В городе Виво Скрининг иммуногенности внеклеточных везикул опухолевого происхождения методом проточной цитометрии селезеночных Т-клеток

Summary

В этой рукописи описывается, как оценить иммуногенность in vivo внеклеточных везикул опухолевых клеток (EV) с помощью проточной цитометрии. EV, полученные из опухолей, подвергающихся иммуногенной гибели клеток, вызванной лечением, кажутся особенно актуальными при иммунооперации опухолей. Этот протокол иллюстрирует оценку оксалиплатин-индуцированных иммуностимулирующих опухолевых EV, но может быть адаптирован к различным условиям.

Abstract

Иммуногенная гибель клеток опухолей, вызванная химиотерапией или облучением, может вызывать специфические для опухоли ответы Т-клеток, высвобождая связанные с опасностью молекулярные паттерны и индуцируя выработку интерферона I типа. Иммунотерапия, включая ингибирование контрольных точек, в первую очередь полагается на ранее существовавшие опухолеспецифические Т-клетки для раскрытия терапевтического эффекта. Таким образом, синергетические терапевтические подходы, которые используют иммуногенную гибель клеток в качестве внутренней противораковой вакцины, могут улучшить их реакцию. Однако спектр иммуногенных факторов, высвобождаемых клетками при стрессе, вызванном терапией, остается неполностью охарактеризованным, особенно в отношении внеклеточных везикул (EV). Считается, что EV, наноразмерные мембранные частицы, испускаемые практически из всех клеток, облегчают межклеточную связь и, при раке, опосредуют перекрестное праймирование против опухолевых антигенов. Для оценки иммуногенного эффекта EV, полученных из опухолей в различных условиях, ищутся адаптируемые, масштабируемые и валидные методы. Таким образом, в настоящем документе представлен относительно простой и надежный подход к оценке иммуногенности EV in vivo . Протокол основан на анализе проточной цитометрии селезеночных Т-клеток после иммунизации in vivo мышей EV, выделенных путем анализа на основе осаждения из культур опухолевых клеток в условиях терапии или стационарного состояния. Например, эта работа показывает, что воздействие оксалиплатина на клетки мышиной меланомы B16-OVA привело к высвобождению иммуногенных EV, которые могут опосредуть активацию опухолеспособных цитотоксических Т-клеток. Следовательно, скрининг EV с помощью иммунизации in vivo и проточной цитометрии выявляет условия, при которых могут возникать иммуногенные EV. Выявление условий иммуногенного высвобождения EV обеспечивает важную предпосылку для тестирования терапевтической эффективности EV против рака и изучения основных молекулярных механизмов, чтобы в конечном итоге раскрыть новое понимание роли EV в иммунологии рака.

Introduction

Иммунная система играет ключевую роль в борьбе с раком, как при инспирировании ингибирования иммунных контрольных точек, так и для эффективности традиционных методов лечения рака. Опухолевые клетки, поддающиеся генотоксической терапии, такой как химиотерапевтические агенты оксалиплатин и доксорубицин, или ионизирующее лучевое лечение, могут высвобождать антигены и связанные с опасностью молекулярные паттерны (DAMP), которые потенциально инициируют адаптивный противоопухолевый иммунный ^ответ1. Наиболее известные DAMP, в контексте иммуногенной гибели клеток, включают сигналы find-me, такие как хемотаксическая АТФ, сигналы eat-me, такие как воздействие калретикулина, который способствует поглощению опухолевых клеток антигенпрезентирующими клетками, и высвобождение HMGB1, который активирует рецепторы распознавания образов, тем самым усиливая перекрестную презентацию опухолевых ^{антигенов2}. Кроме того, интерфероны типа I (IFN-I), индуцированные через иммуногенные нуклеиновые кислоты или другие стимулы, полученные из опухоли, воспринимаются дендритными клетками, что позволяет им эффективно праймировать опухолеспецифические цитотоксические Т-клетки3,4. Клинически активированные и пролиферирующие CD8⁺ Т-клетки, проникающие в опухоль, обеспечивают независимый прогностический фактор для длительной выживаемости у многих больных раком. Высвобождаемый из таких активированных Т-клеток, IFN-γ опосредует прямое антипролиферативное воздействие на раковые клетки и стимулирует поляризацию Th1 и цитотоксическую дифференцировку Т-клеток, тем самым способствуя эффективному иммунонадзору против ^рака5,6. Оксалиплатин является добросовестным иммуногенным индуктором гибели клеток, опосредующим такой адаптивный иммунный ответ против ^рака7. Тем не менее, множество исходных иммуногенных сигналов, высвобождаемых опухолевыми клетками при стрессе, вызванном терапией, еще предстоит полностью раскрыть. Несмотря на значительные достижения в иммунотерапии рака, расширение ее преимуществ для большей части пациентов остается проблемой. Более подробное понимание иммуногенных сигналов, которые инициируют активацию Т-клеток, может направлять разработку новых методов лечения.

