Светоиндуцированная экспрессия GFP у эмбрионов рыбок данио с использованием оптогенетической системы TAEL/C120

Jesselynn LaBelle; Stephanie Woo

doi:10.3791/62818

Method Article

Светоиндуцированная экспрессия GFP у эмбрионов рыбок данио с использованием оптогенетической системы TAEL/C120

DOI:

10.3791/62818

⸱

August 19th, 2021

Jesselynn LaBelle¹ , Stephanie Woo¹

¹Department of Molecular Cell Biology, University of California

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптогенетика является мощным инструментом с широким спектром применения. Этот протокол демонстрирует, как достичь индуцируемой светом экспрессии генов у эмбрионов рыбок данио с использованием системы TAEL/C120, реагирующей на синий свет.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Индуцируемые системы экспрессии генов являются бесценным инструментом для изучения биологических процессов. Оптогенетические системы экспрессии могут обеспечить точный контроль над временем экспрессии генов, местоположением и амплитудой, используя свет в качестве индуцированного агента. В этом протоколе оптогенетическая система экспрессии используется для достижения светоиндуцируемой экспрессии генов у эмбрионов рыбок данио. Эта система опирается на инженерный фактор транскрипции под названием TAEL, основанный на естественном светоактивированном факторе транскрипции от бактерии E. litoralis. При освещении синим светом TAEL димеризуется, связывается со своим родственным регуляторным элементом, называемым C120, и активирует транскрипцию. Этот протокол использует трансгенные эмбрионы рыбок данио, которые экспрессируют фактор транскрипции TAEL под контролем вездесущего промотора ubb. В то же время регуляторный элемент C120 управляет экспрессией флуоресцентного репортерного гена (GFP). Используя простую светодиодную панель для подачи активирующего синего света, индукция экспрессии GFP может быть сначала обнаружена после 30 минут освещения и достигает пика более чем 130-кратной индукции после 3 ч световой обработки. Индукция экспрессии может быть оценена с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) и флуоресцентной микроскопии. Этот метод является универсальным и простым в использовании подходом к экспрессии оптогенетических генов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Индуцируемые системы экспрессии генов помогают контролировать количество, время и местоположение экспрессии генов. Однако достижение точного пространственного и временного контроля в многоклеточных организмах было сложной задачей. Временное управление чаще всего достигается путем добавления маломолекулярных соединений¹ или активации промоутеров теплового шока^2. Тем не менее, оба подхода уязвимы для вопросов времени, силы индукции и нецелевых стрессовых реакций. Пространственный контроль в основном достигается за счет использования тканеспецифических промоторов^3,но такой подход требует подходящего ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было проведено с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Калифорнийского университета в Мерседе.

1. Скрещивание рыбок данио и сбор эмбрионов

Поддерживайте отдельные трансгенные линии рыбок данио, содержащие либо транскрипционный активатор TAEL, либо контролируемый C120 репортерный ген, чтобы свести к минимуму ложную активацию.
Скрещивать 6-8 взрослых рыбок данио с каждой линии, используя стандартные методы^9, для получения двойных трансгенных эмбрионов, которые содержат как компоненты TAEL, так и C120(рисунок 1B).<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для этой демонстрации реагирующая на C120 репортерная линия GFP(Tg(C120F:GFP)^ucm107)была скрещена трансгенной линией, которая повсеместно экспрессирует TAEL-N из промотора ubiquitin b (ubb)(Tg(ubb:TAEL-N)^ucm113))для получения двойных трансгенных эмбрионов, содержащих оба элемента. Через 24 ч после оплодотворения эмбрионы подвергались воздействию активации синего света, пульсирующего с частотой 1 ч вкл/1 ч выключения. Индукцию экспрессии GFP количественно оценивали.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает использование оптогенетической системы TAEL/C120 для достижения экспрессии генов, индуцируемой синим светом. Эта система состоит из транскрипционного активатора TAEL, который димеризуется при освещении синим светом и активирует транскрипцию интересующего гена после регуляторного элемента C120. Индуцированная экспрессия репортера GFP может быть обнаружена всего через 30 минут светового воздействия, что говорит о том, что этот подход обладает относительно быстрой и отзывчивой кинетикой.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Никаких конфликтов интересов объявлено не было.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Стефана Матерну и членов лабораторий Woo и Materna за полезные предложения и комментарии по этому протоколу. Мы благодарим Анну Рид, Кевина Гарднера и Лору Мотта-Мена за ценную дискуссию и понимание при разработке этого протокола. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH; R03 DK106358) и Координационный комитет по исследованию рака Калифорнийского университета (CRN-20-636896) в S.W.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
BioRender веб-инструмент для научных иллюстраций	BioRender		https://biorender.com/
цветная ПЗС-цифровая камера	Lumenara	755-107
Компактная консоль измерителя мощности и энергии, цифровой 4" ЖК-дисплей	Thorlabs	PM100D
Возбуждающий фильтр, 545 нм	Olympus	ET545/25x
illustra RNAspin Mini kit GE	Здравоохранение	95017-491
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
MARS AQUA Dimmable 165 Вт Светодиодный светильник для аквариума (синий и белый)	Amazon	B017GWDF7E
Метилцеллюлоза	Sigma-Aldrich	M7140
NEARPOW Программируемый цифровой таймер	Amazon	B01G6O28NA
PerfeCTa SYBR зеленый быстрый микс	Quantabio	101414-286
Photoshop Программное обеспечение
Adobe Prism Программное обеспечение для построения графиков и статистики	GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMix	Quantabio	10142-786
QuantStudio 3 Система для ПЦР в реальном времени	Applied Biosystems	A28137
Стереомикроскоп	Olympus	SZX16
Трикаин (этил3-аминобензоат метансульфонат)	Sigma-Aldrich	E10521
X-Cite 120 Флуоресцентный светодиодный источник света	Excelitas	010-00326R	Снят с производства. Он был заменен на X-Cite mini+

для обработки изображений

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
Halloran, M. C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Светоиндуцированная экспрессия GFP у эмбрионов рыбок данио с использованием оптогенетической системы TAEL/C120

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles