Parc, A., Barile, D. Studying lactoferrin N-glycosylation. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 870(2017).
  3. Le Parc, A., et al. A novel endo-β-N-acetylglucosaminidase releases specific N-glycans depending on different reaction conditions. Biotechnology Progress. 31 (5), 1323-1330 (2015).
  4. Lafite, P., Daniellou, R. Rare and unusual glycosylation of peptides and proteins. Natural Product Reports. 29 (7), 729(2012).
  5. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  6. Varki, A., et al. Structures common to different glycans. Essentials of Glyobiology. , (2009).
  7. Koropatkin, N. M., Cameron, E. A., Martens, E. C. How glycan metabolism shapes the human gut microbiota. Nature Reviews Microbiology. 10 (5), 323(2012).
  8. Karav, S., et al. N-glycans from human milk glycoproteins are selectively released by an infant gut symbiont in vivo. Journal of Functional Foods. 61, 103485(2019).
  9. Karav, S., et al. Oligosaccharides released from milk glycoproteins are selective growth substrates for infant-associated bifidobacteria. Applied and Environmental Microbiology. 82 (12), 3622-3630 (2016).
  10. Garrido, D., et al. Endo-β-N-acetylglucosaminidases from infant gut-associated bifidobacteria release complex N-glycans from human milk glycoproteins. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 775-785 (2012).
  11. Karav, S., et al. Kinetic characterization of a novel endo-beta-N-acetylglucosaminidase on concentrated bovine colostrum whey to release bioactive glycans. Enzyme and Microbial Technology. 77, 46-53 (2015).
  12. Karav, S., et al. Characterizing the release of bioactive N- glycans from dairy products by a novel endo-β-N-acetylglucosaminidase. Biotechnology Progress. 31 (5), 1331-1339 (2015).
  13. Sahutoglu, A. S., Duman, H., Frese, S. A., Karav, S. Structural insights of two novel N-acetyl-glucosaminidase enzymes through in silico methods. Turkish Journal Of Chemistry. 44 (6), 1703-1712 (2020).
  14. Duman, H., et al. Potential applications of Endo-β-N-Acetylglucosaminidases from Bifidobacterium longum subspecies infantis in designing value-added, next generation infant formulas. Frontiers in Nutrition. 8, 646275(2021).
  15. Karav, S. Application of a novel Endo-β-N-Acetylglucosaminidase to isolate an entirely new class of bioactive compounds: N-Glycans. Enzymes in Food Biotechnology. , 389-404 (2019).
  16. Sojar, H. T., Bahl, O. P. A chemical method for the deglycosylation of proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 259 (1), 52-57 (1987).
  17. Dwek, R. A., Edge, C. J., Harvey, D. J., Wormald, M. R., Parekh, R. B. Analysis of glycoprotein-associated oligosaccharides. Annual Review of Biochemistry. 62 (1), 65-100 (1993).
  18. Carlson, D. M. Structures and immunochemical properties of oligosaccharides isolated from pig submaxillary mucins. Journal of Biological Chemistry. 243 (3), 616-626 (1968).
  19. Roth, Z., Yehezkel, G., Khalaila, I. Identification and quantification of protein glycosylation. International Journal of Carbohydrate Chemistry. 2012, 1-10 (2012).
  20. Turyan, I., Hronowski, X., Sosic, Z., Lyubarskaya, Y. Comparison of two approaches for quantitative O-linked glycan analysis used in characterization of recombinant proteins. Analytical Biochemistry. 446, 28-36 (2014).
  21. Patel, T., et al. Use of hydrazine to release in intact and unreduced form both N-and O-linked oligosaccharides from glycoproteins. Biochemistry. 32 (2), 679-693 (1993).
  22. Edge, A. S. B., Faltynek, C. R., Hof, L., Reichert, L. E., Weber, P. Deglycosylation of glycoproteins by trifluoromethanesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 118 (1), 131-137 (1981).
  23. Fryksdale, B. G., Jedrzejewski, P. T., Wong, D. L., Gaertner, A. L., Miller, B. S. Impact of deglycosylation methods on two-dimensional gel electrophoresis and matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry for proteomic analysis. Electrophoresis. 23 (14), 2184-2193 (2002).
  24. Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
  25. Morelle, W., Faid, V., Chirat, F., Michalski, J. C. Analysis of N- and O-linked glycans from glycoproteins using MALDI-TOF mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 534, 5-21 (2009).
  26. O'Neill, R. A. Enzymatic release of oligosaccharides from glycoproteins for chromatographic and electrophoretic analysis. Journal of Chromatography. A. 720 (1-2), 201-215 (1996).
  27. Szabo, Z., Guttman, A., Karger, B. L. Rapid release of N-linked glycans from glycoproteins by pressure-cycling technology. Analytical Chemistry. 82 (6), 2588-2593 (2010).
  28. Trimble, R. B., Tarentino, A. L. Identification of distinct endoglycosidase (endo) activities in Flavobacterium meningosepticum: endo F1, endo F2, and endo F3. Endo F1 and endo H hydrolyze only high mannose and hybrid glycans. The Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1646(1991).
  29. Tretter, V., Altmann, F., März, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
  30. Sela, D. A., et al. The genome sequence of Bifidobacterium longum subsp. infantis reveals adaptations for milk utilization within the infant microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18964-18969 (2008).
  31. Garrido, D., Kim, J. H., German, J. B., Raybould, H. E., Mills, D. A. Oligosaccharide binding proteins from Bifidobacterium longum subsp. infantis reveal a preference for host glycans. PLoS One. 6 (3), 17315(2011).
  32. Butt, T. R., Edavettal, S. C., Hall, J. P., Mattern, M. R. SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins. Protein Expression and Purification. 43 (1), 1-9 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Гликозилирование белковвыделение гликопротеиновмолекулярное клонированиеочистка белковмикробиом кишечникапребиотические соединенияферменты гликозидазы

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.