Гетерогенная группа мембранно-замкнутых структур, известная как внеклеточные везикулы (EV), по-видимому, служит межклеточными устройствами связи. Излучаемые практически всеми типами клеток, EV переносят функциональные белки, РНК, ДНК и другие молекулы в клетку-реципиент или могут изменять функциональное состояние клетки, просто связываясь с рецепторами на поверхности клетки. Их биологически активный груз значительно варьируется в зависимости от типа и функционального состояния генерирующей ^{ячейки8}. В иммунологии рака EV, высвобождаемые из опухолевых клеток, преимущественно рассматриваются как противоборствующие иммунотерапии, потому что они в конечном итоге способствуют инвазивному росту, преформируют метастатические ^ниши9 и подавляют иммунный ^ответ10. Напротив, некоторые исследования показали, что EV могут переносить опухолевые антигены в дендритные клетки для эффективного перекрестного ^{представления11,12}. EV могут обеспечивать иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, если они возникают при стрессе, вызванном терапией, облегчая противоопухолевый иммунный ^{ответ13,14}. Недавно было показано, что зондирование таких врожденных иммунных лигандов РНК и ДНК в микроокружении опухоли модулирует реакцию на блокаду контрольных точек 15,16,17. Следовательно, иммуногенная роль EV, высвобождаемых опухолевыми клетками при различном стрессе, вызванном терапией, должна быть дополнительно выяснена. Поскольку электромобили представляют собой молодую, но растущую область исследований, стандартизация методов все еще продолжается. Поэтому обмен знаниями имеет важное значение для улучшения воспроизводимости исследований взаимодействий между EV и иммунологией рака. Имея это в виду, эта рукопись описывает простой протокол оценки иммуногенного эффекта опухолевых EV in vivo.

Эта оценка выполняется путем генерации ЭВ, полученных из опухоли, иммунизации мышей-реципиентов этими ЭВ и анализа селезеночных Т-клеток с помощью проточной цитометрии. Генерация EV идеально выполняется путем посева опухолевых клеток мышей в культурную среду без EV для высокой степени чистоты. Клетки обрабатывают специфическим стимулом клеточного стресса, таким как химиотерапия, чтобы сравнить эффект индуцированных терапией EV с базовой иммуногенностью соответствующих EV, полученных из опухоли. Изоляция электромобилей вполне может быть выполнена различными методами, которые должны быть выбраны в соответствии с применимостью in vivo и местной доступностью. Следующий протокол описывает анализ на основе осаждения с коммерческим комплектом для очистки электромобилей. Мыши дважды иммунизируются этими электромобилями. Через четырнадцать дней после первой инъекции Т-клетки извлекаются из селезенки и анализируются на производство IFN-γ с помощью проточной цитометрии для оценки системного иммунного ответа. При этом потенциал опухолевых EV, возникающих при различных терапевтических схемах, для индуцирования противоопухолевых Т-клеточных ответов оценивается относительно легко, быстро и с высокой ^{валидностью13}. Поэтому этот метод подходит для иммунологического скрининга EV, полученных из раковых клеток в различных условиях.

Protocol

В начале экспериментов мышам было не менее 6 недель и они содержались в определенных условиях, свободных от патогенов. Настоящий протокол соответствует институциональным этическим нормам и действующим местным нормам. Исследования на животных были одобрены местным регулирующим органом (Regierung von Oberbayern, Мюнхен, Германия). Возможные предубеждения, связанные с полом, не были исследованы в этих исследованиях.

1. Генерация и выделение EV, полученных из опухолевых клеток после воздействия химиотерапии

1. Культивировать мышиные клетки меланомы B16, экспрессирующие овальбумин (B16-OVA) в DMEM (содержащий 4 мМ L-глутамина и 4,5 г/л D-глюкозы), дополненный FCS (10% v/v), пенициллином (100 ЕД/мл) и стрептомицином (100 мкг/мл) при 37 °C, пока клетки не будут стабильно расти и не будут примерно на 90% сливаться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот раздел протокола полностью в стерильных условиях, используя капюшон клеточной культуры. Для анализа других раковых образований клеточные линии, экспрессирующие мощный антиген, предпочтительны для оценки антиген-специфических Т-клеточных реакций, поскольку они позволяют проводить специфическую рестимуляцию антигена ex vivo .
2. Чтобы подготовить среду для культивирования клеток, необходимую для генерации ЭЛЕКТРОМОБИЛей, истощают бычьи EV в FCS путем ультрацентрифугирования при 100 000 х г в течение 24 ч при 4 °C, а затем выбрасывают гранулу. В качестве альтернативы, заранее выберите коммерческий препарат с низким содержанием электромобилей животных.
3. Соберите клетки B16-OVA и дважды промыть их в PBS, а затем посеять в концентрации 400 000 клеток / мл в средах, обедненных EV.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптируйте концентрацию клеток к динамике роста исследуемой клеточной линии, чтобы клетки не перерастали.
4. Обрабатывают клетки B16-OVA путем добавления 30 мкг оксалиплатина на мл и инкубируют в течение 24 ч при 37 °C. Оставьте контрольные условия без лечения. При первом использовании генотоксического вещества титруйте желаемую цитотоксическую эффективность, используя анализы жизнеспособности клеток, такие как трипан синий ^{исключение18}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ может также оценивать EV, генерируемые в клеточных культурах, обработанных другими иммуномодулирующими веществами или ионизирующим облучением, помимо химиотерапевтических средств.
   ВНИМАНИЕ: Оксалиплатин вызывает раздражение кожи и глаз и может вызвать аллергическую реакцию кожи и раздражение дыхательных путей. Оксалиплатин подозревается в возникновении рака. В качестве меры предосторожности используйте средства индивидуальной защиты, включая соответствующие перчатки, очки, маски и одежду, очищенные перед повторным использованием. Избегайте вдыхания и тщательно мойте руки после обработки. Избегайте попадания в окружающую среду и утилизируйте оксалиплатин в соответствии с действующими правилами. Получите подробную информацию из паспорта безопасности.
5. Соберите культуру клеток супернатанта. Центрифугу сначала при 400 х г в течение 5 мин при 4 °С, а затем при 2000 х г в течение 30 мин при 4 °С, каждый раз отбрасывая гранулу. Наконец, фильтруйте через 220-нм PVDF-мембрану. Используйте свежую трубку для каждого шага, чтобы удалить любой клеточный мусор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе EV-содержащий супернатант может храниться при 4 °C в течение дня до возобновления протокола. Тем не менее, настоятельно рекомендуется придерживаться описанного графика с немедленной очисткой EV.
6. Смешайте 1 мл супернатанта с 0,5 мл специального коммерчески доступного реагента для выделения экзосом (см. Таблицу материалов) в V-образной трубке объемом 1,5 мл. Тщательно пипетка вверх и вниз или вихрь для создания однородного раствора. Инкубировать в течение ночи при 4 °C.
7. Центрифуга при 10 000 х г в течение 60 мин при 4 °C. Осторожно выбросьте супернатант. Удалите оставшиеся капли, постукивая трубкой объемом 1,5 мл вверх ногами по бумажному полотенцу и аспирацией через пипетку с тонким наконечником, не касаясь EV-гранулы внизу.
   1. Тщательно удалите все жидкости, чтобы предотвратить бесконтрольное разбавление EV-гранулы. Кроме того, выполняйте эти задачи быстро, чтобы предотвратить высыхание гранул.
8. Повторно суспендируйте электромобили в холодном PBS путем пипетки вверх и вниз, не выцарапывая гранулу со стенки трубки наконечником. Теперь перенесите подвеску шаг за шагом от первой к последней трубе, чтобы объединить электромобили.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте объем PBS, равный 5 мкл, умноженный на количество трубок. 5 мкл конечной суспензии содержит изолированные EV, высвобождаемые из 400 000 клеток при химиотерапии или в устойчивом состоянии.
9. Предпочтительно использовать электромобили напрямую. Если это невозможно, храните суспензии EV при -80 °C в силиконизированных сосудах в течение 28 дней до нанесения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Электромобили, описанные здесь и в ряде других публикаций, не теряют своей соответствующей биологической функции при хранении при -80 °C в течение этого периода ^{времени19}.
10. Количественная оценка и характеристика изолятов EV в соответствии с руководящими принципами MISEV201820.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возможные методы количественной оценки включают анализ отслеживания наночастиц (NTA)²¹ и обнаружение мембранно-связанных белков ^EV22. Возможные подходы к дальнейшей характеристике электромобилей включают электронную ^{микроскопию23} и вестерн ^блот20.

2. Иммунизация мышей электромобилями

1. Спланируйте эксперимент in vivo с мышами C57BL/6 (или другими сингенными мышами, соответствующими линии опухолевых клеток), включая группы лечения, получающие EV, полученные из обработанных клеток, необработанных клеток и PBS (транспортное средство), соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно использовать мышей в возрасте 6-8 недель, чтобы предотвратить физиологическое старение от снижения иммунного ^{ответа24}.
2. Смешайте 5 мкл EV-суспензии с 55 мкл холодного PBS для каждой мыши в соответствующей группе лечения, чтобы иммунизировать ее EV, выделенными из клеток 4,0 x ¹⁰⁵ B16-OVA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это количество ev соответствует приблизительно 2 x ¹⁰⁹ частицам, измеренным анализом отслеживания наночастиц (данные не показаны). Белок OVA, смешанный с адъювантом (например, LPS), может применяться в качестве мощного вакцинно-положительного контроля.
   1. Наполните шприцы (размер иглы 26-30 г) 60 мкл разбавленных EV или PBS соответственно и сразу же положите на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе количество вводимых EV нормализуется до количества EV-высвобождающих опухолевых клеток для экспериментального рассмотрения как качественных, так и количественных эффектов оксалиплатина на биогенез EV опухолевых клеток. Для некоторых читателей нормализация до определенной концентрации произведенных электромобилей может лучше соответствовать их экспериментальной установке в зависимости от их научного вопроса.
3. Инокулируют EV или PBS подкожно в медиальный аспект бедра мышей и повторяют иммунизацию через 7 дней. Через четырнадцать дней после первого лечения приносят в жертву мышей, например, при вывихе шейки матки, чтобы проанализировать иммунный ответ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с местными стандартами могут использоваться альтернативные пути подкожной инъекции.

3. Анализ проточной цитометрии селезеночных Т-клеток

1. Приготовьте и охладите полный RPMI (cRPMI), дополняя RPMI-1640 FCS (10% v/v), пенициллином (100 ЕД/мл), стрептомицином (100 мкг/мл), L-глутамином (2 мМ) и β-меркаптоэтанолом (50 мкМ).
2. Отделить селезенку от вскрытой брюшной полости. Размять селезенку с помощью смоченного клеточного сетчатого фильтра 100 мкм и пластикового плунжера шприца и промыть селезеночные клетки в трубку объемом 50 мл с 5-10 мл cRPMI. Центрифугу при 400 х г в течение 5 мин при 4 °С и выбросьте супернатант.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите клетки на льду, когда это возможно. Чтобы проанализировать местный, а не селезеночный иммунный ответ, резецируют дренирующие подколенные и паховые лимфатические узлы, следуя тому же протоколу. В этом случае пропустите следующий этап лизиса эритроцитов.
3. Для удаления эритроцитов из клеточной суспензии повторно суспендируют гранулу 2 мл буфера лизиса эритроцитов (см. Таблицу материалов) и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем остановите реакцию, добавив cRPMI. Центрифугу при 400 х г в течение 5 мин при 4 °С и выбросьте супернатант.
4. Для посева повторно суспендируйте клеточную гранулу в cRPMI и подсчитайте клетки, чтобы поместить трипликаты из 200 000 клеток с 200 мкл cRPMI в каждую лунку, используя 96-луночную пластину с U-образным дном. Инкубировать в течение 48 ч при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для устранения антиген-специфичности активированных Т-клеток добавляют 1 мкг/мл растворимого овальбумина (или другого опухолевого антигена, соответствующего исследуемой клеточной линии) или оставляют без дополнительного стимула, соответственно. Добавление иммунодоминантного пептидного эпитопа SIINFEKL вместо полноразмерного овальбумина позволяет сократить инкубационный период. Помимо проточной цитометрии, сыворотка мышей и супернатант клеточной культуры после 48 ч инкубации могут быть проанализированы на наличие различных цитокинов.
5. Через 48 ч, чтобы усилить внутриклеточное окрашивание IFN-γ путем, в частности, блокирования опосредованной Гольджи секреции белков, добавляют в культуру клеток брефельдин А (5 нг/мл), ПМА (20 нг/мл) и иономицин (1 мкг/мл). Инкубировать в течение 4 ч при 37 °C.
6. Перед окрашиванием поверхностных биомаркеров перенесите спленоциты на 96-луночную пластину с V-образным дном и дважды промыть PBS. Затем добавляют флуоресцентные антитела, совместимые с локально доступным проточным цитометром, направленные против поверхностных биомаркеров, CD3, CD8 и CD4 (см. Таблицу материалов), разбавленные 1:400, плюс поправимый краситель жизнеспособности, разбавленный 1:1000 в PBS. Повторно суспендировать гранулированные спленоциты в окрашивающем растворе и инкубировать в течение 30 мин при 4 °С, защищенные от света.
7. Для фиксации и пермеабилизации спленоцитов дважды промыть в FACS-буфере (PBS плюс 3% v/v FCS), а затем повторно суспендировать в 100 мкл буфера фиксации/пермеабилизации (см. Таблицу материалов) на лунку. Инкубировать в течение 30 мин при 4 °C, защищенные от света.
8. Для окрашивания внутриклеточных IFN-γ промыть спленоциты в буфере фиксации/пермеабилизации и повторно суспендировать флуоресцентными антителами против IFN-γ, разбавленным 1:200 в буфере. Инкубировать в течение не менее 1 ч (максимум до 12 ч) при 4 °C, защищенных от света.
9. Перед измерением образцов методом проточной цитометрии дважды промывают спленоциты в буфере фиксации/пермеабилизации и повторно суспендируют в FACS-буфере. Проанализируйте активацию цитотоксических Т-клеток в соответствии со стратегией гастинга, показанной на рисунке 2.
   1. Во-первых, чтобы обнаружить одиночные клетки, промокните FSC-H против FSC-A. Затем, чтобы обнаружить лимфоидные клетки, промокните SSC против FSC-A. Впоследствии отбирают ^живые CD3+, CD4^-, CD8⁺ клетки и определяют их IFN-γ-продуцирующее подмножество для количественной оценки активации цитотоксических Т-клеток в селезенке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Включить флуоресцентное пятно минус один (FMO) со всеми фторхромами, за исключением флуорохрома, направленного против IFN-γ в качестве отрицательного технического контроля.

Results

Этот протокол предназначен для облегчения простой и легко воспроизводимой оценки иммуногенности ЭВ, полученных из опухоли. Таким образом, мышей прививают EV, полученными из культур опухолевых клеток in vitro , экспрессирующих модельный антиген куриного овальбумина (OVA). Последующий иммунный ответ анализируется в селезеночных Т-клетках с помощью проточной цитометрии.

На рисунке 1 представлен обзор практических шагов всего протокола. Поскольку раб...

Discussion

Этот протокол обеспечивает иммунологическую оценку in vivo EV, полученных из клеток меланомы при стрессе, вызванном химиотерапией, при адаптации к EV, испускаемым различными видами рака при различных методах лечения. Например, иммунизация мышей EV, полученными из клеток B16-OVA, обработанных оксалиплатином, расширяет IFN-γ-продуцирующие CD8 ⁺ Т-клетки в селезенке, которые дополнительно стимулируются инкубацией ex vivo с овальбумином, что указывает на опухолеспецифический иммунный ответ. Таким...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Клон 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Клон GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Клон 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Клон XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Клеточный фильтр, 100 &; m	Greiner	542000	EASYstrainer 100 & m
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Модифицированная орлиная среда Дульбекко с D-глюкозой (4,5 г/л) и L-глютамином (4 мМ)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Фетальная сыворотка теленка (FCS)
Корректируемая жизнеспособность красителя eFluor 506	eBioscience, подразделение Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Концентрат фиксации/пермеабилизации	eBioscience	00-5123-43	Концентрат фиксации/пермеабилизации (10x)
Разбавитель фиксации/пермеабилизации	eBioscience	00-5223-56
Иономицин	Sigma-Aldrich	407952	из Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (ВЭЖХ)
L-глутамин	Gibco	25030-032	L-глутамин (200 мМ)
Овальбумин	InvivoGen	vac-pova	Овальбумин с эндотоксином < 1 EU/mg - CAS 9006-59-1
Оксалиплатин	Аптека больницы
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Фосфат буферизованный физиологический раствор без хлорида кальция и хлорида магния
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	1514-122	Смесь пенициллина (10 000 ЕД/мл) и стрептомицина (10 000 мкг/мл)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-миристат 13-ацетат, &ge 99% (ВЭЖХ)
PVDF фильтр, 0,22 &; m, для шприцев	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filter Unit 0.22 µ m Durapore PVDF Мембранный
буфер для лизиса эритроцитов	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Среда с D-глюкозой (2,00 г/л) и L-глутамином (300 мг/л), без
шприца HEPES, 26 г	BD Biosciences	305501	1 мл Sub-Q Шприцы с иглой (0,45 мм x 12,7 мм)
Общий реагент для выделения экзосом	Invitrogen	4478359	Для выделения из питательных сред клеточных культур
β -меркаптоэтанол	Thermo Fischer Scientific	31350	β -меркаптоэтанол (50 мМ)